对于外小泡的使用流式细胞仪分析技术

Summary

使用流式细胞仪（FCM）外囊泡（电动车）的测量许多不同的方法存在。确定最合适的方法时使用的几个方面应予以考虑。两个协议用于测量电动车使用的是单独的检测或珠为基础的方法介绍。

Abstract

胞外囊泡（电动汽车）的体液中是高度地参与细胞 - 细胞通讯而有助于调节生物过程的一个不同的范围中找到的小，膜衍生的囊泡。使用流式细胞仪（FCM）电动车的分析已经非常困难，由于其体积小，缺乏积极的兴趣标记离散人口。方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。不幸的是，没有任何一个尺寸适合所有的协议，并确定最适当的方法使用时的几个方面必须加以考虑。这里介绍几种不同的技术来处理电动车和两个协议使用两种独立检测或珠为基础的方法分析了电动车。在一个合理的˚F这里描述将协助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的方法中，增加信噪比，以及设置门ashion最小化检测的背景荧光。第一协议使用一个单独的检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用基于珠子的方式来捕获和检测小电动汽车和外来体。

Introduction

胞外囊泡（电动汽车）的体液中是高度地参与细胞 - 细胞通讯而有助于调节生物过程的一个不同的范围中找到的小，膜衍生的囊泡。使用流式细胞仪（FCM）电动车的分析已经非常困难，由于其体积小，缺乏积极的兴趣标记离散人口。方法EV分析，而在过去十年显着改善，仍处于进展中的工作。不幸的是，没有任何一个尺寸适合所有的协议，并确定最适当的方法使用时的几个方面必须加以考虑。这里介绍几种不同的技术来处理电动车和两个协议使用两种独立检测或珠为基础的方法分析了电动车。在一个合理的˚F这里描述将协助消除抗体聚集体在商业制剂中常见的方法中，增加信噪比，以及设置门ashion最小化检测的背景荧光。第一协议使用一个单独的检测方法，该方法是特别适合用于分析大量的临床样品中，而第二协议使用基于珠子的方式来捕获和检测小电动汽车和外来体。

电动汽车，也被称为微粒，是在参与细胞-细胞通讯而这有助于调节生物过程¹的各种各样的体液发现小，膜衍生的囊泡。通过各种表面标记物和/或生物材料直接转移表达，电动汽车能够改变受体细胞的功能发挥要么激活或抑制细胞间通讯²角色^{- 4。}在临床上，血小板衍生的电动汽车已知具有强抗凝血活性^5，而另一些已被证明有助于广泛的条件下，从促进肿瘤metasta矽统^6〜防止疾病^7。电动车可分为较小类别的细胞衍生囊泡诸如外来体和微泡（MVS），这取决于它们的尺寸和产生

Protocol

注：以下协议已符合已执行与人类福祉所有机构，国家和国际准则。所有的人的主体样本下机构审查委员会（IRB）批准的协议，并与主体的知情同意测试。

1.方法A：个别检测方法

电动汽车的血液采样/隔离1.1）处理

1. 抽取血液从供血者/病人到使用以下2步差速离心协议含1.5毫升ACD-A液等立即适合抗凝和过程（在30分钟内最多）两个10毫升玻璃试管。
   注意：此协议将从合并〜17毫升的抽血收率约贫血小板血浆（PPP）的10毫升如果有更多的或更少的PPP是需要的，血液收集管的数量可以相应地调整。
2. 离心样品在1500×g离心在室温10分钟到等离子体从血沉棕黄层和红细胞中分离出来。转让1.2毫升等分血浆上清至1.5 ml离心管，小心不要打扰含棕黄色外套和红细胞的底层。
3. 旋转以13,000×g离心10分钟，在室温以除去血小板和大细胞碎片。小心转移PPP，留下200微升，以避免干扰颗粒，并添加在PPP到一个新的试管中。
4. 在这一点上，立即使用PPP用于分析或于1.0ml等份转移至新的1.5毫升离心管中并储存在-80℃下长达两年以后的分析（参见图1A，用于总览）。
5. 如果需要纯化的电动车进行功能试验，转印6毫升PPP协议到超速离心管中，并添加28的0.2微米过滤的磷酸盐缓冲盐水液（PBS）中。自旋用于使用配备吊桶式转子超速....

Results

图1概述了用于分离和检测用任一胎圈基法或个体的检测方法电动车辆的整体的处理方案。个别检测用流式细胞仪可以很好地用于分析较大的电动车，但大多数流式细胞仪不能够单独检测颗粒小到外来体电动车。甲珠为基础的方法，能够检测小电动汽车，但是，也有使用这种方法相关联的缺点，如表1所述。通常，使用超速离心（有或没有加入蔗糖梯度分级分离过程的）电动汽车的隔离建议在需要对功能测定电动汽车。超速离心去除杂质，包括血清蛋白，并从等离子，其可以影响功​​能的实验结果的其他可溶性污染物。然而，超离心是耗时的并且可能改变的EV数量和质量^12。

“>预期结果为两个检测测定法描述于图2-3。对于各个检测测定中，所述裂解控制（底行， 图2）用于设置门，用于相应的非裂解的样品（顶行， 图2）。大多数事件应属于EV栅内。象限门不应揭示双阳性事件时在比较的两个标记物通常不会在同一细胞中发现的合适的双参数曲线在图2中示出了标记物CD108a和.......

Discussion

为隔离，治疗和电动汽车的分析两种不同的协议采用两种单独的检测或珠为基础的方式呈现。选择最适当的方法来使用并不总是直截了当，需要样品的理解被测试以及感兴趣的个体的亚群。而且，用于获取细胞仪的灵敏度，必须在选择最合适的方法可以考虑。通常情况下有使用的，而是相结合的方法提供了比单独使用任何一种方法的示例的详细信息没有一个最佳的方案。理想情况下，几种不同的隔离和检测技术，应首先为了开发一个定制的协议，它考虑到了个体细胞仪的性能相对于所研究的特定的EV人口评价。另一种隔离技术，包括超速，蔗糖密度分馏，免疫BEAD分离，色谱法，和亲和纯化^12，而替代的检测方法包括扫描电子显微镜，透射电子显微镜，原子力显微镜，动态光散射，和免疫印迹^8。通过组合不同的技术，在这里提出的方法可以适于以创建协议最适合用于研究各种感兴趣的EV种群。

在一般情况下，使用流式细胞仪可以很好地用于分析较大的电动车，但失去敏感性电动汽车变得越来越小电动车的各个检测。而各个检测在检测大电动汽车更一致，基于珠的检测是检测较大电动汽车和外来体更敏感较不敏感。较大的电动车可以很容易通过后期染.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
LSR II 台式流式细胞仪	BD Biosciences		3 激光器（20 mW 相干蓝宝石 488 nm 蓝色，25 mW 相干 Vioflame 405 nm 紫色和 17 mW JDS 单相氦氖 633 nm 红色）
FACS Diva 软件	BD Biosciences		PC 版本 6.0
FlowJo 软件	Treestar US		Mac 9.6.1 版或 PC 7.6.5
版Sphero Rainbow 荧光颗粒	BD Biosciences	556298	用于调整所有通道电压以保持荧光强度一致性
Ultra Rainbow 荧光颗粒	Spherotech	URFP-10-5	与 Megamix-Plus SSC 珠子一起使用，以确保批次间 EV 门控一致性
Megmix-Plus SSC 珠	Biocytex	7803	用于调整 FSC 和 SSC  电压，以保持运行之间的一致性。也可用于监测流速和公正流速刻度盘，以确保在所有运行中使用相同的流速
AbC 抗小鼠微珠试剂盒	Life Technologies	A-10344	用于补偿控制和阴性 AbC 微珠用于基于微珠的方法
Nonidet P-40 替代品 （NP-40） （CAS 9016-45-9）	圣克鲁斯	SC-281108	用于单个检测方法，仅用于在初始读数后裂解样品，用作阴性对照。原液可以在 PBS 中稀释至 1：10，并在冰箱中储存长达 1 个月。
BD TruCOUNT 管	BD Biosciences 340334		需要绝对 EV 浓度时使用
Ultrafree-MC、GV 0.22 和微量;m 离心过滤装置	Millipore	UFC30GVNB	用于根据大小对 EV 进行染色后清洗和/或分馏 EV
ACD-A	BD Biosciences	364606
Facs 管 12x75 聚苯乙烯	BD Biosciences	352058
50 ml 储液槽 独立包装	Phenix	RR-50-1s
Green-Pak 移液器吸头 - 10 个和微型;l	Rainin	GP-L10S
Green-Pak 移液器吸头 -200 &l	Rainin	GP-L250S
Green -Pak 移液器吸头 - 1,000 个和微型;l	Rainin	GP-L1000S
稳定堆叠 L300 吸头 预灭菌	Rainin	SS-L300S
Pipet-Lite XLS 8 通道 LTS 可调 垫片	Rainin	LA8-300XLS
96 孔组织培养板	E&K Scientific	EK-20180
RPMI 1640 培养基（不含 Hepes）	UCSF 细胞培养设施	CCFAE001	用于基于珠子的检测方法
的培养基 Dulbeccos PBS D-PBS，不含 CaMg，0.2 &微量;m 过滤	UCSF 细胞培养设施	CCFAL003
超速离心管，薄壁，超透明	BECKMAN COULTER INC
PANEL I
CD3 PerCP-Cy5.5	Biolegend	344808	2 µl
CD14 APC-Cy7	Biolegend	301820	2 µl
CD16 V450	BD Biosciences	560474	2 µl
CD28 FITC	biolegend	302906	2 µl
CD152 APC	BD Biosciences	555855	2 µl
CD19 A700	Biolegend	302226	2 & micro;l
面板 II
CD41a PerCP-Cy5.5	BD Biosciences	340930	2 µl
CD62L APC	Biolegend	304810	2 µ
l CD108 PE	BD Biosciences	552830	2 & micro;l
CD235a FITC	biolegend	349104	2 & micro;l
PANEL III
CD11b PE-Cy7	Biolegend	301322	2 µl
CD62p APC	Biolegend	304910	2 µl
CD66b PE	Biolegend	305106	2 和微型;l
CD15 FITC	exalpha	X1496M	5 µl
CD9 PE	Biolegend	555372
CD63 APC	Biolegend	353008
APC-Cy7 Ms IgG2a， κ	生物传奇	400230