从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

摘要

帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外 神经退行性变的建模。

摘要

中脑多巴胺能（mesDA）神经元的退化是帕金森病的病理特征。研究这些神经元生理功能及其易损性和死亡所涉及的生物学过程，对于理解这种常见神经退行性疾病的病因并揭示其治疗方法至关重要。原代培养的mesDA神经元为研究其分子、生化和电生理特性提供了工具，有助于理解这些神经元在疾病过程中发育、长期存活及退化的机制。本文介绍了一种从E12.5小鼠（或E14.5大鼠）胚胎中分离、培养和维持中脑多巴胺能神经元的详细方法。本方案优化的细胞培养条件可使神经元形成轴突和树突突起、建立突触连接及其他神经元形态学特征，从而使该培养体系适用于研究此类神经元群体的生理学、细胞生物学和分子特性。

引言

黑质致密部多巴胺能神经元的丢失导致帕金森病（PD）的主要运动症状，帕金森病是第二常见的神经退行性疾病。目前尚不清楚这一中脑神经元群体死亡的根本原因。为了研究负责中脑多巴胺能（mesDA）神经元发育、调节其神经生理特性及存活的生化通路，已采用多种细胞培养和动物模型系统。已用于生化及有限机制研究的永生化细胞系包括：大鼠多巴胺能细胞系1RB₃AN₂₇（N27）、人类多巴胺能神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、小鼠多巴胺能杂交细胞系MN9D以及人类中脑LUHMES细胞^1-5。为研究mesDA神经元的特异性丢失，已开发出多种基于神经毒素和遗传因素的模型^6-8。原代腹侧中脑培养物为研究多巴胺能神经元的神经元和突触特性，以及这一常见疾病发病机制中涉及的通路提供了不可或缺的工具。

本文介绍了一种分离中脑多巴胺能神经元的详细方案，其中包含若干改进措施，可显著提高细胞存活率，并增加每个胚胎所能获得的盖玻片数量。采用发育早期的E12.5小鼠中脑（大鼠为E14.5）有助于提高细胞存活率。在此阶段，神经元尚未长出轴突，因此在解剖过程中细胞结构保持完整，显著减少了机械损伤带来的应激，从而大幅提高细胞活力。此外，如本方案第2节所述，对腹侧中脑进行精细解剖可进一步提升细胞存活率。为了增加每个胚胎所能制备的盖玻片数量，本方案在第4节中介绍了一种替代性的接种方法。该方法可使每个胚胎获得多达10个盖玻片，而标准接种条件下仅能获得....

方案

注意：动物的饲养和操作均遵循机构指南，所有动物实验程序均经帝国理工学院动物福利与伦理审查委员会（AWERB）、英国内政部以及哈佛大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合联邦和州级法规要求。

1. 试剂与仪器准备

1. 在 –80 ºC 下解冻、分装并储存 1 mg/ml 层粘连蛋白（Laminin）溶液。将 2 µl 溶解于 1 ml DMEM/F12 中，得到 1–2 µg/cm² 的包被浓度。
   注意：应在冰上缓慢解冻层粘连蛋白，并用预冷的 DMEM/F12 溶解后立即加入培养板或盖玻片中。
2. 将 75 ml 的 0.01% 多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-ornithine）溶液用 425 ml PBS 稀释，4 ºC 保存。
   注意：工作液的有效期最长为一个月。
3. 将 25%（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA）溶于 PBS（pH 7.4）中，4 ºC 保存，最长可保存一年。
4. 制备含 50% FBS（HBSS 中）的灭活培养基。
5. 向 DMEM/F12 中加入 50 U/ml 青霉素和链霉素、1× N2 添加剂、5%（vol/vol）FBS、0.36% D-(+)-葡萄糖（wt/vol）、0.25% BSA（wt/vol），配制成完全培养基，4 ºC 保存。
   注意：该培养基有效期最长为 10 天。....

结果

酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, Th）的免疫组织化学染色显示，培养物中约有0.5%-1%的细胞为多巴胺能神经元。神经元突起在接种后2小时内开始出现，至第一天时，轴突和树突已可清晰分辨（图2），该结果通过酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白2（Microtubule-Associated Protein 2, Map2）抗体染色证实（图3）。这些神经元可存活六周以上，并表现出广泛的突起生长。培养物中的神经元-胶质细胞比例与培养基中血清浓度直接相关，这与先前研究结果一致。尽管从培养体系中去除胎牛血清（FBS）可能获得相对纯化的神经元培养物，但我们及其他研究者发现，添加血清可提高多巴胺能神经元在体外培养中的存活率⁹。

讨论

中脑中的多巴胺能神经元是中枢神经系统中多巴胺的主要来源。这些神经元可分为三组：黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）、腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）和红核后区（retrorubral field, RRF）¹⁰,¹¹。SNpc和VTA中的神经元形成了主要的多巴胺能通路，包括中脑皮层通路、中脑边缘通路和黑质纹状体通路，参与调控情绪、动机和运动行为等功能。SNpc中神经元的死亡以及黑质纹状体系统的功能障碍是第二常见的神经退行性疾病——帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的主要病理特征^12,13。目前的治疗方法仅针对疾病症状，无法阻止或减缓神经元的退化过程，而这种缓慢、进行性细胞丢失的根本原因至今仍不清楚^14-16。因此，建立用于研究该神经元群体发育、生化及生理特性的体内（in vivo）和体外（in vitro）技术，对于阐明帕金森病的病因以及开发新的治疗策略至关重要。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F-12 营养混合物）	Invitrogen	11330
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）(1X)，液体	Invitrogen	24020-117
胎牛血清，热灭活（FBS）	Invitrogen	16140
N2 补充剂（100X），液体	Invitrogen	17502-048
D-(+)-葡萄糖溶液（水中 45% (wt/vol)）	Sigma	G8769
牛血清白蛋白 BSA	Sigma	A9430
来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白（Laminin）	Sigma	L2020
青霉素/链霉素	Invitrogen	15070
胰蛋白酶（0.05% (wt/vol)）	Invitrogen	25300
经细胞培养验证的牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A9418
磷酸盐缓冲液（PBS）	Sigma	P3813
抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体	Pel-Freez Biologicals	P60101-0
多聚-L-鸟氨酸，0.01% 溶液	Sigma	P4957
抗微管相关蛋白-2A 和 -2B（Map2）抗体	Millipore	MAB3418
抗突触素-1 抗体	Millipore	AB1543P
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG   抗体	Molecular Probes	A-21206
Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG   抗体	Molecular Probes	A-21207
Alexa Fluor 488 驴抗绵羊 IgG   抗体	Molecular Probes	A-11015
Alexa Fluor 594 驴抗绵羊 IgG   抗体	Molecular Probes	A-11016
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG   抗体	Molecular Probes	A-21203
台盼蓝溶液（0.4% (wt/vol)）	Biowhittaker	17-942E
体视显微镜	Carl Zeiss	Stemi 2000-C
倒置相差显微镜	Carl Zeiss	Axiovert 40 C
Dumont 镊子	Fine Scientific Tools	May-45
盖玻片镊子 – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11251-33
两把 Dumont #45 镊子 – Dumoxel	Fine Scientific Tools	11245-30
刀片夹持器/折断器，平握式 - 11cm	Fine Scientific Tools	10052-11
学生用虹膜剪刀 - 直头 11.5 cm	Fine Scientific Tools	91460-11
光纤卤素光源照明器	Nikon	MKII
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管	Fisherbrand	13-678-20C
血细胞计数板	Proscitech	SVZ2NIOU
0.2 µm 无菌滤器	Nalgene	NL-CE-156-4020
100×20 mm 培养皿	BD Biosciences	351005
圆形盖玻片 #1 厚度，德国玻璃，直径 12 mm	Bellco Glass	1943-10012