三维共培养模型用于肿瘤-间质相互作用研究

摘要

本文介绍一种三维共培养方案，可用于研究多细胞相互作用以及细胞外基质对癌细胞行为的调控作用。在此实验模型中，将癌细胞培养在嵌有人大肠癌相关成纤维细胞的胶原凝胶上。

摘要

癌症的发生（起始、生长、侵袭和转移）是通过恶性细胞与周围肿瘤间质细胞相互作用而实现的。肿瘤微环境由多种细胞类型组成，例如成纤维细胞、免疫细胞、血管内皮细胞、周细胞以及骨髓来源的细胞，这些细胞嵌入在细胞外基质（ECM）中。癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过分泌可溶性因子、促进血管生成以及重塑ECM，在肿瘤发生过程中发挥促瘤作用。目前针对癌细胞存活、增殖、迁移和侵袭的实验模型，主要依赖于二维的单细胞或单层组织培养，或Boyden小室实验。然而，这些实验并不能精确反映病变器官中的生理或病理条件。为了更深入地理解肿瘤间质或肿瘤基质之间的相互作用，多细胞和三维培养体系为研究细胞间通讯以及细胞外基质对癌细胞行为的依赖性调控提供了更强大的工具。作为此类研究的平台，我们提出一种实验模型，即在嵌有原代培养的CAFs的胶原凝胶上共培养癌细胞。

引言

癌组织可被视为一种器官，其演化过程依赖于癌细胞与肿瘤间质微环境之间的密切相互作用，后者由癌症相关成纤维细胞（CAFs）、免疫细胞、肿瘤血管以及细胞外基质（ECM）构成。CAFs 是多种可溶性因子（如细胞因子、生长因子和趋化因子）的主要来源，这些因子对癌细胞具有促有丝分裂、促迁移和促侵袭的作用。此外，CAFs 还能促进肿瘤血管生成，并募集骨髓来源细胞（BMDC）等前体细胞。活化的 CAFs 参与 ECM 的合成与重塑，从而促进癌细胞的生长与扩散¹。CAFs 还可形成有利于肿瘤细胞定植和转移的微环境，并能够将干细胞样表型赋予邻近的癌细胞。病理学观察表明，癌组织中的间质反应或纤维化改变提示预后不良。近期研究还发现，肿瘤间质特征（如基因表达谱）可用于预测患者的预后。此外，CAFs 分泌的因子可调节肿瘤对化疗的敏感性，凸显了 CAFs 在决定药物敏感性与耐药性中的关键作用²。

由于癌症相关成纤维细胞（CAFs）通过介导CAFs与肿瘤微环境中不同类型细胞之间相互作用的信号通路，在促进肿瘤进展中发挥多重作用，因此它们作为癌症治疗的新靶点正受到越来越多的关注。癌症微环境中细胞群体的异质性为靶向CAFs带来了挑战。已有若干CAFs的标志物被提出，例如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）、成纤维细胞活化蛋白（FAP）和成纤维细胞特异性蛋白-1（FSP-1：也称为S100A4）；然而，这些分子标志物并不能特异性地区分CAFs与非癌组织中存在的其他细胞

方案

注意：本研究已获得相应伦理委员会的批准。

1. 人肺成纤维细胞的原代培养

1. 肺组织的采集：
   1. 直接从外科手术室获取人肺组织样本。从癌变和非癌变肺组织中分别采集约 1 cm³ 的组织块，非癌变组织样本应尽可能远离肿瘤部位采集。
   2. 将组织样本悬浮于添加了 100 单位/ml 青霉素、100 μg/ml 链霉素和 0.25 μg/ml 两性霉素 B 的杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中（无血清培养基）。将悬浮的样本置于无菌的 50 ml 离心管中，并转移至实验室。
      注：成纤维细胞相较于上皮细胞、内皮细胞和平滑肌细胞等其他细胞类型具有更强的迁移性和增殖能力。组织块外翻法正是利用了成纤维细胞的这些特性，从组织切片中长出的细胞以成纤维细胞为主。经过数次传代后，其他类型的细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中无法存活和扩增，从而获得纯化的成纤维细胞培养物。细胞可在原代培养后第 3–7 代使用。
2. 组织块培养及细胞外翻的准备：
   1. 采用先前报道的方法并加以改进进行成纤维细胞的原代培养⁵。
   2. 在实验室中，将组织样本置于 10 cm 组织培养皿中，不加培养基，使用无菌镊子和手术刀将其切成约 2–3 mm 大小的小块。操作过程中应避免组织干燥，否则将影响细胞外翻的效率....

结果

这种共培养方法通过模拟肿瘤微环境，成为研究癌细胞与嵌入胶原凝胶中的成纤维细胞之间相互作用的有效工具。在先前的研究中，该实验模型评估了三个参数：胶原凝胶收缩、癌细胞侵袭以及形态学变化。同时通过Ki67免疫染色法估测癌细胞的增殖情况⁴。肺组织样本取自切除肺叶中的癌变区域和非癌变区域（图1A）。将样本切碎成小块，并在添加10%胎牛血清（FBS）的DMEM培养基中进行培养（图1B）。在显微镜下观察从组织块中迁移生长出的成纤维细胞（图1C）。将原代培养的肺成纤维细胞嵌入胶原凝胶中（图2A, a），并在凝胶上共培养A549肺癌细胞（图2A, b）。在培养基中进行漂浮培养后（图2A, c），将凝胶进一步置于气-液界面条件下继续培养（图2A, d）。随后用福尔马林固定凝胶，用于免疫组织化学分析（图2A, e）。对于气-液界面培养，将凝胶置于6孔板中一个网格支架上（.......

讨论

CAFs 构成癌细胞周围细胞外基质（ECM）的主要部分，不仅为肿瘤提供结构支架，还积极参与肿瘤的发展⁷。越来越多的证据揭示了 CAFs 或其相关分子对最终预后的影响，凸显了 CAF 介导的肿瘤进展的关键作用⁸。

在之前的研究中，我们采用组织块法分离肺部CAFs⁴。在本实验中，维持组织切片与培养皿表面的黏附至关重要。若组织切片漂浮于培养基中，则细胞无法从组织中迁移出来；一旦组织切片脱离表面，便无法在同一培养皿上继续用于细胞外生长。切割组织时产生的渗出物可作为黏附于培养皿表面的“胶水”。使用盖玻片固定组织切片时，所用封固剂的量也十分关键：用量过少会导致盖玻片无法固定，而用量过多则会遮蔽细胞培养区域。利用盖玻片并施加适当压力固定组织切片，是促进细胞外生长的关键步骤。

目前，癌细胞增殖和侵袭的实验模型主要依赖于二维单层组织培养或Boyden小室实验。为了更深入地理解细胞间通讯以及细胞外基质（ECM）对癌细胞行为的调控作用，三维共培养是一种强有力的工具。类器官培养也有助于.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	Sigma-Aldrich	D5796
FBS	GIBCO	10437
Ⅰ型胶原蛋白A	Nitta gelatin Inc.	CELL-1A
重悬缓冲液	Nitta gelatin Inc.
盖玻片	NUNC	174934
硅脂	Dow Corning Toray	高真空润滑脂
Dispase I	WAKO	386-02271
6孔板	BD Falcon	353046
细胞筛（70 μm）	BD Falcon	352350