追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

摘要

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。

摘要

实时多光子成像为研究细胞迁移及细胞间相互作用在其生理性的三维环境中的动态过程提供了重要机遇。免疫细胞的生物学功能主要依赖于其运动能力。血液单核细胞在血液循环中的半衰期较短，它们起源于骨髓并持续从骨髓释放入血。在炎症状态下，该过程被增强，导致血液单核细胞增多，并继而浸润外周炎症组织。明确调控单核细胞从骨髓向血管网络迁移的生物力学事件，是理解单核细胞生理病理意义的重要步骤。我们进行了 体内 通过双光子显微镜对颅骨骨髓进行延时成像 Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP（MacBlue）小鼠。MacBlue小鼠在髓系特异性启动子的调控下表达增强型青色荧光蛋白（ECFP）荧光报告基因。 ¹结合血管网络标记，我们描述了该方法如何实现对单个骨髓单核细胞的实时追踪，从而进一步量化其在骨髓实质和血管系统中的迁移行为以及细胞间的相互作用。该方法为骨髓单核细胞亚群的生物学特性提供了新的见解，并有助于深入探究在特定病理条件下如何影响这些细胞的功能。

引言

骨髓在造血过程中起着核心作用，是单核细胞的主要储存库，这些单核细胞持续在血液与骨髓实质之间循环，不断更新寿命较短的循环单核细胞池^2,3，并参与稳态下组织巨噬细胞和树突状细胞的重建⁴。在炎症反应期间或短暂性再生障碍后，单核细胞会从骨髓或脾脏被主动动员^{5, 6, 7}，并定植于炎症器官。已有多个趋化因子轴被证实参与骨髓中髓系细胞的动员过程^{8, 5, 6,9}。除了髓系细胞外，骨髓也是T淋巴细胞启动活化的重要部位¹⁰，并构成免疫记忆的微环境^11,12。因此，该组织在血液学和免疫学领域的众多研究中具有核心地位。目前关于骨髓内髓系细胞结构组织的认识，主要来源于对固定组织切片的组织学分析¹³。这种静态观察无法研究骨髓不同区室之间的细胞交换动态，而后者正是其功能活动的基础。

活体成像为研究细胞迁移、细胞黏附以及细胞间相互作用提供了重要的生物学信息，这些过程以往仅通过体外（in vitro）系统进行描述。实现高质量活体成像的技术挑战主要包括：从光学角度能够有效到达目标组织，并最大程度地减少生理因素（如呼吸、肌肉或肠蠕动收缩）或机械漂移（如手术引起的组织扰动和延展、显微镜物镜接触以及温度和血管/氧合状态变化）对成像的干扰。微小的漂移可能限制长时间聚焦的稳定性，并在....

方案

注意：所有实验方案均已获得法国动物实验与伦理委员会批准，并由“动物健康与环境保护服务部”（编号 A-75-2065）审核通过。样本量的确定旨在确保实验的可重复性，并符合动物伦理法规中的“3R”原则。

1. 小鼠的准备

1. 麻醉
   1. 对于短时间成像（少于1小时），通过腹腔注射200 µl含有氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的生理盐水溶液对小鼠进行麻醉。
   2. 或者，对于较长时间的成像（长达4小时），通过适配的面罩吸入2.5%异氟烷，该气体由70/30的O₂/N₂O混合气体雾化产生，对小鼠进行麻醉。
   3. 注意：此方法可提供更稳定的无意识状态，并避免重复进行腹腔注射药物。
   4. 小鼠麻醉后，使用镊子刺激足垫以确认其是否失去知觉。
2. 血管染色/附加染色
   1. 进行血管染色时：通过尾静脉静脉注射200 µl罗丹明-葡聚糖（2 MDa，10 mg/ml溶于生理缓冲液中）。
   2. 进行中性粒细胞染色时：将2 µg Ly6G-PE（克隆1A8）溶于100 µl生理盐水溶液中，通过尾静脉静脉注射。
3. 固定
   1. 为实现固定，使用定制的立体定位支架，该支架需适配显微镜和麻醉气体吸入装....

结果

小鼠颅骨结构为通过活体成像研究骨髓生理学提供了良好机会。由于额顶区域的骨组织较薄，可无需磨除骨组织即可进入骨髓微环境。图1展示了一幅MacBlue转基因小鼠颅骨的宽视野二维图像。骨基质主要由胶原蛋白I组成，可通过二次谐波信号（SHG）清晰检测¹⁹。注射罗丹明标记的葡聚糖可使骨髓血管网络着色，从而识别位于骨基质与血管之间的实质骨髓微环境¹⁴。ECFP阳性细胞分布于骨髓的两个区室中，但在骨基质中不存在。单核细胞根据其在组织中的位置进行人工分类：当整个细胞位于血管系统内时，定义为血管内单核细胞，不考虑血管大小，仅排除较大的汇集性小静脉；当细胞位于血管系统与骨基质之间时，定义为实质单核细胞。

对特定感兴趣区域进行延时成像（补充视频1和2），可分别计算血管内（图2A）或实质内（图2B）单核细胞随时间变化的个体细胞运动轨迹。轨迹长度显示，实质内单核细胞的位移程度低于血管内单核细胞。对随时间变化的位移进行分析，可比较两个区室中单核细胞的平均速度（

讨论

关键点 体内 成像方法学的目标是确保焦距的稳定性，以最大限度延长成像持续时间，并尽量减少细菌污染和炎症的风险，这些因素可能影响炎性细胞的动态行为。颅骨骨髓的成像遵循上述原则，因为为获取骨髓而实施的手术创伤极小。使用无菌材料和消毒剂对于限制感染风险至关重要，因为感染可能干扰细胞稳态。

立体定位支架的开发可能具有挑战性，需要针对每个系统进行特定的定制（如显微镜物镜与电动载物台之间的距离、使用气体吸入麻醉装置等）。应尽可能使小鼠头部保持水平，以获得更广泛的成像表面访问。动物放置到位后，通常需要数分钟时间才能获得焦平面的良好稳定性。因此，建议在启动图像采集记录前检查组织是否发生漂移。由于此过程连同感兴趣区域的选择可能耗时较长，若使用了氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉，建议定期检查动物是否仍处于无意识状态，并检查物镜是否始终浸没在液体中，因为液体可能发生泄漏或蒸发。

橡胶环在颅骨上的良好定位是该过程中的另一个关键步骤。氰基丙烯酸酯胶水在稳定性和密封性方面效果良好，但需避免胶水过量，以免覆盖颅骨并阻碍对组织感兴趣区.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Merial		100 mg/ml，麻醉剂
赛拉嗪	Bayer HealthCare		10 mg/ml，麻醉剂
异氟烷	Baxter		2.5%，麻醉剂
O2/NO2			70/30 混合气体，麻醉剂
罗丹明-葡聚糖	Invitrogen		2 MDa，10 mg/ml，血管染色
Ly6G-PE	Becton-Dickinson		克隆株 1A8，中性粒细胞染色
立体定位固定装置	自制		手术
70% 乙醇			手术
无菌剪刀和镊子			手术
橡胶环			直径 18 mm，手术
Glubran 2	Queryo Medical		外科粘合剂，用于固定橡胶环
细针头	Terumo		手术
Zeiss LSM 710 NLO 多光子显微镜	Carl Zeiss		显微镜
Ti:蓝宝石晶体激光器	Coherent Chameleon Ultra		近红外光，140 飞秒脉冲
Zen 2010	Carl Zeiss		采集软件
Imaris Bitplane	Bitplane		分析软件，三维自动追踪
PBS 1X	D. Dutscher		手术
温控培养室	Carl Zeiss		活体成像