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方法文章

分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响

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DOI：

10.3791/52480

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2015年1月7日

 ,  ,  , 
1School of Clinical and Experimental Medicine, University of Birmingham, 2College of Medical and Dental Sciences, University of Birmingham, 3School of Immunity and Infection, University of Birmingham

本文内容

摘要

炎症内皮从血流中募集白细胞的能力受到间充质基质细胞的调控。我们描述了两种 体外 结合原代人源细胞的模型，可用于评估中性粒细胞从流动状态中的募集，并研究间充质基质细胞在调控该过程中的作用。

摘要

基质细胞通过与邻近内皮细胞的相互作用，在炎症过程中调控循环白细胞的募集。本文描述了两种 体外 用于研究炎症内皮细胞从流动中募集循环中性粒细胞的“血管”模型。这些模型的一个主要优势在于能够按顺序分析白细胞黏附级联反应的每一步骤，正如其在体内实际发生的过程一样 体内我们还描述了如何调整这两种模型以研究基质细胞（在此为间充质干细胞，MSC）在调控白细胞募集中的作用。

将原代内皮细胞单独培养，或与人源间充质干细胞（MSC）在Ibidi微孔板上直接接触共培养，或在Transwell小室的相对两侧进行非接触共培养，培养时间为24小时。随后，用肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激细胞4小时，并将其用于基于流动的黏附实验。将中性粒细胞团以脉冲形式灌注流经内皮层，持续4分钟。通过相差显微镜观察流动中性粒细胞的捕获过程及其与内皮细胞的相互作用。

在两种模型中，细胞因子刺激均以剂量依赖性方式增强了内皮细胞对流动中性粒细胞的招募。对已招募中性粒细胞行为的分析显示，其滚动现象随剂量增加而减少，而穿过内皮细胞的跨内皮迁移则随剂量增加而增强。在共培养条件下，间充质干细胞（MSC）抑制了中性粒细胞在TNFα刺激的内皮细胞上的黏附。

我们基于流体的黏附模型可模拟白细胞从循环系统中被募集的初始阶段。除了白细胞外，这些模型还可用于研究其他细胞类型的募集过程，例如治疗性输入的间充质干细胞（MSC）或循环肿瘤细胞。我们的多层共培养模型表明，MSC会与血管内皮细胞相互作用，从而改变内皮细胞对促炎性细胞因子的反应，进而影响中性粒细胞的募集。未来还需利用此类模型进一步研究来自不同组织和不同生理病理条件（如炎症性疾病或癌症）的基质细胞如何在炎症过程中影响白细胞的募集。

引言

炎症是对微生物感染或组织损伤的一种保护性反应，其消退过程需要对白细胞进入和离开炎症组织进行严格调控1,2。血管内皮细胞（EC）、循环白细胞与组织驻留的基质细胞之间的相互作用，对于协调这一过程至关重要3。然而，白细胞的失控性募集及其清除效率低下，是慢性炎症性疾病发生发展的基础4。目前，人们对健康与疾病状态下白细胞募集过程的理解仍不完善，亟需建立更为可靠的模型来分析这一过程。

白细胞从血液中通过后微静脉血管内皮细胞（EC）被募集的机制已有较为详尽的描述1,2,5。循环中的白细胞被炎症内皮细胞表面上调表达的特异性受体（例如，VCAM-1、E-选择素、P-选择素）捕获。这些短暂的相互作用使白细胞能够与内皮或间质来源的表面结合型趋化因子及脂质衍生物介质相互作用，从而激活白细胞表面表达的整合素6-11。这一过程继而稳定了白细胞的黏附，并驱动其穿越内皮进入组织12-15。在组织内部，被募集的白细胞受到间质来源因子的影响，从而调控其迁移能力、功能及存活16,17。越来越多的证据强烈表明，白细胞在募集过程的每一阶段所接收到的信号，都会为其进入下一阶段做好准备。然而，目前对白细胞募集过程的理解仍不完整，关于调控白细胞在组织内运动的组分，所知甚少。

在伯明翰，我们已开发出多种用于研究白细胞从流动状态中被募集的体外“血管”模型9,18,19。目前我们认识到，血管内皮细胞（EC）可作为白细胞募集的即时调控者，响应其局部微环境的变化。具体而言，组织驻留的基质细胞可通过与邻近血管内皮细胞进行“对话”，从而主动调节炎症反应，并影响内皮细胞在白细胞募集中的作用3。我们先前已证实，不同类型的基质细胞能够以组织特异性的方式调节内皮细胞支持白细胞黏附和迁移的能力，且这些效应在慢性疾病中会发生改变13,16,20,21。因此，基质细胞建立了定义每种炎症反应背景的组织“地址码”22。最近，我们进一步证明，骨髓来源的间充质干细胞（BMMSC）可强烈抑制内皮细胞对细胞因子的反应，从而减少中性粒细胞和淋巴细胞的募集23。

阐明的招募机制 体外 主要采用了包含单一细胞类型的检测方法（例如， EC) 或单独的蛋白质。然而，这些研究并未考虑局部组织环境的影响（即， 基质细胞对白细胞募集及其随后迁移进入组织的影响。本文描述了两种基于流体的共培养方法，其中基质细胞（特别是间充质干细胞，MSC）与内皮细胞（EC）共培养23此类模型使我们能够研究基质细胞对内皮细胞反应的影响，特别是其在支持白细胞从流动状态下募集方面的能力。

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方案

1. 原代人内皮细胞和间充质干细胞的分离与培养

  1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离与培养
    1. 将脐带置于铺有纸巾的托盘上，喷洒70%乙醇。放入组织培养超净台中。辨认静脉并从两端插管。在插管端用扎带固定。
    2. 用注射器以 PBS 冲洗静脉血。将注射器吸入空气，然后通过静脉以清除并弃去残留的 PBS。
    3. 解冻 10 mg/ml Ia 型胶原酶，并用含氯化钙和氯化镁的 PBS 按 1:10 比例稀释，得到终浓度为 1 mg/ml 的胶原酶溶液。将胶原酶溶液经静脉注入，直至两端套管均充满。关闭两端套管上的夹子。
    4. 用组织覆盖托盘，并喷洒70%乙醇。将脐带放入37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育20分钟。2.
    5. 将脐带从培养箱中取出，扎紧扎带。轻轻按摩脐带1分钟。用10 ml PBS冲洗细胞悬液，并收集至50 ml离心管中。
    6. 用空气填充注射器，通过静脉冲洗两次以去除任何残留的 PBS，并将 PBS 收集至先前使用的 50 ml 离心管中 步骤 1.1.5. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟。
    7. 吸弃上清液，用1 ml完全EC培养基重悬沉淀。EC培养基由M199培养基添加35 µg/ml硫酸庆大霉素、10 ng/ml人表皮生长因子、1 µg/ml氢化可的松、2.5 μg/ml两性霉素B和20%胎牛血清组成。
    8. 加入4 ml EC培养基和EC悬液至一个25 cm²培养瓶中2 培养瓶。次日更换培养基，之后每2天更换一次。
    9. EC 表现出鹅卵石样的形态（图1Ai）。在进行黏附实验时，内皮细胞通常在其达到100%汇合度时接种（参见 第1.4节).
  2. 从人脐带中分离华通胶间充质干细胞（WJMSC）：
    1. 从新鲜脐带或已用于分离内皮细胞（EC）的脐带中分离华通氏胶来源的间充质干细胞（WJMSC）。将脐带切成5 cm长的片段。沿纵轴切开每一段，暴露其中的血管（2条动脉，呈白色、质地较硬；1条静脉，呈黄色、扩张状）。
    2. 使用无菌剪刀和镊子去除血管并弃去。将所有组织切成 2 - 3 mm3 使用镊子放置 2 - 3 mm 的组织块。3 将碎片放入一个50 ml离心管中。
    3. 解冻100 mg/ml的II型胶原酶储备液，用10 ml PBS按1:100稀释，终浓度为1 mg/ml。解冻20,000 U/ml的透明质酸酶储备液，按1:400稀释至胶原酶溶液中，终浓度为50 U/ml。
    4. 将酶解混合液加入含有组织碎片的离心管中。将组织碎片置于37 °C缓慢旋转摇床上孵育5小时。
    5. 将细胞悬液用PBS按1:5比例稀释。将孔径100 µm的滤膜放入新的50 ml离心管中。将细胞悬液倒入孔径100 µm的滤膜上。
      注意：剩余的组织碎片将留在滤器上，细胞将收集在50 ml离心管中。
    6. 弃去滤膜。将细胞悬液在室温下以400 × g离心10分钟。吸除上清液，将WJMSC沉淀重悬于12 ml完全WJMSC培养基（DMEM低糖培养基、10% FCS及100 U/ml青霉素+100 µg/ml链霉素混合液）中。
    7. 将所有细胞接种于75 cm²培养瓶中2 组织培养瓶。24小时后更换培养基，加入12 ml完全WJMSC培养基。每2-3天更换一次培养基。细胞应在2周内达到70-80%融合度。当WJMSC达到70-80%融合度时进行传代（参见 第1.4节).
  3. 骨髓来源的间充质干细胞（BMMSC）的扩增
    1. 按照先前所述方法分离人骨髓来源的间充质干细胞（BMMSC）24向15 mL离心管中加入10 mL预热的间充质干细胞生长培养基（MSCGM）。
    2. 将一管p2代BMMSC置于37 °C水浴中2分钟以解冻。将BMMSC悬液加入含有MSCGM的离心管中，用移液器轻轻吹打混匀。
    3. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟。彻底吸除上清液。
    4. 在1 ml MSCGM中重悬细胞，使用血细胞计数板或细胞计数仪（如Cellometer）进行细胞计数。
    5. 将种子细胞接种到 75 cm2 培养瓶的接种密度为每平方厘米5,000至6,000个细胞2 在12 ml MSCGM中培养。24小时后更换为12 ml MSCGM。每隔2-3天用12 ml MSCGM换液。
    6. 当BMMSC达到70-80%融合度时传代（参见 第1.4节）。细胞呈现成纤维细胞样形态（图1Aii).
  4. 内皮细胞和间充质干细胞的分离：
    1. 吸出25 cm²培养瓶中的培养基2 培养瓶。加入2 ml 0.02% EDTA，孵育约2分钟。吸除EDTA，加入2 ml胰蛋白酶（2.5 mg/ml）。在显微镜下观察，直至细胞变圆。
    2. 轻拍培养瓶以使细胞脱落。加入8 ml培养基（根据细胞类型而定：HUVEC使用EC培养基，WJMSC使用DMEM低糖培养基，BMMSC使用MSCGM培养基）以终止胰酶消化，将悬液转移至15 ml离心管中。
    3. 在室温下以 400 × g 离心 5 分钟。吸除上清液，并按如下所述重悬沉淀。
      1. 对于MSC的传代，将细胞沉淀重悬于3 ml培养基中。向三个独立的75 cm²培养瓶中各加入11 ml培养基。2 培养瓶。每个培养瓶中加入1 ml细胞悬液（按1:3比例传代）。使用前，将WJMSC和BMMSC连续传代3次（p3）。
      2. 用于在粘附实验中接种EC或MSC——参见 第2节 和 3.
  5. 冻存间充质干细胞：
    1. 第3代时，按前述方法消化MSC 第1.4节吸弃上清液，并用 3 ml 冰冷的 CryoSFM 重悬细胞。将 1 ml 细胞悬液分装至预冷的 1.5 ml 冻存管中。将冻存管放入冷冻容器中。
    2. 将容器于 -80 °C 过夜保存。转移至液氮中。解冻 MSC 小瓶（遵循 步骤 1.3.1 - 1.3.6）。将MSC重悬于5 ml培养基中（根据WJMSC或BMMSC选择合适的培养基），接种至25 cm²培养瓶中2 烧瓶

2. 在Ibidi微孔板上建立内皮细胞-间充质干细胞共培养体系

  1. 用胰蛋白酶消化一个汇合的 25 cm2 培养瓶中的内皮细胞（EC）（约 1.5 × 106 个细胞；参见 第 1.4 节）。将 EC 重悬于 380 µl MSCGM 培养基中（1 个 25 cm2 培养瓶可接种两个 6 通道 Ibidi 微流控载玻片（每个通道约 1.25 × 105 个细胞）；所有细胞类型的黏附实验均在 MSCGM 培养基中进行）。向每个通道中加入 30 µl EC 悬液（通过毛细作用覆盖生长区域）。将 Ibidi 微流控载玻片置于 37 °C、5% CO2 条件下孵育 1 小时。
  2. 向每个通道中加入 140 µl MSCGM，随后吸除。重复该步骤两次，共洗涤 3 次。最后向每个通道中加入 140 µl MSCGM，并置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 24 小时。
  3. 对于共培养体系，消化 MSC 细胞（参见 第 1.4 节）。使用血细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。将 MSC 细胞浓度调整至 1.5 × 105 个细胞/ml。
  4. 吸除 Ibidi 通道中多余的培养基（仅保留通道生长区域内的培养基）。向每个通道中加入 30 µl MSC 悬液。吸除从通道生长区域挤出的培养基，再加入 30 µl MSC 悬液。重复一次，随后将 Ibidi 微流控载玻片置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 1 小时。
  5. 向每个通道中加入 140 µl MSCGM，随后吸除。重复两次，共洗涤 3 次。最后向每个通道中加入 140 µl MSCGM，并置于 37 °C、5% CO2 培养箱中孵育 24 小时。
  6. 解冻 1 × 105 U/ml 的 TNFα 储存液，并用 MSCGM 按 1:1,000 稀释，使其终浓度为 100 U/ml（相当于约 10 ng/ml）。通过将 100 U/ml TNFα 用 MSCGM 按 1:10 稀释，得到 10 U/ml；再将 10 U/ml TNFα 用 MSCGM 按 1:10 稀释，得到 1 U/ml，进行系列稀释。
  7. 在实验前，用 TNFα 在 37 °C 条件下处理通道 4 小时。细胞因子处理期间的温度波动将改变中性粒细胞募集的观察模式。向未处理的通道中加入新鲜 MSCGM。

3. 在滤膜上建立内皮细胞-间充质干细胞共培养体系

  1. 按照第1.4节所述方法消化分离WJ或BMMSC。将细胞沉淀重悬于1 ml MSCGM培养基中。使用血细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。
  2. 调整体积，使最终浓度为5 × 105 个MSC溶于500 µl MSCGM培养基中。
  3. 使用无菌镊子将6孔0.4 µm PET Transwell小室滤膜翻转，并置于无菌盒中。
  4. 将5 × 105 个MSC接种至滤膜外表面。于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
  5. 收集滤膜外表面的培养基，计数其中未贴壁的MSC数量。使用无菌镊子将滤膜重新翻转，并放入含有3 ml MSCGM培养基的配套6孔板中。
  6. 在滤膜内表面加入2 ml MSCGM培养基（图1B）。置于37 °C、5% CO2培养箱中孵育24小时。同时对汇合的25 cm2培养瓶中的EC进行胰酶消化（图1Ai；操作见第1.4节）。
  7. 将EC重悬于8 ml MSCGM培养基中（1个25 cm2培养瓶可接种4个6孔Transwell滤膜；每孔约5 × 105 个EC）。吸除滤膜上下两室的培养基。向下方腔室（滤膜下方）加入3 ml新鲜MSCGM培养基。向每个滤膜内表面加入2 ml EC悬液。于37 °C、5% CO2条件下孵育1小时。
  8. 吸除培养基以洗去未贴壁的EC，并更换为新鲜MSCGM培养基。设置平行的EC单层培养对照组：仅在滤膜内表面接种EC，不预先接种MSC。于37 °C、5% CO2条件下过夜孵育。
  9. 检查EC单层是否已完全汇合且无间隙。未完全汇合的单层不可用于黏附实验（图1B）。
  10. 在实验开始前，于37 °C条件下用1、10或100 U/ml TNFα（相当于约10 ng/ml）处理滤膜上下腔室4小时（具体操作见第2节）。

4. 白细胞的分离

  1. 从健康志愿者体内采集静脉血，并立即分装至含EDTA的试管中。轻轻颠倒混匀。
  2. 在10 ml圆底试管中，将2.5 ml Histopaque 1077叠加于2.5 ml Histopaque 1119之上，再将5 ml全血小心叠加于Histopaque梯度上层。在室温下以800 × g离心40分钟。
  3. 收集位于Histopaque 1077与1119界面处（红细胞层上方）的外周多形核中性粒细胞（PMN）。将其转移至10 ml圆底试管中，用PBSA定容至10 ml。轻轻颠倒混匀后，在室温下以400 × g离心5分钟。
  4. 用100 ml PBS（含氯化钙和氯化镁）将7.5% BSA溶液按1:50稀释，得到终浓度为0.15%（w/v；PBSA）。吸除上清液，加入10 ml PBSA重悬细胞。在室温下以400 × g离心5分钟。
  5. 用1 ml PBSA重悬细胞。取20 µl细胞悬液加入380 µl PBSA中（1:20稀释），使用血细胞计数板或细胞计数仪进行细胞计数。用PBSA将细胞悬液稀释至所需浓度（Transwell小室和Ibidi微孔板实验使用1 × 106/ml）。细胞悬液于室温保存，直至进行实验。

5. 组装流动系统

  1. 按照图1C所示设置流体系统。打开加热器并设定为37 °C。将一个20 ml注射器（移除活塞）和一个5 ml注射器连接至三通阀。使用Micropore胶带将三通阀固定在有机玻璃腔室上。
  2. 测量并截取一段长约相当于阀门至三通阀之间距离的硅胶管（2/4 mm，厚壁）。再截取一段8–10 mm长的1/3 mm（薄壁）管，并将其插入厚壁管的一端。将厚壁管的另一端连接至三通阀。
  3. 将薄壁管的末端连接至电子三通微阀的一个端口，作为“清洗液储液池”。另截取一段6–8 mm长的厚壁管和薄壁管。
  4. 将薄壁管插入厚壁管的一端。将厚壁管的另一端连接至一个2 ml注射器（移除活塞）。
  5. 将2 ml注射器的薄壁管末端连接至电子微阀的另一个端口，构成“样品储液池”。通过测量并截取一段长度等于微阀至显微镜载物台中心距离的薄壁管，将微阀与滤膜流动腔室连接。
  6. 对于微滑片（microslide）型号，将一段8–10 mm长的厚壁管连接至通向微滑片的薄壁管末端，并在厚壁管末端安装一个L型接头，用于连接微滑片。对于滤膜（filter）型号，则将一段8–10 mm长的Portex Blue Line测压管连接至薄壁管末端。
  7. 将薄壁管的末端连接至微阀，此为清洗液和样品储液池的共用出口。用PBSA填充各储液池，并通过让PBSA流经管路以排除所有气泡，完成管路预处理。
  8. 将测压管连接至一个29 mm（50 ml）玻璃注射器。用10 ml PBSA填充注射器以进行预处理。将注射器倒置，使连接管路的一端朝上，排出所有气泡，然后重新加入5 ml PBSA。
  9. 仅针对微滑片型号，将一段10–12 mm长的厚壁管连接至通向玻璃注射器的测压管末端，并在厚壁管末端安装一个L型接头。将玻璃注射器放入注射泵中，用于液体的注入或抽取。
  10. 使用以下公式计算所需补充流速（Q），以产生目标壁面剪切应力（τw，单位为帕斯卡Pa）：0.1 Pa（Transwell滤膜）或0.05 Pa（Ibidi微滑片）：
    γw = (6·Q) / (w·h2)
    τ = n·γ
    其中，w为流道内宽，h为流道内深，n为流动溶液的黏度；PBSA的黏度n = 0.7 mPa·s。对于平行板滤膜流动腔室，宽度（w）为4 mm，深度（h）为0.133 mm。由于所用Parafilm密封垫厚度存在差异，腔室深度可能略有变化。对于Ibidi微滑片，宽度为3.8 mm，深度为0.4 mm。
    注意：由于流动通道尺寸及捕获动力学的差异，微滑片模型与滤膜模型所采用的剪切应力不同6。

6. 设置带有滤膜的平行板流动腔

  1. 使用金属模板裁剪一块与玻璃盖玻片相同尺寸的Parafilm。使用金属模板在Parafilm上切出一个20 × 4 mm的槽（以形成流动通道）。用垫圈在玻璃盖玻片上标出流动通道的位置。
  2. 将6孔滤膜的边缘与玻璃盖玻片对齐。确保滤膜覆盖住流动通道的标记区域。使用10A型手术刀小心地裁切滤膜。
  3. 用Parafilm垫圈小心覆盖滤膜，确保流动通道的槽位于滤膜中央（图1D）。用一块干净的纸巾轻压，排出任何气泡。
  4. 将盖玻片放入有机玻璃流动室底板的凹槽中。将顶部有机玻璃板置于垫圈上方，并用螺丝将两块板固定在一起（图1D）。
  5. 转动三通阀，使洗涤缓冲液（PBSA）流经阀门。将压力计管路连接到顶部有机玻璃板的进样口。让PBSA流经流动通道，以排出气泡。
  6. 将注射泵的压力计管路连接至有机玻璃板的出样口。将注射泵设置为“灌注”模式并启动运行。清除滴落在流动室上层板上的任何PBSA。
  7. 将流动室放置在倒置相差显微镜的载物台上。调节焦距，观察滤膜上方的内皮细胞（EC）（图1B）。

7. 为流动实验设置微载玻片

  1. 将微载玻片放置于倒置相差显微镜的载物台上。将L形连接器插入通道的入口端口。使PBSA流经流体通道。
  2. 将来自注射泵的L形连接器插入通道的出口端口。将注射泵设置为回吸模式并启动运行。清除滴落在微载玻片上的任何PBSA。调节焦距以观察内皮细胞单层。

8. 白细胞在内皮细胞上的灌注

  1. 将2 ml纯化的中性粒细胞加入样品储液池中，静置温育2分钟。用PBSA冲洗内皮层2分钟。
  2. 打开阀门，使中性粒细胞流经内皮层。持续输送中性粒细胞团块4分钟。关闭阀门，并从清洗储液池中继续灌注PBSA直至实验结束。
  3. 确保在实验过程中任何时候均无气泡通过流动通道，否则会破坏内皮细胞单层并导致已黏附的中性粒细胞脱落。

9. 记录中性粒细胞的捕获与行为

  1. 在中性粒细胞流动期间或灌注后记录中性粒细胞的募集情况。
  2. 在流动通道中心区域至少记录5–10个视野的数字图像。通过将物镜移至入口端口处通道边缘并确定端口中心位置来识别通道中心。
    1. 若在中性粒细胞流动期间进行记录，对单个视野每10秒采集一次图像，持续1分钟。沿通道移动并记录下一个视野，同样持续1分钟。在整个团注持续期间重复此操作。
    2. 若在灌注后进行记录，在流动通道中心沿线选取5–10个视野，每个视野记录10秒（通常在中性粒细胞团注结束后2分钟），用于评估白细胞行为。在10秒记录期间每秒采集一次图像。此方法可为从流动中捕获细胞以及黏附中性粒细胞的行为分析提供充足时间。
    3. 选取一个包含至少10个已迁移中性粒细胞的视野，持续记录5分钟，每30秒采集一次图像。该记录可用于计算迁移细胞的速度（无论位于内皮上方或下方）。
    4. 再采集一系列10秒时长的视野图像（通常在灌注后9分钟）。此步骤可为中性粒细胞穿过内皮单层提供足够的迁移时间。
    5. 停止注射泵并移除管路。拆卸流动室，冲洗样品储液槽和管路。随后对其他滤膜/显微载片通道重复上述操作。

10. 白细胞募集与行为分析

  1. 在2分钟时间点的10秒录像中，计数每个视野内的中性粒细胞数量。只有在第一秒时完全位于视野内的细胞才计入统计。对于同时部分位于视野两侧的细胞（例如， 视野中位于顶部或右侧边界的对象，只要在完整的10秒内持续保留在视野中，即计入计数。
  2. 计算每个视野中黏附中性粒细胞的平均数量。测量所记录视野的长度和宽度。计算视野的面积。计算1 mm²中有多少个视野。2将平均中性粒细胞计数乘以1 mm内的视野数2.
  3. 通过将灌注的中性粒细胞数量（例如， 2 x 106/ml*Q [例如， 0.0999 ml/min（用于平行板流动腔）] 乘以团注持续时间（例如， 4 分钟）。
  4. 将中性粒细胞计数/mm2 通过灌注的中性粒细胞总数来确定黏附细胞的总数（黏附细胞数/mm）2 / 106 灌注
  5. 评估贴壁的中性粒细胞是处于滚动、牢固贴壁还是已发生跨内皮迁移补充视频 1 和 2).
    1. 滚动的中性粒细胞呈相位明亮，会沿内皮单层缓慢移动（1 - 10 µm/sec； 补充视频 1).
    2. 牢固贴壁的细胞呈相位明亮，且与内皮细胞表面紧密结合，保持静止不动（即， 在记录期间保持静止，或已发生形态改变并在内皮细胞表面迁移图1Ei).
    3. 一个已迁移的中性粒细胞呈相差暗态，位于内皮细胞层下方（图1Eii).
  6. 计算黏附细胞中滚动、静止和跨内皮迁移的百分比。或者，可通过应用与计算总黏附细胞数相同的公式，将中性粒细胞的行为表示为表现出不同行为的细胞总数（如前所述）。 步骤 10.6 - 10.7).
    1. 标记一个滚动中性粒细胞的前沿边缘。在10秒序列结束时，标记同一细胞的前沿边缘。在两点之间画一条线，并测量细胞移动的距离。
    2. 将该值除以细胞滚动持续的记录时间即， 10 秒）。尽量选择在整个 10 秒间隔内均位于视野中的中性粒细胞。
  7. 为计算中性粒细胞在内皮表面（相位明亮，形态改变）或内皮下（相位暗）迁移的速度，使用5分钟的录像记录（补充视频 2).
    1. 在序列开始时绘制迁移细胞的轮廓，并在整个序列中追踪其运动。记录每个细胞在每1分钟间隔时质心的X和Y坐标位置。将序列中第二幅图像的X和Y坐标值减去第一幅图像的对应值。该计算基于勾股定理。
    2. 将第三幅图像的数值减去第二幅图像的数值，对序列中的所有图像执行此操作。将X和Y方向的数值分别平方后相加。
    3. 对所得数值进行平方根运算。通过计算每个一分钟时间间隔的平均速度，得出每个细胞的速度。追踪10个迁移的中性粒细胞，并计算平均速度。

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结果

首先，我们利用Ibidi微载玻片模型分析了用TNFα刺激内皮细胞（EC）对从流动中募集中性粒细胞的影响（第7–9节）。在未添加TNFα的情况下，几乎没有任何中性粒细胞黏附到内皮单层上（图2A）。这一结果符合预期，因为未经处理或处于静息状态的内皮细胞不表达支持中性粒细胞结合所必需的黏附分子（选择素）或趋化因子25,26。相比之下，细胞因子刺激以剂量依赖的方式显著增加了中性粒细胞对内皮层的黏附（图2A）。在实验过程中，黏附通常保持稳定。若白细胞与未经处理的内皮发生结合，表明内皮细胞可能已被激活（例如，在培养过程中被脂多糖LPS污染），和/或中性粒细胞在分离过程中被激活。事实上，已有研究表明LPS可上调内皮细胞表面E-选择素、ICAM-1和VCAM-1的表达25–27，从而使其能够结合中性粒细胞。

在分析募集的中性粒细胞行为时，我们通常观察到中性粒细胞滚动比例呈剂量依赖性降低（图2B），同时伴...

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讨论

在此我们描述两种 体外 用于研究炎症内皮招募循环中性粒细胞的“血管”模型。这些模型的一个主要优势在于能够按顺序分析白细胞黏附级联反应的每一步骤，正如其在体内发生的过程一样 体内我们先前观察到中性粒细胞在TNFα刺激的内皮细胞上的黏附及跨内皮迁移呈剂量依赖性增加。9,29我们还描述了如何调整这两种模型以研究基质细胞对白细胞募集的影响。在此，间充质干细胞（MSC）与内皮细胞（EC）在Ibidi微孔载片中或在多孔滤膜的相对两侧进行共培养。这种设置允许两种细胞类型相互交流，从而改变彼此的表型和应答反应。我们在此以及先前的研究中已证实23，间充质干细胞的存在抑制了中性粒细胞对TNFα刺激的内皮细胞的黏附。这表明基质细胞可调节内皮细胞对细胞因子的反应，进而改变循环白细胞的募集。

除了上述模型外，Cellix Biochips、Bioflux 培养板和 Glyotech 平行板流动腔是市面上可购得的流动通道系统，可为内皮细胞的培养及白细胞募集的观察提供表面。在所有系统中，建立内皮细胞培养并进行基于流动的黏附实验时，均...

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披露

作者声明不存在利益冲突。

致谢

脐带样本的收集得到了伯明翰妇女保健国家医疗服务体系信托基金的协助。HMM 获得了英国关节炎研究基金会职业发展奖学金（19899）以及伯明翰大学健康系统科学项目（5212）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
胶原酶 Ia 型SigmaC2674用 10 ml PBS 稀释，得到终浓度为 10 mg/ml。分装成 1 ml 每份，于 -20 °C 保存。
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）SigmaD8662含氯化钙和氯化镁。保持无菌，室温保存。
1X M199 培养基Gibco31150-022使用前在 37 °C 水浴中预热。
硫酸庆大霉素SigmaG13974 °C 保存。加入 500 ml M199 培养基瓶中。
人表皮生长因子SigmaE9644分装成 10 µl 每份，-20 °C 保存。
胎牛血清（FCS）SigmaF9665FCS 必须进行批次测试，以确保分离的内皮细胞（EC）的生长和活力。56 °C 热灭活。分装成 10 ml 每份，-20 °C 保存。
两性霉素 BGibco15290-026药效强，但一周内会变质产生毒性，因此必须每周新鲜配制完全 HUVEC 培养基。分装成 1 ml 每份，-20 °C 保存。
氢化可的松SigmaH0135储备液溶于乙醇中。分装成 10 µl 每份，-20 °C 保存。
胶原酶 II 型SigmaC6885用 PBS 稀释储备液至终浓度为 100 mg/ml。分装成 100 µl 每份，-20 °C 保存。
透明质酸酶SigmaH3631用 PBS 稀释储备液至终浓度为 20,000 U/ml。分装成 100 µl 每份，-20 °C 保存。
用于 50 ml 离心管的 100 µm 细胞筛Scientific Lab Supplies (SLS)352360也可使用其他市售的细胞筛（例如 Greiner bio-one）。
低糖 DMEM 培养基BioseraLM-D1102/500使用前在 37 °C 水浴中预热。
青霉素/链霉素混合液SigmaP4333分装成 1 ml 每份，-20 °C 保存。
25 cc 组织培养瓶SLS353109
75 cc 组织培养瓶SLS353136
骨髓间充质干细胞冻存管LonzaPT-2501收到后立即存于液氮中。细胞到达时为第 2 代，但记为第 0 代。扩增至第 3 代后冻存于液氮中以备后续使用。
间充质干细胞生长培养基（MSCGM）LonzaPT-3001使用前在 37 °C 水浴中预热。进行 Cell Tracker Green 染色时，使用不含 FCS 的培养基。
EDTA（0.02%）溶液SigmaE80084 °C 保存。使用前在 37 °C 水浴中预热。
胰蛋白酶溶液SigmaT4424分装成 2 ml 每份，-20 °C 保存。室温解冻后立即使用。
冻存管Greiner bio-one2019-02加入细胞悬液前保持冰上放置。
Mr. Frosty 冻存容器Nalgene5100-0001室温保存。加入含细胞的冻存管后，于 -80 °C 保存 24 小时，再转移至液氮中。
Ibidi u-Slide VI（0.4），经组织培养处理，无菌IbidiIB-80606替代型号包括玻璃毛细管、Cellix Biochips（www.cellixltd.com）、BioFlux 培养板（www.fluxionbio.com/bioflux/）和 GlycoTech 平行板流动腔（http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html）。
Cell tracker green 荧光染料Life technologiesC2925分装成 5 µl 每份，-20 °C 保存。用 5 ml 预热至 37 °C 的 MSCGM 稀释。
细胞计数板NexcelomSD-100也可使用血细胞计数板。
Cellometer auto T4 细胞计数仪NexcelomAuto T4-203-0238
肿瘤坏死因子 α（TNFα）R&D Systems210-TA-100用 PBS 稀释储备液至终浓度为 100,000 U/ml。分装成 10 µl 每份，-80 °C 保存。
6 孔，0.4 µm PET Transwell 小室SLS353090
含 K2-EDTA 的 10 ml 采血管Sarstedt室温保存。
Histopaque 1119Sigma111914 °C 保存。使用前恢复至室温。
Histopaque 1077Sigma107714 °C 保存。使用前恢复至室温。
10 ml 圆底试管Appleton WoodsSC211 142 AS
7.5% BSA 第 V 组分溶液Life technologies15260-0374 °C 保存。
20 ml Plastipak 注射器BD falcon300613
5 ml Plastipak 注射器BD falcon302187
2 ml Plastipak 注射器BD falcon300185
3M 低致敏性手术胶带，9 m × 2.5 cmMicropore1530-1用于将注射器固定在有机玻璃腔室壁上。
硅胶管，内径/外径（ID/OD）为 1/3 mm（细管）Fisher ScientificFB68854将硅胶管剪裁至合适长度。所有直接连接至电子微阀的管路必须使用细管。
硅胶管，内径/外径（ID/OD）为 2/4 mm（粗管）Fisher ScientificFB68855
Portex Blue Line 压力测量管Smiths200/495/200连接至注射泵的管路。
三通旋塞阀BOC Ohmeda AB
用于泵的 50 ml 玻璃注射器Popper Micromate550962使用前必须排气，确保无气泡。
玻璃盖玻片Raymond A Lamb定制 26 × 76 mm 盖玻片。批号 2440980。
Parafilm 密封垫圈American National Can Company使用铝制模板裁剪 26 × 76 mm 的 Parafilm 片，再用 10a 手术刀片切出 20 × 4 mm 的槽口。垫圈厚度约为 133 µm。
两块有机玻璃平行板Wolfson Applied Technology Laboratory特制腔室，由 8 个螺丝固定两块平行板。下板中央设有观察窗，并铣出浅槽以容纳盖玻片、滤膜和垫圈。上板设有进样口和出样口，正对流道。
电子三通微阀，最小死体积Lee Products Ltd.LFYA1226032H电子连接至 12 伏直流电源。
输注/抽取用注射泵（PHD2000）Harvard Apparatus70-2001设定直径为 29 mm，并设置补液（流速）速率。
L 形连接器LabhutLE876用于连接 Ibidi 微流控载片通道的进样口和出样口。
视频摄像机Qimaging01-QIC-F-M-12-C连接至计算机，可记录数字视频。
Image-Pro Plus 7.0Media Cybernetics41N70000-61592用于数据分析。手动标记表现出不同行为的细胞。追踪细胞以分析滚动和迁移速度。
有关本实验所用试剂的危险性详情，请参阅产品说明书。

参考文献

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