分析基质细胞对流动中白细胞募集的影响

摘要

炎症内皮从血流中募集白细胞的能力受到间充质基质细胞的调控。我们描述了两种 体外 结合原代人源细胞的模型，可用于评估中性粒细胞从流动状态中的募集，并研究间充质基质细胞在调控该过程中的作用。

摘要

基质细胞通过与邻近内皮细胞的相互作用，在炎症过程中调控循环白细胞的募集。本文描述了两种 体外 用于研究炎症内皮细胞从流动中募集循环中性粒细胞的“血管”模型。这些模型的一个主要优势在于能够按顺序分析白细胞黏附级联反应的每一步骤，正如其在体内实际发生的过程一样 体内我们还描述了如何调整这两种模型以研究基质细胞（在此为间充质干细胞，MSC）在调控白细胞募集中的作用。

将原代内皮细胞单独培养，或与人源间充质干细胞（MSC）在Ibidi微孔板上直接接触共培养，或在Transwell小室的相对两侧进行非接触共培养，培养时间为24小时。随后，用肿瘤坏死因子α（TNFα）刺激细胞4小时，并将其用于基于流动的黏附实验。将中性粒细胞团以脉冲形式灌注流经内皮层，持续4分钟。通过相差显微镜观察流动中性粒细胞的捕获过程及其与内皮细胞的相互作用。

在两种模型中，细胞因子刺激均以剂量依赖性方式增强了内皮细胞对流动中性粒细胞的招募。对已招募中性粒细胞行为的分析显示，其滚动现象随剂量增加而减少，而穿过内皮细胞的跨内皮迁移则随剂量增加而增强。在共培养条件下，间充质干细胞（MSC）抑制了中性粒细胞在TNFα刺激的内皮细胞上的黏附。

我们基于流体的黏附模型可模拟白细胞从循环系统中被募集的初始阶段。除了白细胞外，这些模型还可用于研究其他细胞类型的募集过程，例如治疗性输入的间充质干细胞（MSC）或循环肿瘤细胞。我们的多层共培养模型表明，MSC会与血管内皮细胞相互作用，从而改变内皮细胞对促炎性细胞因子的反应，进而影响中性粒细胞的募集。未来还需利用此类模型进一步研究来自不同组织和不同生理病理条件（如炎症性疾病或癌症）的基质细胞如何在炎症过程中影响白细胞的募集。

引言

炎症是对微生物感染或组织损伤的一种保护性反应，其消退过程需要对白细胞进入和离开炎症组织进行严格调控^1,2。血管内皮细胞（EC）、循环白细胞与组织驻留的基质细胞之间的相互作用，对于协调这一过程至关重要³。然而，白细胞的失控性募集及其清除效率低下，是慢性炎症性疾病发生发展的基础⁴。目前，人们对健康与疾病状态下白细胞募集过程的理解仍不完善，亟需建立更为可靠的模型来分析这一过程。

白细胞从血液中通过后微静脉血管内皮细胞（EC）被募集的机制已有较为详尽的描述^1,2,5。循环中的白细胞被炎症内皮细胞表面上调表达的特异性受体（例如，VCAM-1、E-选择素、P-选择素）捕获。这些短暂的相互作用使白细胞能够与内皮或间质来源的表面结合型趋化因子及脂质衍生物介质相互作用，从而激活白细胞表面表达的整合素^6-11。这一过程继而稳定了白细胞的黏附，并驱动其穿越内皮进入组织^12-15。在组织内部，被募集的白细胞受到间质来源因子的影响，从而调控其迁移能力、功能及存活^16,17。越来越多的证据强烈表明，白细胞在募集过程的每一阶段所接收到的信号，都会为其进入下一阶段做好准备。然而，目前对白细胞募集过程的理解仍不完整，关于调控白细胞在组织内运动的组分，所知甚少。

方案

1. 原代人内皮细胞和间充质干细胞的分离与培养

1. 人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的分离与培养
   1. 将脐带置于铺有纸巾的托盘上，喷洒70%乙醇。放入组织培养超净台中。辨认静脉并从两端插管。在插管端用扎带固定。
   2. 用注射器以 PBS 冲洗静脉血。将注射器吸入空气，然后通过静脉以清除并弃去残留的 PBS。
   3. 解冻 10 mg/ml Ia 型胶原酶，并用含氯化钙和氯化镁的 PBS 按 1:10 比例稀释，得到终浓度为 1 mg/ml 的胶原酶溶液。将胶原酶溶液经静脉注入，直至两端套管均充满。关闭两端套管上的夹子。
   4. 用组织覆盖托盘，并喷洒70%乙醇。将脐带放入37 °C、5% CO₂的培养箱中孵育20分钟。₂.
   5. 将脐带从培养箱中取出，扎紧扎带。轻轻按摩脐带1分钟。用10 ml PBS冲洗细胞悬液，并收集至50 ml离心管中。
   6. 用空气填充注射器，通过静脉冲洗两次以去除任何残留的 PBS，并将 PBS 收集至先前使用的 50 ml 离心管中 步骤 1.1.5. 在室温下以 400 x g 离心 5 分钟。
   7. 吸弃上清液，用1 ml完全EC培养基重悬沉淀。EC培养基由M199培养基添加35 µg/ml硫酸庆大霉素、10 ng/ml人表皮生长因子、1 µg/ml氢化可的松、2.5 μg/ml两性霉素B和20%胎牛血清组成。

结果

首先，我们利用Ibidi微载玻片模型分析了用TNFα刺激内皮细胞（EC）对从流动中募集中性粒细胞的影响（第7–9节）。在未添加TNFα的情况下，几乎没有任何中性粒细胞黏附到内皮单层上（图2A）。这一结果符合预期，因为未经处理或处于静息状态的内皮细胞不表达支持中性粒细胞结合所必需的黏附分子（选择素）或趋化因子^25,26。相比之下，细胞因子刺激以剂量依赖的方式显著增加了中性粒细胞对内皮层的黏附（图2A）。在实验过程中，黏附通常保持稳定。若白细胞与未经处理的内皮发生结合，表明内皮细胞可能已被激活（例如，在培养过程中被脂多糖LPS污染），和/或中性粒细胞在分离过程中被激活。事实上，已有研究表明LPS可上调内皮细胞表面E-选择素、ICAM-1和VCAM-1的表达^25–27，从而使其能够结合中性粒细胞。

在分析募集的中性粒细胞行为时，我们通常观察到中性粒细胞滚动比例呈剂量依赖性降低（图2B），同时伴.......

讨论

在此我们描述两种 体外 用于研究炎症内皮招募循环中性粒细胞的“血管”模型。这些模型的一个主要优势在于能够按顺序分析白细胞黏附级联反应的每一步骤，正如其在体内发生的过程一样 体内我们先前观察到中性粒细胞在TNFα刺激的内皮细胞上的黏附及跨内皮迁移呈剂量依赖性增加。^9,29我们还描述了如何调整这两种模型以研究基质细胞对白细胞募集的影响。在此，间充质干细胞（MSC）与内皮细胞（EC）在Ibidi微孔载片中或在多孔滤膜的相对两侧进行共培养。这种设置允许两种细胞类型相互交流，从而改变彼此的表型和应答反应。我们在此以及先前的研究中已证实²³，间充质干细胞的存在抑制了中性粒细胞对TNFα刺激的内皮细胞的黏附。这表明基质细胞可调节内皮细胞对细胞因子的反应，进而改变循环白细胞的募集。

除了上述模型外，Cellix Biochips、Bioflux 培养板和 Glyotech 平行板流动腔是市面上可购得的流动通道系统，可为内皮细胞的培养及白细胞募集的观察提供表面。在所有系统中，建立内皮细胞培养并进行基于流动的黏附实验时，均.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
胶原酶 Ia 型	Sigma	C2674	用 10 ml PBS 稀释，得到终浓度为 10 mg/ml。分装成 1 ml 每份，于 -20 °C 保存。
杜尔贝科磷酸盐缓冲液（Dulbecco's PBS）	Sigma	D8662	含氯化钙和氯化镁。保持无菌，室温保存。
1X M199 培养基	Gibco	31150-022	使用前在 37 °C 水浴中预热。
硫酸庆大霉素	Sigma	G1397	4 °C 保存。加入 500 ml M199 培养基瓶中。
人表皮生长因子	Sigma	E9644	分装成 10 µl 每份，-20 °C 保存。
胎牛血清（FCS）	Sigma	F9665	FCS 必须进行批次测试，以确保分离的内皮细胞（EC）的生长和活力。56 °C 热灭活。分装成 10 ml 每份，-20 °C 保存。
两性霉素 B	Gibco	15290-026	药效强，但一周内会变质产生毒性，因此必须每周新鲜配制完全 HUVEC 培养基。分装成 1 ml 每份，-20 °C 保存。
氢化可的松	Sigma	H0135	储备液溶于乙醇中。分装成 10 µl 每份，-20 °C 保存。
胶原酶 II 型	Sigma	C6885	用 PBS 稀释储备液至终浓度为 100 mg/ml。分装成 100 µl 每份，-20 °C 保存。
透明质酸酶	Sigma	H3631	用 PBS 稀释储备液至终浓度为 20,000 U/ml。分装成 100 µl 每份，-20 °C 保存。
用于 50 ml 离心管的 100 µm 细胞筛	Scientific Lab Supplies (SLS)	352360	也可使用其他市售的细胞筛（例如 Greiner bio-one）。
低糖 DMEM 培养基	Biosera	LM-D1102/500	使用前在 37 °C 水浴中预热。
青霉素/链霉素混合液	Sigma	P4333	分装成 1 ml 每份，-20 °C 保存。
25 cc 组织培养瓶	SLS	353109
75 cc 组织培养瓶	SLS	353136
骨髓间充质干细胞冻存管	Lonza	PT-2501	收到后立即存于液氮中。细胞到达时为第 2 代，但记为第 0 代。扩增至第 3 代后冻存于液氮中以备后续使用。
间充质干细胞生长培养基（MSCGM）	Lonza	PT-3001	使用前在 37 °C 水浴中预热。进行 Cell Tracker Green 染色时，使用不含 FCS 的培养基。
EDTA（0.02%）溶液	Sigma	E8008	4 °C 保存。使用前在 37 °C 水浴中预热。
胰蛋白酶溶液	Sigma	T4424	分装成 2 ml 每份，-20 °C 保存。室温解冻后立即使用。
冻存管	Greiner bio-one	2019-02	加入细胞悬液前保持冰上放置。
Mr. Frosty 冻存容器	Nalgene	5100-0001	室温保存。加入含细胞的冻存管后，于 -80 °C 保存 24 小时，再转移至液氮中。
Ibidi u-Slide VI（0.4），经组织培养处理，无菌	Ibidi	IB-80606	替代型号包括玻璃毛细管、Cellix Biochips（www.cellixltd.com）、BioFlux 培养板（www.fluxionbio.com/bioflux/）和 GlycoTech 平行板流动腔（http://www.glycotech.com/apparatus/parallel.html）。
Cell tracker green 荧光染料	Life technologies	C2925	分装成 5 µl 每份，-20 °C 保存。用 5 ml 预热至 37 °C 的 MSCGM 稀释。
细胞计数板	Nexcelom	SD-100	也可使用血细胞计数板。
Cellometer auto T4 细胞计数仪	Nexcelom	Auto T4-203-0238
肿瘤坏死因子 α（TNFα）	R&D Systems	210-TA-100	用 PBS 稀释储备液至终浓度为 100,000 U/ml。分装成 10 µl 每份，-80 °C 保存。
6 孔，0.4 µm PET Transwell 小室	SLS	353090
含 K2-EDTA 的 10 ml 采血管	Sarstedt		室温保存。
Histopaque 1119	Sigma	11191	4 °C 保存。使用前恢复至室温。
Histopaque 1077	Sigma	10771	4 °C 保存。使用前恢复至室温。
10 ml 圆底试管	Appleton Woods	SC211 142 AS
7.5% BSA 第 V 组分溶液	Life technologies	15260-037	4 °C 保存。
20 ml Plastipak 注射器	BD falcon	300613
5 ml Plastipak 注射器	BD falcon	302187
2 ml Plastipak 注射器	BD falcon	300185
3M 低致敏性手术胶带，9 m × 2.5 cm	Micropore	1530-1	用于将注射器固定在有机玻璃腔室壁上。
硅胶管，内径/外径（ID/OD）为 1/3 mm（细管）	Fisher Scientific	FB68854	将硅胶管剪裁至合适长度。所有直接连接至电子微阀的管路必须使用细管。
硅胶管，内径/外径（ID/OD）为 2/4 mm（粗管）	Fisher Scientific	FB68855
Portex Blue Line 压力测量管	Smiths	200/495/200	连接至注射泵的管路。
三通旋塞阀	BOC Ohmeda AB
用于泵的 50 ml 玻璃注射器	Popper Micromate	550962	使用前必须排气，确保无气泡。
玻璃盖玻片	Raymond A Lamb		定制 26 × 76 mm 盖玻片。批号 2440980。
Parafilm 密封垫圈	American National Can Company		使用铝制模板裁剪 26 × 76 mm 的 Parafilm 片，再用 10a 手术刀片切出 20 × 4 mm 的槽口。垫圈厚度约为 133 µm。
两块有机玻璃平行板	Wolfson Applied Technology Laboratory		特制腔室，由 8 个螺丝固定两块平行板。下板中央设有观察窗，并铣出浅槽以容纳盖玻片、滤膜和垫圈。上板设有进样口和出样口，正对流道。
电子三通微阀，最小死体积	Lee Products Ltd.	LFYA1226032H	电子连接至 12 伏直流电源。
输注/抽取用注射泵（PHD2000）	Harvard Apparatus	70-2001	设定直径为 29 mm，并设置补液（流速）速率。
L 形连接器	Labhut	LE876	用于连接 Ibidi 微流控载片通道的进样口和出样口。
视频摄像机	Qimaging	01-QIC-F-M-12-C	连接至计算机，可记录数字视频。
Image-Pro Plus 7.0	Media Cybernetics	41N70000-61592	用于数据分析。手动标记表现出不同行为的细胞。追踪细胞以分析滚动和迁移速度。
有关本实验所用试剂的危险性详情，请参阅产品说明书。