生成和使用人诱导多能干细胞来源的神经前体细胞用于神经系统疾病研究的指南

摘要

本方案描述了如何将人诱导性多能干细胞分化为神经前体细胞，以获得稳定且具有增殖能力的神经细胞群体，可用于鉴定多种神经系统疾病发病机制中涉及的发育通路。

摘要

神经疾病的尸检研究并不适合确定疾病发生的根本原因，因为许多疾病在症状出现之前已有很长的疾病进展期。由于患者的成纤维细胞和健康对照者的成纤维细胞均可高效重编程为人类诱导性多能干细胞（hiPSCs），并进一步分化为神经前体细胞（NPCs）和神经元以用于这些疾病的研究，因此现在有可能重现患者在症状出现之前所发生的发育事件。本文介绍一种高效将hiPSCs分化为NPCs的方法，这些NPCs不仅能够进一步分化为功能性神经元，还可稳定传代、经受冻融处理或转换为神经球形式培养，从而实现快速遗传筛选，以鉴定影响细胞表型（包括增殖、迁移、氧化应激和/或凋亡）的分子因子。由患者来源的hiPSC分化而来的NPCs是一种独特的研究平台，特别适用于对基因表达调控所导致的细胞或分子效应进行实证检验。

引言

神经元分化后的基因表达研究 体外 由我们从人诱导性多能干细胞（hiPSCs）获得 ¹ 及其他人 ^2,3 表明hiPSC神经元更类似于胎儿而非成年脑组织。目前，基于hiPSC的模型可能更适合研究神经系统疾病的易感性，而非其晚期特征。我们此前曾报道，精神分裂症患者来源的hiPSC神经元中，有显著比例的基因表达特征在精神分裂症患者来源的hiPSC衍生神经元中是保守的 神经前体细胞（NPCs），表明NPCs可能是研究导致精神分裂症的分子通路的一个有用细胞类型 ¹我们及其他研究者已报道，在精神分裂症的hiPSC来源的神经前体细胞（NPCs）中存在异常迁移、氧化应激与活性氧物质增加、对亚阈值环境应激的敏感性升高以及线粒体功能受损。 ^1,4-6以及精神分裂症hiPSC神经元中神经元连接性和突触功能的降低 ^5,7-10如果导致精神分裂症患者hiPSC来源的神经前体细胞（NPCs）异常迁移和/或氧化应激的分子因素，同样也是精神分裂症hiPSC来源神经元中神经连接减少的基础，那么NPCs可能是一种稳健且具有高度增殖能力的神经细胞群体，可用于研究疾病发生机制。此外，由于能够快速获得大量细胞，且无需等待数周或数月的神经元成熟过程，基于NPC的检测方法适用于更大规模的患者队列研究，并更易于进行高通量筛选。我们认为，hiPSC来源的NPCs可作为研究潜在致病发育通路的替代模型，这一点已在包括精神分裂症在内的多种不同疾病中得....

方案

1. 人类诱导多能干细胞向神经前体细胞的分化

1. 在人胚胎干细胞（HES）培养基（表1）中培养和扩增hiPSCs，该细胞与小鼠胚胎成纤维细胞（mEF）饲养层共培养，直至形成较大但未融合的克隆，可用于通过拟胚体（EB）中间阶段进行神经分化（图2）。常规hiPSC培养条件已在其他文献中详细描述^16,17；简而言之，将hiPSCs在mEF饲养层上用HES培养基培养至融合状态，然后使用胶原酶（1 mg/ml溶于DMEM）进行酶法传代，每7天约以1:3比例扩增一次。
2. 为制备多聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的培养板，使用无菌水配制10 μg/ml多聚-L-鸟氨酸（塑料表面）或50 μg/ml（玻璃表面）包被培养板，在室温下孵育3–24小时。至少用无菌水洗涤一次后，再用无菌PBS配制的5 μg/ml层粘连蛋白在室温下包被3–24小时。
   注意：若用塑料膜包裹，培养板可在-20 ºC保存长达六个月。
3. 第1天，使用1 mg/ml IV型胶原酶溶于DMEM/F12中，将未融合的hiPSCs（通常在mEF上培养，或在Matrigel上使用TeSR¹⁸等无血清培养基培养的hiPSCs）以大克隆形式从培养板上酶法剥离。
   注意：在37 ºC孵育1–2小时后，克隆将漂浮于培养皿中。
4. 轻柔地用DMEM/F12洗涤hiPSC克隆1–2次（通过自然沉降....

结果

神经玫瑰花环可通过明场显微镜根据其典型的形态学特征进行识别，表现为具有顶-基极性的神经上皮细胞组成的圆形簇状结构（图1）。尽管神经前体细胞（NPCs）通常在极高细胞密度下培养，但在传代后立即观察，可见略呈金字塔形的胞体以及双极神经突结构（图1D）。经验证的NPCs在大多数细胞中表达NESTIN和SOX2，同时在所有NPC群体中也可观察到βIII-TUBULIN染色，表明部分NPC在培养过程中持续启动神经元分化（图1F）。NPCs表达神经干细胞标志物（如SOX2和PAX6）以及前脑神经前体细胞标志物（如TBR2），而不表达中脑标志物（如LMX1A和FOXA2）（图1G-I）。若NPC群体中存在大量扁平的成纤维细胞样细胞，则提示获得了质量较差的NPCs，这些细胞在后续神经元分化过程中难以产生大量神经元（图2）。

在使用高滴度的慢病毒或逆转录病毒载体成功转导后，应有超过80%的细胞被载体中包含的荧光报告基因标记（

讨论

我们已描述了将人诱导多能干细胞（hiPSCs）分化为神经前体细胞（NPCs）的方法。NPC是一种神经细胞类型，其中保留了相当一部分hiPSC来源神经元的基因表达特征，并可作为可能参与疾病发病机制的发育通路的替代模型^8,11。此外，正如我们所详述的，NPC具有强健的增殖能力且易于进行基因转导，我们认为其可能适用于疾病易感性的分子与生化研究。

尽管我们已有详细的方案用于分化和培养前脑模式化的神经前体细胞（NPCs），但这些方法可轻松调整以生成具有其他细胞命运模式的NPCs。例如，若先用0.5 mg/ml DKK1、10 mM SB431542、0.5 mg/ml Noggin和1 mM环杷明（cyclopamine）处理悬浮的胚胎体（EBs），则可生成海马体模式化的NPCs，这些细胞可在NPC培养基中扩增，并在补充20 ng/ml WNT3A的神经元分化培养基中进一步分化⁷。或者，通过以100 ng/ml SHH C25II、2 μM Purmorphamine、100 μg/ml FGF8和3 μM CHIR99021替代FGF2，可将NP.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	用于HES培养基
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	用于神经培养基
KO-血清替代物	Life Technologies	#10828	需进行批次测试
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	需进行批次测试
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	需进行批次测试
FGF2	Life Technologies	#13256-029	用PBS + 1% BSA重悬
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	用PBS + 0.1% BSA重悬
GDNF	Peprotech	#450-10	用PBS + 0.1% BSA重悬
二丁酰环磷酸腺苷	Sigma	#D0627	用PBS + 0.1% BSA重悬
L-抗坏血酸	Sigma	#A0278	用H2O溶解
STEMdiff神经类球选择试剂	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	Innovative Cell Technologies	AT-104
IV型胶原酶	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
多聚-L-鸟氨酸	Sigma	P3655
天然小鼠层粘连蛋白，1 mg	Life Technologies	#23017-015
BD Matrigel	BD	#354230	在冰上用冷DMEM以10 mg/ml浓度重悬，每两个6孔板等效面积使用1 mg
组织培养处理的6孔板	Corning	3506
超低吸附6孔板	Corning	3471
山羊抗Sox2	Santa Cruz	sc­17320	使用稀释比为1:200
小鼠抗人Nestin	Millipore	MAB5326	使用稀释比为1:200
兔抗βIII-微管蛋白	Covance	PRB­435P	使用稀释比为1:500
小鼠抗βIII-微管蛋白	Covance	MMS­435P	使用稀释比为1:500
小鼠抗MAP2AB	Sigma	M1406	使用稀释比为1:200
板式离心机	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14（配备SX4750板架）