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从胚胎啮齿类动物脑组织中分离、培养及长期维持原代中脑多巴胺能神经元

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DOI：

10.3791/52475

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2015年2月19日

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1Division of Brain Sciences, Department of Medicine, Imperial College London, 2Department of Neurosurgery, Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School, 3Department of Internal Medicine, Endocrinology, Yale University School of Medicine

本文内容

摘要

帕金森病期间中脑多巴胺能神经元退化的原因尚未完全明确。细胞培养系统为研究这些神经元的神经生理特性提供了重要工具。本文介绍了一种优化的方案，可用于 体外 神经退行性变的建模。

摘要

中脑多巴胺能（mesDA）神经元的退化是帕金森病的病理特征。研究这些神经元生理功能及其易损性和死亡所涉及的生物学过程，对于理解这种常见神经退行性疾病的病因并揭示其治疗方法至关重要。原代培养的mesDA神经元为研究其分子、生化和电生理特性提供了工具，有助于理解这些神经元在疾病过程中发育、长期存活及退化的机制。本文介绍了一种从E12.5小鼠（或E14.5大鼠）胚胎中分离、培养和维持中脑多巴胺能神经元的详细方法。本方案优化的细胞培养条件可使神经元形成轴突和树突突起、建立突触连接及其他神经元形态学特征，从而使该培养体系适用于研究此类神经元群体的生理学、细胞生物学和分子特性。

引言

黑质致密部多巴胺能神经元的丢失导致帕金森病（PD）的主要运动症状，帕金森病是第二常见的神经退行性疾病。目前尚不清楚这一中脑神经元群体死亡的根本原因。为了研究负责中脑多巴胺能（mesDA）神经元发育、调节其神经生理特性及存活的生化通路，已采用多种细胞培养和动物模型系统。已用于生化及有限机制研究的永生化细胞系包括：大鼠多巴胺能细胞系1RB3AN27（N27）、人类多巴胺能神经母细胞瘤细胞系SH-SY5Y、小鼠多巴胺能杂交细胞系MN9D以及人类中脑LUHMES细胞1-5。为研究mesDA神经元的特异性丢失，已开发出多种基于神经毒素和遗传因素的模型6-8。原代腹侧中脑培养物为研究多巴胺能神经元的神经元和突触特性，以及这一常见疾病发病机制中涉及的通路提供了不可或缺的工具。

本文介绍了一种分离中脑多巴胺能神经元的详细方案，其中包含若干改进措施，可显著提高细胞存活率，并增加每个胚胎所能获得的盖玻片数量。采用发育早期的E12.5小鼠中脑（大鼠为E14.5）有助于提高细胞存活率。在此阶段，神经元尚未长出轴突，因此在解剖过程中细胞结构保持完整，显著减少了机械损伤带来的应激，从而大幅提高细胞活力。此外，如本方案第2节所述，对腹侧中脑进行精细解剖可进一步提升细胞存活率。为了增加每个胚胎所能制备的盖玻片数量，本方案在第4节中介绍了一种替代性的接种方法。该方法可使每个胚胎获得多达10个盖玻片，而标准接种条件下仅能获得4个盖玻片，从而显著减少实验所需的动物数量。

培养的神经元表现出轴突和树突的生长，形成突触连接，并显示出神经元和突触标志物的存在，因此这类培养物适用于活细胞成像、免疫细胞化学和电生理学研究。此外，使用神经元培养便于进行遗传学和药理学操作。自第2天起神经突的生长 体外 可用于发育研究。此外，培养物的长期存活（长达六周）使其适用于研究这些神经元的缓慢进行性变性。

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方案

注意：动物的饲养和操作均遵循机构指南，所有动物实验程序均经帝国理工学院动物福利与伦理审查委员会（AWERB）、英国内政部以及哈佛大学机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准，符合联邦和州级法规要求。

1. 试剂与仪器准备

  1. 在 –80 ºC 下解冻、分装并储存 1 mg/ml 层粘连蛋白（Laminin）溶液。将 2 µl 溶解于 1 ml DMEM/F12 中，得到 1–2 µg/cm2 的包被浓度。
    注意：应在冰上缓慢解冻层粘连蛋白，并用预冷的 DMEM/F12 溶解后立即加入培养板或盖玻片中。
  2. 将 75 ml 的 0.01% 多聚-L-鸟氨酸（Poly-L-ornithine）溶液用 425 ml PBS 稀释，4 ºC 保存。
    注意：工作液的有效期最长为一个月。
  3. 将 25%（wt/vol）牛血清白蛋白（BSA）溶于 PBS（pH 7.4）中，4 ºC 保存，最长可保存一年。
  4. 制备含 50% FBS（HBSS 中）的灭活培养基。
  5. 向 DMEM/F12 中加入 50 U/ml 青霉素和链霉素、1× N2 添加剂、5%（vol/vol）FBS、0.36% D-(+)-葡萄糖（wt/vol）、0.25% BSA（wt/vol），配制成完全培养基，4 ºC 保存。
    注意：该培养基有效期最长为 10 天。
  6. 将盖玻片置于煮沸的 70%（vol/vol）乙醇中至少 30 分钟，以去除任何油脂残留，随后进行高压灭菌。
  7. 将盖玻片放入 24 孔板中，每孔加入 500 µl 多聚-L-鸟氨酸溶液，在室温下于超净台中孵育 1 小时，然后用 500 µl 水洗涤 3 次。每孔加入 500 µl 层粘连蛋白溶液，在 37 ºC 湿润的组织培养箱中过夜孵育。
    注意：层粘连蛋白处理后无需洗涤，但若多聚-L-鸟氨酸洗涤少于三次，则细胞在培养 24 小时后会死亡。
  8. 用天然气或火焰对玻璃移液管尖端进行抛光。
    注意：此步骤后，移液管尖端直径应约为原始大小的一半。
  9. 使用已灭菌的剪刀剪去 1.5 ml 微离心管的管帽，并进行高压灭菌。

2. 胚胎腹侧中脑的解剖

  1. 通过吸入 CO2 使妊娠特定时间（E12.5）的母鼠麻醉，随后通过颈椎脱位实施安乐死。
  2. 用 70% 乙醇喷洒腹部，做腹部切口直至暴露所有子宫囊。用镊子切断阴道连接处并取出子宫，将子宫置于冰上预冷的 HBSS 中，放入 100 mm 培养皿内。
  3. 使用镊子从子宫和羊膜囊中取出胚胎（图 1C），并将胚胎放入新鲜的冰上预冷的 HBSS 中。
    注意：图 1D 中的矩形框标示了胚胎腹侧中脑的位置。
  4. 将胚胎置于解剖显微镜（10 倍放大）下，使用显微剪刀和镊子在峡部及中脑-间脑边界区域剪切脑组织，分离出中脑弓（图 1E，切口位置请参见 图 1A）。
  5. 取出整个中脑后，在中背侧中脑区域进行一次切口（图 1F）。
  6. 使用两把镊子去除脑膜（图 1H）。
    注意：关键步骤：此步骤对获得最佳神经元产量和存活率至关重要。由于培养条件最适合脑细胞生长，周围组织来源的细胞在接种后大多会死亡，而这些组织释放的凋亡信号可能破坏培养物的完整性。
  7. 将中脑组织在培养皿中展平以观察其蝴蝶形状，然后使用无菌剃刀刀片切下每侧“翅膀”约一半的部分（图 1H,I）。
    注意：图 1J 显示了分离出的腹侧中脑。
  8. 将腹侧中脑组织块转移至含有冰上预冷 HBSS 的 15 ml 锥形管中，并继续处理下一个胚胎。
    注意：步骤 2.1–2.8 不应超过 1 小时。若胚胎在冰上存放超过此时间，细胞活力将显著下降。

3. 腹侧中脑细胞的解离

  1. 在超净工作台中将腹侧中脑组织块转移至容器中。吸除HBSS，加入1 ml预热（37 ºC）的0.05%胰蛋白酶-EDTA溶液（适用于最多12块腹侧中脑组织）。将组织在37 ºC下孵育5-10分钟。
  2. 在超净台中移除胰蛋白酶-EDTA溶液，并向组织中加入1 ml去活化培养基（血清可使胰蛋白酶失活）。
  3. 移除去活化培养基，并用1 ml完全培养基清洗组织两次。
    注意：避免将管中所有培养基完全吸除或用移液器吸取组织，以防丢失已解离的细胞。
  4. 加入1 ml完全培养基，使用火焰抛光的玻璃移液管吹打组织。避免产生气泡，持续吹打直至获得单细胞悬液。
    注意：通常需要经过限制性尖端吹打8-10次才能实现完全解离。
  5. 在室温下以400 × g离心5分钟，然后移除上清液。
  6. 通过缓慢吹打上下混合最多四次，将细胞沉淀重悬于1 ml完全培养基中。

4. 接种腹侧中脑细胞

  1. 取10 µl细胞悬液与90 µl台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板计数细胞数量。
    注意：此步骤可同时检测细胞活力。
  2. 将灭菌的微量离心管盖放入100 mm培养皿中，用镊子将预先包被多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白的盖玻片逐个转移至管盖上方。
    注意：切勿清洗盖玻片，避免层粘连蛋白干燥，否则可能导致细胞培养分布不均并降低细胞存活率。
  3. 加入完全培养基，调整细胞悬液至每1 µl含1,500个细胞，然后取100 µl（共150,000个细胞）滴加至每张盖玻片表面（该体积可充分覆盖盖玻片表面且不会溢出）。盖上培养皿，置于加湿的组织培养孵箱中孵育1小时（37 °C，5% CO2）。
    注意：关键步骤：此步骤有助于提高细胞贴壁率和存活率，并增加每个胚胎可获得的盖玻片数量。也可将细胞直接接种至孔板（内含盖玻片）中，但每孔细胞数量需增至350,000个（而非150,000个）。换言之，采用本方法可获得8–10张盖玻片，而直接接种法仅能获得约3–4张，因部分细胞会贴附于孔板表面（盖玻片周围或下方）。采用该方法时，细胞培养的平均存活率约为90%。

5. 培养物的培养与维持

  1. 孵育1小时后，小心地将载玻片连同培养基一起转移至含有400 µl预热至37 ºC的完全培养基（总体积：500 µl）的24孔板中。于37 ºC孵育过夜（O/N）。
  2. 在孔板孵育后的24小时内，轻轻向每个孔中加入500 µl完全培养基。
    注意：最初的几个小时是多巴胺能神经元存活最关键的阶段，此后存活细胞数量不再发生显著变化。
  3. 在培养的前两周内或直到培养基变黄之前，不要额外添加培养基。若培养超过两周或培养基颜色变为黄色，则更换一半培养基（500 µl）为新鲜的预热完全培养基（通常每两周一次）。
    注意：在此条件下，培养物中的多巴胺能神经元可存活超过6周。

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结果

酪氨酸羟化酶（Tyrosine hydroxylase, Th）的免疫组织化学染色显示，培养物中约有0.5%-1%的细胞为多巴胺能神经元。神经元突起在接种后2小时内开始出现，至第一天时，轴突和树突已可清晰分辨（图2），该结果通过酪氨酸羟化酶（TH）和微管相关蛋白2（Microtubule-Associated Protein 2, Map2）抗体染色证实（图3）。这些神经元可存活六周以上，并表现出广泛的突起生长。培养物中的神经元-胶质细胞比例与培养基中血清浓度直接相关，这与先前研究结果一致。尽管从培养体系中去除胎牛血清（FBS）可能获得相对纯化的神经元培养物，但我们及其他研究者发现，添加血清可提高多巴胺能神经元在体外培养中的存活率9。

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讨论

中脑中的多巴胺能神经元是中枢神经系统中多巴胺的主要来源。这些神经元可分为三组：黑质致密部（substantia nigra pars compacta, SNpc）、腹侧被盖区（ventral tegmental area, VTA）和红核后区（retrorubral field, RRF）10,11。SNpc和VTA中的神经元形成了主要的多巴胺能通路，包括中脑皮层通路、中脑边缘通路和黑质纹状体通路，参与调控情绪、动机和运动行为等功能。SNpc中神经元的死亡以及黑质纹状体系统的功能障碍是第二常见的神经退行性疾病——帕金森病（Parkinson’s disease, PD）的主要病理特征12,13。目前的治疗方法仅针对疾病症状，无法阻止或减缓神经元的退化过程，而这种缓慢、进行性细胞丢失的根本原因至今仍不清楚14-16。因此，建立用于研究该神经元群体发育、生化及生理特性的体内（in vivo）和体外（in vitro）技术，对于阐明帕金森病的病因以及开发新的治疗策略至关重要。

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致谢

本工作由伦敦帝国理工学院医学院脑科学系为 K.N.A. 提供的启动资金完成。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM/F12 培养基（Dulbecco 改良 Eagle 培养基 F-12 营养混合物）Invitrogen11330
汉克斯平衡盐溶液（HBSS）(1X)，液体Invitrogen24020-117
胎牛血清，热灭活（FBS）Invitrogen16140
N2 补充剂（100X），液体Invitrogen17502-048
D-(+)-葡萄糖溶液（水中 45% (wt/vol)）SigmaG8769
牛血清白蛋白 BSASigmaA9430
来自 Engelbreth-Holm-Swarm 小鼠肉瘤基底膜的层粘连蛋白（Laminin）SigmaL2020
青霉素/链霉素Invitrogen15070
胰蛋白酶（0.05% (wt/vol)）Invitrogen25300
经细胞培养验证的牛血清白蛋白（BSA）Sigma A9418
磷酸盐缓冲液（PBS）SigmaP3813
抗酪氨酸羟化酶（TH）抗体Pel-Freez BiologicalsP60101-0 
多聚-L-鸟氨酸，0.01% 溶液SigmaP4957
抗微管相关蛋白-2A 和 -2B（Map2）抗体MilliporeMAB3418
抗突触素-1 抗体MilliporeAB1543P
Alexa Fluor 488 驴抗兔 IgG   抗体Molecular ProbesA-21206
Alexa Fluor 594 驴抗兔 IgG   抗体Molecular ProbesA-21207
Alexa Fluor 488 驴抗绵羊 IgG   抗体Molecular ProbesA-11015
Alexa Fluor 594 驴抗绵羊 IgG   抗体Molecular ProbesA-11016
Alexa Fluor 594 驴抗小鼠 IgG   抗体Molecular ProbesA-21203
台盼蓝溶液（0.4% (wt/vol)）Biowhittaker17-942E
体视显微镜Carl ZeissStemi 2000-C
倒置相差显微镜Carl ZeissAxiovert 40 C
Dumont 镊子Fine Scientific ToolsMay-45
盖玻片镊子 – DumoxelFine Scientific Tools11251-33
两把 Dumont #45 镊子 – DumoxelFine Scientific Tools11245-30
刀片夹持器/折断器，平握式 - 11cmFine Scientific Tools10052-11
学生用虹膜剪刀 - 直头 11.5 cmFine Scientific Tools91460-11
光纤卤素光源照明器NikonMKII
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德移液管Fisherbrand13-678-20C
血细胞计数板ProscitechSVZ2NIOU
0.2 µm 无菌滤器NalgeneNL-CE-156-4020
100×20 mm 培养皿BD Biosciences351005
圆形盖玻片 #1 厚度，德国玻璃，直径 12 mmBellco Glass1943-10012 

参考文献

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