追踪小鼠骨髓单核细胞 体内

摘要

单核细胞是先天免疫的关键调节因子，在外周单核吞噬细胞系统的更新以及炎症发生时发挥重要作用。本文描述了对小鼠颅骨骨髓进行实时成像以研究单核细胞动员机制的实验步骤。

摘要

实时多光子成像为研究细胞迁移及细胞间相互作用在其生理性的三维环境中的动态过程提供了重要机遇。免疫细胞的生物学功能主要依赖于其运动能力。血液单核细胞在血液循环中的半衰期较短，它们起源于骨髓并持续从骨髓释放入血。在炎症状态下，该过程被增强，导致血液单核细胞增多，并继而浸润外周炎症组织。明确调控单核细胞从骨髓向血管网络迁移的生物力学事件，是理解单核细胞生理病理意义的重要步骤。我们进行了 体内 通过双光子显微镜对颅骨骨髓进行延时成像 Csf1r-Gal4VP16/UAS-ECFP（MacBlue）小鼠。MacBlue小鼠在髓系特异性启动子的调控下表达增强型青色荧光蛋白（ECFP）荧光报告基因。 ¹结合血管网络标记，我们描述了该方法如何实现对单个骨髓单核细胞的实时追踪，从而进一步量化其在骨髓实质和血管系统中的迁移行为以及细胞间的相互作用。该方法为骨髓单核细胞亚群的生物学特性提供了新的见解，并有助于深入探究在特定病理条件下如何影响这些细胞的功能。

引言

骨髓在造血过程中起着核心作用，是单核细胞的主要储存库，这些单核细胞持续在血液与骨髓实质之间循环，不断更新寿命较短的循环单核细胞池^2,3，并参与稳态下组织巨噬细胞和树突状细胞的重建⁴。在炎症反应期间或短暂性再生障碍后，单核细胞会从骨髓或脾脏被主动动员^{5, 6, 7}，并定植于炎症器官。已有多个趋化因子轴被证实参与骨髓中髓系细胞的动员过程^{8, 5, 6,9}。除了髓系细胞外，骨髓也是T淋巴细胞启动活化的重要部位¹⁰，并构成免疫记忆的微环境^11,12。因此，该组织在血液学和免疫学领域的众多研究中具有核心地位。目前关于骨髓内髓系细胞结构组织的认识，主要来源于对固定组织切片的组织学分析¹³。这种静态观察无法研究骨髓不同区室之间的细胞交换动态，而后者正是其功能活动的基础。

活体成像为研究细胞迁移、细胞黏附以及细胞间相互作用提供了重要的生物学信息，这些过程以往仅通过体外（in vitro）系统进行描述。实现高质量活体成像的技术挑战主要包括：从光学角度能够有效到达目标组织，并最大程度地减少生理因素（如呼吸、肌肉或肠蠕动收缩）或机械漂移（如手术引起的组织扰动和延展、显微镜物镜接触以及温度和血管/氧合状态变化）对成像的干扰。微小的漂移可能限制长时间聚焦的稳定性，并在细胞运动性定量分析中引入伪影。一种已被多种组织验证、可有效缓解上述技术难题的替代方法是：将离体组织置于恒温且供氧的培养环境中进行成像；然而，这种方法完全中断了淋巴和血液循环，可能带来一定问题。颅骨骨髓的活体成像在上述方面具有多项优势。首先，其所需外科操作极小。其次，该区域骨组织的厚度允许直接可视化骨髓微环境，无需磨骨，从而减少了生理干扰。骨髓网络可在颅骨的旁矢状区进行成像；但在额顶区域，由于骨基质较薄，窦状血管更为清晰可见^12,14。

活体成像依赖于能够最精确标记目标细胞群体的荧光报告系统。体外对纯化的细胞群体进行标记后再进行过继转移，已成功用于鉴定造血干细胞微环境¹⁵以及促进肿瘤植入的骨髓内皮微区¹⁶，并为免疫学中若干关键概念提供了重要依据¹⁷。然而，该方法通常需要数十万计的细胞，才有可能在后续的体内检测到这些细胞。这可能是由于染色后细胞死亡率高、细胞在全身分布稀释以及细胞活化状态发生改变，从而导致归巢行为出现偏差。利用转基因小鼠系统进行内源性标记在很大程度上克服了这些局限性，已实现对内源性成骨细胞⁸、巨核细胞¹⁸以及髓系细胞亚群⁶行为的成像观察。然而，在采用荧光报告系统研究特定细胞亚群时，仍需谨慎评估其标记的特异性。

的 Csf1r- Gal4VP16/UAS-ECFP，称为 MacBlue 小鼠 ¹是一种用于通过实时成像研究髓质单核细胞的有价值的转基因系统 ⁶静脉注射高分子量罗丹明-葡聚糖可将骨髓实质与骨髓中的血管窦状网络区分开来。利用该方法，可在特定的病理生理背景下追踪单核细胞在不同骨髓区域中的行为。此外，我们提出另一种策略，通过该方法可将单核细胞的动力学与中性粒细胞进行比较 体内 使用特异性抗体进行标记。

方案

注意：所有实验方案均已获得法国动物实验与伦理委员会批准，并由“动物健康与环境保护服务部”（编号 A-75-2065）审核通过。样本量的确定旨在确保实验的可重复性，并符合动物伦理法规中的“3R”原则。

1. 小鼠的准备

1. 麻醉
   1. 对于短时间成像（少于1小时），通过腹腔注射200 µl含有氯胺酮（100 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）的生理盐水溶液对小鼠进行麻醉。
   2. 或者，对于较长时间的成像（长达4小时），通过适配的面罩吸入2.5%异氟烷，该气体由70/30的O₂/N₂O混合气体雾化产生，对小鼠进行麻醉。
   3. 注意：此方法可提供更稳定的无意识状态，并避免重复进行腹腔注射药物。
   4. 小鼠麻醉后，使用镊子刺激足垫以确认其是否失去知觉。
2. 血管染色/附加染色
   1. 进行血管染色时：通过尾静脉静脉注射200 µl罗丹明-葡聚糖（2 MDa，10 mg/ml溶于生理缓冲液中）。
   2. 进行中性粒细胞染色时：将2 µg Ly6G-PE（克隆1A8）溶于100 µl生理盐水溶液中，通过尾静脉静脉注射。
3. 固定
   1. 为实现固定，使用定制的立体定位支架，该支架需适配显微镜和麻醉气体吸入装置。
      注意：立体定位支架是一种金属支撑装置，带有两个金属板夹，其中一个为固定式，另一个为可拆卸且可调节式，用于夹紧动物头部。
   2. 将小鼠头部置于固定板之间，以隔绝呼吸运动的影响。将耳朵夹紧在固定板与头部之间，以拉伸皮肤。检查动物的稳定性及呼吸状况是否良好。
4. 去除头皮
   1. 使用无菌涂抹棒蘸取70%乙醇小心润湿头皮毛发，避免接触眼睛。
   2. 使用无菌剪刀和镊子从顶骨后部至额骨完全切除头皮。操作时应距离眼睛和耳朵至少3 mm，以防大量出血。清除覆盖颅骨的疏松结缔组织（骨膜）。用温热的PBS浸湿纸巾擦洗残留的毛发。
5. 浸没系统设置
   1. 使用细针头将直径为18 mm的橡胶环通过外科胶水直接粘附于颅骨上，以控制胶水分布。将橡胶环整个边缘牢固粘合，防止液体泄漏（30 µl胶水应足够）。
   2. 用PBS浸湿的纸巾在橡胶环下最后一次清洁颅骨，然后加入37 °C的PBS，使颅骨完全浸没。在小鼠每只眼睛上滴加一滴0.9%氯化钠溶液或专用眼用软膏，以防止眼睛干燥。将立体定位支架移至物镜下方。
   3. 通过显微镜目镜利用直接透射光大致定位视野。

2. 双光子成像采集

1. 使用配备钛宝石晶体激光器的多光子显微镜，该激光器可提供脉宽为140 fs的近红外光，波长可在680至1,080 nm范围内选择性调节，并配备声光调制器以控制激光功率。采用包含3个外部非扫描探测器（NDD）的配置（可同时记录3个荧光通道），结合两个二向色镜（565 nm 和 690 nm）、565/610 和 500/550 带通滤光片以及一个485短通滤光片，搭配平面复消色差×20（NA = 1）水浸物镜。
2. 设置加热腔以维持麻醉小鼠良好的恒温状态。
   注意：建议在成像开始前1小时 设定温度，以获得更稳定的控温效果。本实验中设定为32 °C，以使麻醉小鼠的核心体温维持在最佳范围（36–37 °C），并持续维持不超过4小时。此温度可根据所用系统进行调整（可使用数字探头验证）。此外，所用加热腔为暗色/黑色，覆盖显微系统部分组件（如物镜和电动载物台），以避免外界光线干扰。
3. 开启系统
   1. 先开启钛宝石激光器，再启动整个显微镜系统。运行图像采集软件，将激光波长设定为870 nm，并选择合适的NDD用于信号记录。
      注意：在本实验中，二次谐波生成（SHG）¹⁹和增强型青色荧光蛋白（ECFP）信号由经过485短通滤光片后的NDD检测；ECFP也由经过500/550带通滤光片的NDD检测，而罗丹明-葡聚糖信号则由经过565/610带通滤光片的NDD检测。
4. 调整采集参数
   1. 使用软件中的“实时采集”成像命令，并通过显微镜方向控制调节焦平面，聚焦至具有ECFP和罗丹明信号的区域。将激光功率调至最低，以在最小光损伤的前提下获得最佳信噪比。
      注意：所用功率设置取决于目标区域的深度。通常将AOM设置在约20%，对应物镜后激光功率约为15 mW。建议通过提高各NDD对应PMT的增益来减少光漂白和光损伤。典型的采集参数为单次扫描模式，像素驻留时间为1.58 µs，分辨率为512 × 512像素，放大倍数为1.5倍。
5. 选择感兴趣区域
   1. 参数设定完成后，再次使用“实时”采集命令，扫描组织以选择需要实时监测的（x, y, z）视野。
      注意：通常选择同时包含血管区和实质区的视野。
   2. 使用软件“位置”命令注册该视野。
      注意：该命令可记忆多个不同位置的x, y, z坐标。
   3. 按照相同流程，选择并注册最多3个额外的感兴趣区域。
   4. 在第一个已记忆的位置上，根据所需成像体积和选定的放大倍数，使用“z-stack”软件命令设置三维z层扫描。先记录较深位置，再记录最浅位置，并根据深度归一化激光功率。
      注意：对于多个区域同步成像，我们对每个视野采集5层图像，z轴步进为3 µm，总厚度为12 µm。这些参数可根据所研究细胞类型进行调整。
6. 启动图像采集
   1. 选择“时间序列”软件命令，设定时间间隔和循环次数。通过点击“开始实验”命令，根据所需的时间间隔和总时长开始延时成像。
      注意：本实验中，每30秒 采集一个体积图像，共60个循环，相当于30分钟真实时间。若需追踪血管内细胞的快速滚动行为，可采用更短的时间间隔。此时应使用更薄的z层扫描，且同时记录的视野不超过2个。
   2. 定期监控系统状态。
      1. 始终监控动物状态，确保其处于无意识状态。
         注意：若动物胡须或腿部出现抖动，提示可能苏醒。若呼吸呈现不规则，可略微减少异氟烷用量。采集过程中若出现显著组织漂移，提示小鼠可能正在恢复意识。
      2. 确保物镜始终处于浸没状态。在两次采集之间（约30分钟）更换37 °C的PBS缓冲液。
         注意：采集过程中信号逐渐减弱提示可能存在PBS泄漏。
7. 实验结束
   1. 完成所需视频采集后，在动物复苏前迅速通过颈椎脱臼法实施安乐死。
      注意：伤口愈合将在24至48小时内形成结痂，从而限制后续纵向成像的可能性。

3. 数据分析

1. 漂移校正
   1. 使用 Imaris Bitplane 软件进行三维自动追踪。
   2. 在 Imaris 中打开三维图像序列。选择“spot”命令，并通过手动追踪（鼠标点击+Shift键）为所有时间点生成至少4个不同的锚定点，若可能，应使这些点在视野中均匀分布。
   3. 在“edit track”选项卡中使用“correct drift”命令进行漂移校正。
   4. 检查x、y方向尤其是z方向的校正质量，以避免出现伪影性波动。
      注意：如果校正效果不理想，可尝试更换其他锚定点，或排除该视频数据不参与后续分析。
2. 细胞追踪
   1. 使用“add new spots”命令，并选择“track spots over time”算法设置。进入下一步。
   2. 使用“source channel”命令对整个目标通道执行自动细胞追踪程序。将目标（即细胞）的直径设置为 10 µm。进入下一步。
      注意：该选择取决于目标物与检测信号之间的区分度及特异性。简而言之，仅当检测到的信号对目标物具有特异性时，才可对整个通道进行自动追踪。由于SHG和ECFP信号均通过NDD在485短通滤光片后被检测，因此使用NDD在500/550带通滤光片后记录的ECFP信号进行追踪将更具特异性和效率。对于成簇或密集排列的目标物，需参照步骤3.1.2进行个体目标的手动选择。
   3. 选择“quality”滤波类型，设定阈值以排除非特异性目标的追踪。进入下一步。
   4. 选择“Brownian Algorithm Motion”，并准确设置两个斑点之间的“Max distance”和“Gap size”参数。确认并生成轨迹。
   5. 轨迹自动生成后，选择“track duration”滤波类型，设定阈值以剔除短于120秒（对应4个时间点）的轨迹。
   6. 必须步骤：自动追踪完成后，需检查轨迹质量。
      1. 展开时间轴，检查目标是否沿轨迹路径移动。若不符合，可使用“edit”选项卡中提供的轨迹点校正功能：使用“delete”命令删除错误或不恰当的轨迹（可使用“disconnect”命令单独删除任意轨迹点）。若轨迹路径不连续，可通过手动添加缺失的时间点（鼠标点击+Shift键），选中某一条轨迹上的所有点，然后在“edit track”选项卡中使用“connect”命令进行连接。
3. 定量参数分析
   1. 在“Preferences”命令中选择“Statistic”选项卡，从列表中选择感兴趣的动态参数。选择“Export all statistics to file”命令，并保存生成的Excel文件。
      注意：软件可直接提供多种动态参数，如轨迹长度、瞬时速度、平均速度和轨迹直线性。运动系数^6,20可被计算得出，但软件不直接提供该值。
   2. 对每个细胞，计算每个时间段（δt）内的位移均值（对于30秒时间间隔的成像视频，δt分别为30、60、90秒等）。绘制均方位移随时间间隔变化的曲线图，并通过计算曲线线性部分的斜率获得运动系数。

结果

小鼠颅骨结构为通过活体成像研究骨髓生理学提供了良好机会。颅骨的额顶区域骨壁较薄，因此无需磨除骨组织即可观察到骨髓微环境。图1展示了MacBlue转基因小鼠颅骨的一个宽视野二维图像。骨基质主要由胶原蛋白I组成，可通过二次谐波信号（SHG）清晰检测¹⁹。注射罗丹明标记的葡聚糖可标记骨髓中的血管网络，从而识别位于骨基质与血管之间的实质骨髓微环境¹⁴。ECFP标记的细胞分布于骨髓的两个区室中，但不存在于骨基质内。单核细胞根据其在组织中的位置进行人工分类：当整个细胞位于血管腔内时，定义为血管内单核细胞，无论血管大小如何，仅排除较大的汇集静脉纳入分析；当细胞位于血管系统与骨基质之间时，定义为实质单核细胞。

对特定感兴趣区域进行延时成像（补充视频1和2），可分别追踪血管内（图2A）或实质内（图2B）单核细胞随时间变化的个体运动轨迹。轨迹长度显示，与血管内单核细胞相比，实质内单核细胞的位移减少。对位移随时间变化的分析可比较两个区室中单核细胞的平均速度（<...

讨论

关键点 体内 成像方法学的目标是确保焦距的稳定性，以最大限度延长成像持续时间，并尽量减少细菌污染和炎症的风险，这些因素可能影响炎性细胞的动态行为。颅骨骨髓的成像遵循上述原则，因为为获取骨髓而实施的手术创伤极小。使用无菌材料和消毒剂对于限制感染风险至关重要，因为感染可能干扰细胞稳态。

立体定位支架的开发可能具有挑战性，需要针对每个系统进行特定的定制（如显微镜物镜与电动载物台之间的距离、使用气体吸入麻醉装置等）。应尽可能使小鼠头部保持水平，以获得更广泛的成像表面访问。动物放置到位后，通常需要数分钟时间才能获得焦平面的良好稳定性。因此，建议在启动图像采集记录前检查组织是否发生漂移。由于此过程连同感兴趣区域的选择可能耗时较长，若使用了氯胺酮/赛拉嗪进行麻醉，建议定期检查动物是否仍处于无意识状态，并检查物镜是否始终浸没在液体中，因为液体可能发生泄漏或蒸发。

橡胶环在颅骨上的良好定位是该过程中的另一个关键步骤。氰基丙烯酸酯胶水在稳定性和密封性方面效果良好，但需避免胶水过量，以免覆盖颅骨并阻碍对组织感兴趣区...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯胺酮	Merial		100 mg/ml，麻醉剂
赛拉嗪	Bayer HealthCare		10 mg/ml，麻醉剂
异氟烷	Baxter		2.5%，麻醉剂
O2/NO2			70/30 混合气体，麻醉剂
罗丹明-葡聚糖	Invitrogen		2 MDa，10 mg/ml，血管染色
Ly6G-PE	Becton-Dickinson		克隆株 1A8，中性粒细胞染色
立体定位固定装置	自制		手术
70% 乙醇			手术
无菌剪刀和镊子			手术
橡胶环			直径 18 mm，手术
Glubran 2	Queryo Medical		外科粘合剂，用于固定橡胶环
细针头	Terumo		手术
Zeiss LSM 710 NLO 多光子显微镜	Carl Zeiss		显微镜
Ti:蓝宝石晶体激光器	Coherent Chameleon Ultra		近红外光，140 飞秒脉冲
Zen 2010	Carl Zeiss		采集软件
Imaris Bitplane	Bitplane		分析软件，三维自动追踪
PBS 1X	D. Dutscher		手术
温控培养室	Carl Zeiss		活体成像