指南生成和使用hiPSC派生的NPC的神经系统疾病的研究

摘要

该协议描述了神经祖细胞如何从人类诱导的多能干细胞中分化出来，以产生一个强大的和可复制的神经细胞群，这可用于识别导致许多神经系统疾病发病机制的发育途径。

摘要

神经系统疾病的尸检研究并不适合确定疾病发作的根本原因，因为许多疾病在症状出现之前包括长期的疾病进展。由于来自患者和健康对照者的成纤维细胞可以有效地重编程为人诱导的多能干细胞 （hiPSC），随后分化为神经祖细胞 （NPC） 和神经元以研究这些疾病，因此现在可以概括患者症状出现前发生的发育事件。我们提出了一种有效地将 hiPSC 分化为 NPC 的方法，该方法除了能够进一步分化为功能性神经元外，还可以稳健地传代、冻融或过渡为神经球生长，从而能够快速进行遗传筛选以识别影响细胞表型的分子因素，包括复制、迁移、氧化应激和/或细胞凋亡。患者来源的 hiPSC NPC 是一种独特的平台，非常适合对纵基因表达的细胞或分子后果进行经验测试。

引言

神经元由我们¹ 体外分化自人类诱导多能干细胞（人iPS细胞）和其他^2,3的基因表达的研究表明，神经元hiPSC类似于胎儿，而不是成人脑组织。目前，hiPSC为基础的模型可能更适合于易感性的研究，而不是最近的功能，神经系统疾病。我们以前曾报道，精神分裂症hiPSC衍生的神经元的基因标记的显著馏分保守精神分裂症hiPSC源性神经祖细胞（NPC的），这表明的NPC可能是一种有用的细胞类型用于研究分子途径促成精神分裂症¹ 。我们和其他人已经报道异常迁移，增加的氧化应激和活性氧，灵敏度到亚阈值的环境压力和在精神分裂症受损线粒体功能hiPSC的NPC ^1,4-6，以及减小神经Çonnectivity和精神分裂症hiPSC神经元突触^5,7-10功能。如果分子因素在精神分裂症hiPSC的NPC有助于异常迁移和/或氧化胁迫也背后精神分裂症hiPSC衍生的神经元的减少神经连接性，NPC的可能是一个强大的和高度复制神经元群，用以研究负责疾病的机制。此外，由于可以迅速地产生大量的细胞，并且不需要等待数周或数个月的神经元成熟，鼻咽癌基测定法适用于较大的患者群的研究，并且更适合于高通量筛选。我们相信，hiPSC的NPC可以作为可能造成疾病的发病机制的发育途径的代理，如已被证明在疾病等不同精神分裂症¹和亨廷顿氏病^11。

从人iPS细胞，在最初的神经分化的NPCduction由双SMAD抑制（0.1mM的LDN193189和10毫^{SB431542）12}完成。通过拮抗骨形态发生蛋白和TGF与这些小分子信令，内胚层和中胚层规范被阻塞，加速神经元分化，并导致的可见神经花环形成电镀的一个星期内。神经形成发生在这一过程的早期，在神经花环形成，随后立即期间大概。在没有其他线索，这些原始神经细胞承担前端脑样的命运^13。紧随其后的神经花环形成，并在整个NPC不断扩大，前脑的NPC与FGF2 ^8,14培养。它们具有双重谱系的潜力，并且可以分化为70-80％III微管蛋白阳性的神经元和20％-30％胶质纤维酸性蛋白（GFAP）阳性的星形胶质细胞（ 图1）的神经种群。大多数脑hiPSC神经元是VGLUT1阳性等等都是推测谷氨酸，尽管神经元的大约30％是GAD67阳性（GABA能^）8。

NPC的例行传代在体外的十倍以上，同时保持一致分化型材，和没有积累核型异常。组报道传代的NPC超过40倍^15，然而，我们发现，超过10通道，NPC的显示增加倾向星形胶质细胞分化。 NPC的良好耐受多次冷冻 - 解冻，并且可以转换通过简单地在培养非粘附板成长为神经球。的NPC用病毒载体转导的效率，从而使遗传扰动的分子和细胞后果快速评估，并易于扩展，以产生足够的材料用于生化研究。另外，因为病毒载体容许鲁棒过度表达和/或与疾病相关的基因敲除，在对照或患者来源neur人的细胞，可以使用这个平台来测试对这些操作的遗传背景的影响。虽然不适合突触或基于活动的检测需要成熟的神经元，NPC的可能是来自患者的神经细胞的许多简单的分子或生化分析一个实际的选择。

方案

1. hiPSC分化为神经前体细胞

1. 发展和扩大在人胚胎干细胞人iPS细胞（HES）培养基（ 表1）共培养上的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）饲养层，直到大（但汇合）菌落准备神经分化经由胚状体（EB）的中间（ 图2）。常规hiPSC培养条件是公别处^16,17描述简单地说，生长在HES媒体人iPS细胞在MEF饲养层，直到融合，然后通过酶胶原酶（1mg / ml的DMEM中），并扩大约为1：3，每7天。
2. 在无菌水中塑料表面制备聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板，涂层板用10μg/ ml的聚-L-鸟氨酸（50μg/ ml的玻璃表面）并在室温下孵育3-24小时。用无菌水，然后涂上5克/ ml的层粘连蛋白洗至少一次在无菌PBS在RT 3-24小时。
   注意：如果包裹在塑料，板材可贮存长达六个月-20 C。
3. 在第1天，酶解除从板一样大菌落中的DMEM / F12利用1mg / ml的胶原酶IV汇合人iPS细胞（通常生长在MEF中，或人iPS细胞在限定培养基如TESR ¹⁸上生长的基质胶）。
   注：继37ºC1-2小时的潜伏期，殖民地将会漂浮在菜。
4. 轻轻洗hiPSC菌落（通过沉降，离心分离不）1-2x用DMEM / F12，重悬在2毫升/孔的N 2 / B27培养基（ 表1），并转移到非粘附6孔培养皿（结合3-井成1- -嗯^）19。
   注：一夜之间，菌落形成浮动球团称为“胚体”（EBS）。预计大量的细胞死亡。
5. 第2天，倾斜板，并允许胚解决。小心地取出媒体和DMEM / F12洗一次，清除杂物。饲料用N2 / B27媒体辅以双SMAD抑制剂（0.1M LDN193189和10M ^{SB431542）12} 。
6. 关于天3-7，neuralization将发生在双SMAD抑制的上下文中检查胚是圆的，但不是囊。订阅的EB每隔一天用补充有0.1M LDN193189和10M SB431542 N 2 / B27培养基。
7. 在7-14天，下列的EB电镀聚L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂层板，检查使用明显微镜神经花环开始在几天之内出现。（定性为圆簇神经上皮细胞apico - 基底极性的; 图1）。继续喂粘附的EB每隔一天用N 2 / B27培养基补充有0.1M LDN193189，10M SB431542和1μg/ ml的层粘连蛋白。

神经玫瑰花奖2丰收

注：我们建议的神经花环使用神经玫瑰花选择试剂²⁰或类似的选择试剂酶收获。虽然神经花环可以手动挑入6孔聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的平板，THI方法论需要大量的训练来掌握，而且，依赖于用户的技术，可能需要第二轮采摘20天，以进一步丰富了筹备和消耗非神经细胞类型。

1. 对于在第14天的酶的选择神经花环，从附着的EB抽吸媒体和加入1 ml，每孔神经花环选择试剂的一个6孔板。在37ºC1小时。
2. 随着P1000的Pipetman，轻轻地从每孔除去酶。加入1毫升每孔的DMEM / F12的洗。
3. 与P1000，收集1毫升DMEM / F12，并迅速排出DMEM / F12回入井，从而分离从板块的花环。收集到玫瑰花猎鹰管。
4. 吸取的另一个1毫升DMEM / F12，并迅速排出到同一以及分离剩余花环。 （不要磨碎，尽量不要分手花环聚集）。收集神经花环成相同的猎鹰管。
5. 重复步骤需要2.4。如果花环不容易分离，添加钼重新酶和重复上述过程（步骤2.1-2.4）
6. 旋转细胞在300×g离心3分钟。吸洗，并重新暂停2毫升NPC媒体（ 表1）花环。转移的细胞（1：1）到聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的6孔板中。
7. 从15-21天，神经花环将扩大;饲料花环每隔一天与NPC媒体。
8. 评价神经花环的质量，并确保扁平成纤维细胞样细胞不培养内扩大。
   注意：如果不坚持花环，全国文化有时可以通过人工采摘打捞上来，只选择最好的采摘玫瑰花成的Accutase。分离15分钟，在37ºC。颗粒，洗净，板NPC媒体到24孔聚L-鸟氨酸/层粘连蛋白涂层板。

3.扩大神经祖细胞

注：hiPSC的NPC可以生长在任Matrigel-或聚-L-鸟氨酸/层粘连蛋白包被的板。我们通常使用Matrige升感光板，因为它们可以更快速地制备并以更低的成本。

1. 为了制备基质胶包被的板，快速解冻，重悬基质胶的1mg的冷冻等分试样以24毫升冷的DMEM / F12，并立即分发两个六孔板2毫升至每个孔中。孵育至少1小时，在37ºC。
   注：基质胶仅需要被吸入，而不是洗涤，在使用前立即。
2. 饲料的NPC每隔一天，并以极高的密度保持或他们就会自发地分化为神经元。
   注：虽然更成熟的NPC一般分为1：每周4，极低的通道的NPC可以被分割1：2的次数，每两周一次。
3. 分裂，第一抽吸媒体和加入1毫升温的Accutase（1X）每6孔板井。在37ºC10-15分钟。
4. 分离的细胞轻轻转移到15毫升管含有DMEM / F12用尽可能少的机械应力成为可能。不要滴定细胞，而酶。颗粒细胞spinni在1000×g离心纳克5分钟。
5. 吸洗，并在〜1毫升NPC媒体重新挂起的NPC每原井的6孔。
   注：期望6孔培养皿的汇合阱具有5-10百万个细胞;这可以通过用血细胞计数之前重新电镀计数细胞的10升等分来确认。
6. 下面再悬浮，重制版的NPC作为NPC的，神经元或神经球。以保持的NPC，板每一个6孔板的大约1-2百万个细胞。的神经球的形成效率可以实验和细胞系之间有所不同，但一般发生最好之间200000和百万细胞每一个非粘附6孔板的井接种;如果神经球的聚集发生，降低细胞接种的数量。分化为神经元，板约200000每一个6孔板的细胞中，与神经元的媒体替换鼻咽癌介质。
7. 免疫组化验证每个NPC建立行。一旦有足够的多孔材料一直EXPANDED，标签的NPC与抗体NESTIN和SOX2。验证NPC线也应该分化成神经元4-6周，并标有抗体III微管蛋白和MAP2AB。
   1. 固定的细胞在PBS中的4％多聚甲醛在4℃下10分钟。透的NPC在RT在1.0％的Triton的PBS中15分钟，然后在5％驴血清阻滞与0.1％的Triton在RT 30分钟。
   2. 孵育在5％驴血清初级抗体用0.1％的Triton，于4℃过夜。
      注意：我们推荐以下抗体：羊抗SOX2，1：200;小鼠抗人巢蛋白，1：200;兔抗βIII微管蛋白，1：500;小鼠抗βIII微管蛋白，1：500;小鼠抗MAP2AB，1：200。 （ 图2）。
   3. 以下用PBS洗涤，孵育二级抗体的细胞与合适的共轭次级抗体山羊，小鼠或兔1：300，在5％驴血清和0.1％的Triton为1-2小时，在室温。为了显现细胞核，染色的细胞用0.5微克/毫升的DAPI（4'，6-二脒基-2-苯基吲哚），然后装入带的Vectashield。

4.全国人大转导

1. 使用spinfection（细胞培养板离心中病毒的存在下，在1000×g离心1小时），以增加转染的细胞²¹的百分比。抽吸培养基并替换为相关过表达（或控制）慢病毒（或反转录病毒），滴定感染的所需复数（MOI）（通常为1-10），稀释在鼻咽癌介质。使用每一个6孔板的孔1.5ml体积（或其他类型的组织培养板中的适当缩放体积）。旋在1000×g离心37ºC1小时在平板离心机。
   注意：理想情况下，在1-2天内分裂转导的NPC与慢病毒或逆转录病毒载体。是否使用商业或实验室制备的病毒，也可以是有帮助的通过连续稀释至适当滴度的病毒的批次提前。 （ 图3）。
2. 为了减少CEL细胞性死亡，在spinfection 8小时更换介质。
   注：病毒整合和转基因的表达应该是在24小时内报告基因的荧光检测。 （如果病毒缺乏荧光报道，这是更难以评估;成功的转染可以最好地通过免疫印迹，免疫组织化学或定量PCR对表达产物进行验证。）全部表达可能需要3-7天;可能需要重复spinfections与其他病毒以提高转染的细胞的百分比。复发性spinfections每天可以发生，但不必如此频繁。理想情况下，如果使用的是荧光报道，> 80％的细胞应被标记。

5.神经球迁移实验

注：神经球形式自发，以下的NPC的酶解（通过等同于在鼻咽癌膨胀中使用的方式 - 步骤3.3-3.6），如果细胞是在悬浮液中鼻咽癌培养基中培养。

1. 简单地说，长大分离在鼻咽癌媒体48小时在非粘附板ð的NPC，以便产生神经球。 （ 图4）。
2. 为神经球迁移，采用冷鼻咽癌媒体，而不是培养基，在96孔板中，以神经球采摘前1-2小时制备的新鲜基质胶板。不要从油井吸基底膜。
3. 最初公布的胚胎干细胞衍生的神经球^22，手工挑NPC来源的神经球在显微镜下，在全国人民代表大会媒体清洗一次，以去除细胞碎片之后。传送一个神经球到基质胶包被的96孔板的每个孔中。
4. 添加额外的0.5毫克的Matrigel，稀释于冷鼻咽癌媒体，向神经球在每个96孔板中。
5. 手动居中每个单独的神经球在使用吸管尖阱的中间。
   注意：挑大小相似的神经球，以减少可变性的结果是很重要的。
6. 允许迁移发生48小时，然后修复细胞瓦特第i个4％多聚甲醛和染色与期望的免疫组织化学标记。
7. 如果放射状迁移要确定自己完全采用4倍显微镜物镜，照片神经球。排除任何神经球接触所述井的边缘或从分析的第二神经球。
   注意：如果发生的时间超过48小时的迁移，采用了4倍物镜所得径向迁移可能会过大，以图像。
8. 测量从用NIH ImageJ的软件（ 图5）的每个神经球平均迁移。这可以使用任何一种下面描述的分析方法来完成：
   1. 放射状迁移：
      1. 手动追踪使用徒手选择工具然后使用测量（CTRL + M）函数来计算得到的形状的区域中的最远迁移细胞的边缘。前测量的面积确保区域在分析选项卡下设置测量窗口进行检查。使用面积测量与方程为一个圆（A ^=πR2）的面积的值来确定所述半径（外）。
      2. 跟踪原始神经球的边缘，测量面积，并计算半径（内）以相同的方式。计算总径向迁移作为外半径和内半径之间的差异。
   2. 最大的细胞迁移：
      1. 测量采用直线选择工具其次是测量（按Ctrl + M）功能从内神经球的边缘移动的五个细胞最远的距离。

结果

神经花环可以形态被识别，使用明场显微镜，由它们的特征外观圆形簇神经上皮细胞apico -基底极性（ 图1）的。虽然筹备通常培养在非常高的细胞密度，紧接传代，略呈锥体形体躯和双极突起结构是可见的（ 图1D）。验证的NPC表达巢蛋白和Sox2在大多数细胞中，虽然III微管蛋白染色也是可见在所有鼻咽癌群体，这表明的NPC的一些比例都在不断的培养物（ 图1F）内引发神经元分化。神经干细胞，如SOX2和PAX6，和前脑的神经元祖细胞，如TBR2的标记物，也都表示在筹备，而脑标记如LMX1A和FOXA2不是（ 图1G-1）。内的显著的比例大而扁平的成纤维细胞样细胞一个NPC人口表示质量差的NPC已经产生，这是不太可能产生以下的神经元分化（ 图2）大量的神经元。

在成功转导有高滴度慢病毒或逆转录病毒载体，大于80％的细胞应被标记由荧光报道包含在载体（ 图3）。神经球代应该产生相对均匀的大小的神经...

讨论

我们已经描述了通过该分化人iPS细胞的NPC成，神经细胞类型，其中hiPSC衍生的神经元的基因标记的显著分数是保守，并且可以作为一个代理可能造成疾病的发病机制⁸的发育途径的方法^{， 11。}此外，正如我们已经详细介绍，NPC的是一个稳健的复制和转导容易神经元群，我们相信这可能是用于疾病易感性的分子和生化研究。

虽然我们已经详细方法分化和培养前脑图案化的NPC，他们可以很容易地适用于产生的NPC构图以其他细胞命运。例如，如果浮置的EB首先用0.5毫克/毫升DKK1，10毫SB431542，0.5毫克/ ml成头蛋白和​​1mM的环巴胺，海马的NPC将生成可以在鼻咽癌媒体进行扩展并分化在补充有20纳克神经介质/ ml的WNT3A ⁷ 。或者，通过用100ng / ml的Shh的C25II，2M嘌吗啡胺，100代替FGF2微克/毫升FGF8和3M CHIR99021，NPC的可交替地图案化以脑多巴胺能命运，能够产生富含FOXA2-和酪氨酸羟化酶阳性多巴胺能神经元群体的神经细胞^12,23。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM/F12	Life Technologies	#11330	用于 HES 培养基
DMEM/F12	Life Technologies	#10565	用于神经培养基
KO-Serum 替代	Life Technologies	#10828	需要进行批次测试
Glutamax	Life Technologies	#35050
NEAA	Life Technologies	#11140
N2	Life Technologies	#17502-048	需要进行批次测试
B27-RA	Life Technologies	#12587-010	需要进行批次测试
FGF2	Life Technologies	#13256-029	在PBS + 1% BSA中重悬
LDN193189	Stemgent	#04-0074
SB431542	Stemgent	#04-0010
BDNF	Peprotech	#450-02	在 PBS + 0.1% BSA
GDNF 中重悬	Peprotech	#450-10	重悬于 PBS + 0.1% BSA
二丁酰环状 AMP	Sigma	#D0627	重悬于 PBS + 0.1% BSA
L-抗坏血酸	Sigma	#A0278	悬于 H20
STEMdiff 神经玫瑰花选择试剂	Stemcell Technologies	#05832
Accutase	InnovativeCell Technologies	AT-104
原酶IV	Life Technologies	#17104019
CF1 mEFs	Millipore	#PMEF-CF
Poly-L-Ornithine	Sigma	P3655
粘连蛋白，天然小鼠1毫克	Life Technologies	#23017-015
BD基质胶	BD#	354230	在冷 DMEM 中以 10 mg/ml 的浓度重悬于冰上，每两个 6 孔板当量使用 1 mg
组织培养处理的 6 孔板	康宁	3506
超低吸附 6 孔板	康宁	3471
山羊抗 Sox2	圣克鲁斯	sc­17320	以 1：200
小鼠抗人 Nestin	Millipore	MAB5326	以 1：200
兔抗 β 使用;III-微管蛋白	Covance	PRB­435P	以 1：500 的
比例使用小鼠抗 β;III-微管蛋白	Covance	MMS­435P	以 1：500 小鼠
抗 MAP2AB	Sigma	M1406	以 1：200
板离心机	Beckman Coulter	Beckman Coulter Allegra X-14（带 SX4750 板载体）