方法文章

胚胎小鼠大脑中的条件性遗传跨突触示踪

DOI：

10.3791/52487

⸱

2014年12月22日

 , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, University of Saarland School of Medicine

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用一种双元遗传策略，我们提供了一种详细的神经环路示踪实验方案，适用于在Cre介导的重组后表达互补性跨突触示踪剂的小鼠。由于细胞特异性的示踪剂表达由基因编码决定，本实验方法可在单细胞分辨率下研究小鼠胚胎脑发育过程中神经环路的形成与成熟。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

解剖学路径示踪对于揭示脑与行为之间的关系至关重要。然而，由于目前大多数跨突触示踪方法依赖于立体定位示踪剂注射，因此在胚胎脑发育过程中解析神经回路的形成在技术上具有挑战性。为克服这一问题，我们开发了一种二元遗传策略，用于在小鼠脑中进行条件性遗传跨突触示踪。为此，我们构建了两种互补的基因敲入小鼠品系，可在Cre介导的重组后，从ROSA26位点特异性表达双向跨突触示踪剂大麦凝集素（BL）以及逆行性跨突触示踪剂破伤风毒素C片段。这些小鼠中示踪剂的细胞特异性表达由基因编码，无需机械性示踪剂注射。因此，我们的实验方法适用于研究胚胎小鼠脑中神经回路的形成。此外，由于示踪剂在突触间的传递依赖于突触活性，这些小鼠品系可用于在单细胞分辨率下分析脑发育过程中遗传定义的神经元群体之间的信息传递。本文提供了利用新型ROSA26等位基因在小鼠胚胎中进行跨突触示踪的详细实验方案。我们已应用该技术系统描绘了发育中的雌性小鼠脑中调控生殖轴成熟所依赖的神经回路结构。

引言

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解剖学路径示踪是解析脑与行为关系最常用的工具之一1。神经环路示踪技术的进步使神经科学家能够从基因明确的小鼠神经元群体中追踪神经环路2。尽管技术不断进步，揭示神经环路的形成过程仍然具有挑战性，尤其是在胚胎发育成熟阶段。这是因为迄今为止开发的大多数示踪方法依赖于立体定位注射跨突触示踪剂或基因改造的嗜神经病毒（图1）2,3。虽然这些技术能够实现连接性的空间和时间分辨率，但仍存在若干固有局限性，例如向发育中的脑组织注射示踪剂技术难度较高、注射位点的可重复性差、注射部位可能引发炎症反应，以及最重要的是嗜神经病毒引起的细胞毒性，这些因素限制了它们的应用4。

另一种方法是在基因改造小鼠中将跨突触示踪剂表达为转基因。我们最近改进了该技术，开发出一种双元遗传性跨突触示踪系统，用于绘制任何基因定义神经元群体的神经环路5。我们的实验策略基于两种新的基因敲入小鼠品系，这两种品系在Cre介导的重组后，可在ROSA26位点分别表达双向示踪剂大麦凝集素（barley lectin, BL）6，或表达与GFP融合的破伤风毒素C片段（Tetanus Toxin fragment C fused to GFP, GTT）这一逆向示踪剂7。本文中，我们利用这些小鼠品系在表达kisspeptin的神经元中选择性地....

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方案

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注意：伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得汉堡大学和萨尔兰大学动物福利委员会的批准。

1. 胚胎组织的制备与固定

  1. 在处死动物前，准备好解剖胚胎所需的所有设备，并配制后续组织固定的溶液。
    注意：务必现配新鲜的 4% 多聚甲醛（PFA）溶液（4% PFA 溶于 0.1 M 磷酸盐缓冲液（PBS）中，调节 pH 至 7.4）。
  2. 采用符合伦理批准的方法处死定时妊娠的雌性小鼠。
  3. 将小鼠转移至操作平台，用 70% 乙醇润湿腹部腹侧，使用锋利剪刀做垂直切口，暴露腹腔。
  4. 识别胚胎串，用钝头镊子小心将其拉出，并放入冰上预冷的 PBS 中。
  5. 使用精细剪刀和镊子从胚胎串中分离各个胚胎，去除胚胎周围的多余组织，并在冰上预冷的 PBS 中清洗胚胎。
  6. 在将胚胎转移至 PFA 溶液前，取少量尾部组织样本，放入尾部裂解缓冲液中，用于性别鉴定及示踪等位基因的 PCR 基因分型。
  7. 从最外侧的胚胎开始，将每个胚胎分别转移至含有冰上预冷 4% PFA 的离心管中，并置于摇床上。
  8. 对于 E13.5 及更早期的胚胎，在冰上持续摇动浸泡 1.5 小时；对于 E14.5 和 E15.5 期胚胎，在冰上持续摇动浸泡 2.5 小时。
  9. 对于 E16.5 及更晚期的胚胎，在浸泡前需先断头并去除外部皮肤，再将头部浸入 PFA 溶液中。....

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结果

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本部分展示了使用该方法可获得的代表性结果 R26-BIZ（BL-我RES-τlacZ) 以及 R26-GTT（G荧光偏振-TTC) 等位基因。在此我们使用 R26-BIZ 以及 R26-GTT 等位基因以分析调控生殖轴的神经回路的成熟过程。脊椎动物的生殖活动主要由下丘脑中一小群神经元中枢调控，这些神经元分泌促性腺激素释放激素（GnRH）。Kisspeptin 是 GnRH 神经元的强效激活剂，已被证实参与调控 GnRH 神经元的活性，然而在发育中的雌性小鼠大脑中，GnRH 神经元与 kisspeptin 神经元之间的神经回路何时建立尚不清楚5首先，我们证明BIZ和GTT转基因的表达在胚胎期弓状核（ARC）的吻素神经元中，可特异性地通过Cre依赖性重组被激活。图2使用特异性Kiss.......

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讨论

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与立体定位注射示踪剂或嗜神经病毒相比，将跨突触示踪剂作为转基因表达以追踪基因定义神经元群体的神经环路具有多项优势。首先，示踪剂作为内源性蛋白产生，因此不会引发任何免疫反应，并且可在不同动物中高重复性地分析特定神经通路。其次，由于该方法为非侵入性，可用于追踪难以通过立体定位注射接近的神经元环路，例如在子宫内（in utero）的神经元。其局限性包括跨突触传递效率普遍较低，可能导致示踪剂检测困难。此外，示踪分子在每次突触传递过程中都会被稀释。相比之下，嗜神经病毒可在细胞内复制，病毒在跨越突触后的复制过程可实现信号放大。然而，病毒复制也会导致固有的病毒细胞毒性，这是使用嗜神经病毒的主要局限之一。遗传性跨突触示踪剂与基因改造的嗜神经病毒的一些特性比较见表1。

在Cre介导的重组条件下，R26-BIZ 和 R26-GTT 等位基因相互补充，有助于对遗传学上明确的神经元群体的神经环路进行可视化。R26 启动子已被充分表征，可介导广泛但强度适中的表达11,12。采用高灵.......

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致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢 Michael Candlish 对本文手稿提出的宝贵意见。本项目得到了德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft）资助，资助编号为 BO1743/6 以及 SFB/TRR 152 P11 和 Z02，授予 Ulrich Boehm。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
双苯并咪唑（Hoechst 33258 染料）Sigma14530-100MG
乙醇Sigma32205-1L
冷冻模具（Peel-a-way）Polyscience Inc.18646A-122 x 22 x 20mm
DMSOSigmaD8418-100ML
二甲基甲酰胺（DMF）VWR Chemicals23470,293
EGTAROTH3054.3
Fluoromount GSouthern Biotech0100-01
戊二醛SigmaG5882-50ML
过氧化氢Sigma34988-7
异戊烷（甲基-2-丁烷）SigmaM32631-2.5L
Kaiser's 甘氨酸明胶Merck1092420100
甲醇Sigma494437-1L
MgCl2SigmaM2670-100G
NaClROTHHN00.2
NBTSigma298-83-9
Nonidet P40 替代品Fluka743.85
OCTLeica14020108926
PAP 笔DakoS2002
多聚甲醛SigmaP6148-1KG
脱氧胆酸钠SigmaD6750-25G
蔗糖SigmaS7903-1KG
Superfrost 载玻片Thermo ScientificFT4981GLPLUS
TSA 试剂盒PerkinElmerNEL700
TSA plus 试剂盒PerkinElmerNEL749A001KT
TrisROTHAE15.2
Triton-X 100ROTH3051.2
Tween 20ROTH9127.1
X-galROTH2315.1
冷冻切片机Leicana
配备微分干涉（DIC）成像系统的光学显微镜ZeissAxioskop2 配备 Axio Vision 软件
荧光显微镜ZeissAxioskop2 配备 Axio Vision 软件
PhotoshopAdobePS6
山羊抗 WGA 抗体（识别 BL）Vector LaboratoriesAS-2024
生物素标记的马抗山羊 IgGVector LaboratoriesBA-9500
生物素标记的山羊抗兔 IgGVector LaboratoriesBA-1000
兔抗 GFP 抗体（识别 GTT）InvitrogenA11122
兔抗 GnRH 抗体Affinity Bio ReagentPA1-121
Dylight488 标记的驴抗兔 IgGThermo ScientificSA5-10038
SA-Alexa Fluor 546Life TechnologiesS-11225
引物
BL 正向引物（用于 BIZ 基因分型）Eurofins MWG OperonATGAAGATGATGAGCACCAGGGC
BL 反向引物（用于 BIZ 基因分型）Eurofins MWG OperonAGCCCTCGCCGCAGAACTC
Cre 正向引物（用于 Cre 基因分型）Eurofins MWG OperonGTCGATGCAACGAGTGATGAGGTTCG
Cre 反向引物（用于 Cre 基因分型）Eurofins MWG OperonCCAGGCTAAGTGCCTTCTCTACACCTGC
TTC 正向引物（用于 GTT 基因分型）Eurofins MWG OperonAGCAAGGGCGAGGAGCTGTT
TTC 反向引物（用于 GTT 基因分型）Eurofins MWG OperonGTCTTGTAGTTGCCGTCGTCCTTGAA
XY 正向引物（用于性别基因分型）Eurofins MWG OperonTGAAGCTTTTGGCTTTGA
XY 反向引物（用于性别基因分型）Eurofins MWG OperonCCGCTGCCAAATTCTTTG
ROSA26 正向引物Eurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC
ROSA26 反向引物Eurofins MWG OperonGCAGATGGAGCGGGAGAAAT
SA 反向引物Eurofins MWG OperonCGAAGTCGCTCTGAGTTGTTATC

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Vercelli, A., Repici, M., Garbossa, D., Grimaldi, A. Recent techniques for tracing pathways in the central nervous system of developing and adult mammals. Brain. Res. Bull. 51, 11-28 (2000).
  2. Huang, Z. J., Zeng, H. Genetic approaches to neural circuits in t....

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重印与许可

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Cre ROSA26 C

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