质谱技术在冻干粉末中研究蛋白质结构与相互作用的应用

摘要

本文介绍了针对固态粉末中蛋白质的固态酰胺氢/氘交换质谱法（ssHDX-MS）和固态光解标记质谱法（ssPL-MS）的详细实验方案。这些方法可提供非晶态固态中蛋白质构象及其相互作用的高分辨率信息，可能对制剂设计具有重要意义。

摘要

酰胺氢/氘交换（ssHDX-MS）和侧链光解标记（ssPL-MS）结合质谱分析，可用于表征蛋白治疗药物的冻干制剂，具有重要价值。在进行标记后，再辅以适当的蛋白酶消化，可实现对蛋白质结构和相互作用的肽段水平定位。由于蛋白质的结构单元由氨基酸主链和侧链形成的化学键网络所稳定，因此对氨基酸残基中特定原子的标记可提供有关蛋白质结构与构象的信息。与常规用于研究冻干固态蛋白的方法（例如，FTIR）相比，ssHDX-MS 和 ssPL-MS 能提供定量且位点特异性的信息。氘掺入程度及动力学参数可关联到快速和慢速交换的酰胺池（N_fast，N_slow），并直接反映冻干制剂中蛋白质折叠和结构的程度。稳定的光解标记不会发生反向交换，这是相较于 ssHDX-MS 的一项优势。本文中，我们以肌红蛋白（Mb）为模型蛋白，针对含有海藻糖或山梨醇的冻干制剂，详细描述了 ssHDX-MS 和 ssPL-MS 两种方法的实验方案。

引言

蛋白质药物是生物制药行业中发展最快的领域，为治疗以往难以攻克的疾病（包括内分泌紊乱、癌症和自身免疫性疾病）提供了极具前景的新疗法¹2012年，全球生物治疗药物市场达到1380亿美元，预计到2018年将达到1790亿美元。²蛋白质比传统的小分子药物更大且更脆弱，因此更容易发生多种类型的降解³为确保足够的保质期和稳定性，蛋白质药物通常被制成冻干粉（lyophilized即，冷冻干燥的）固体粉末。然而，蛋白质在固态下仍可能发生降解，特别是如果其天然结构在冻干过程中未能得到保持时^4,5只有当存在能够以足够分辨率探测固态蛋白质构象的分析方法时，才能确保结构得以保留。

核磁共振波谱法⁶和X射线晶体学⁷是常用于在溶液和结晶固体中评估蛋白质结构的高分辨率方法⁸。由于辅料的性质及所采用的加工方法，冻干蛋白制剂通常为非晶态而非晶态⁹。缺乏均一性和微观有序性使得上述技术在分析非晶态固体中的蛋白质时难以适用。傅里叶变换红外光谱法（FTIR）¹⁰、拉曼光谱法¹¹和近红外光谱法（NIR）¹²已被生物制药行业广泛用于比较冻干粉末中蛋白质的二级结构与其天然溶液状态下的结构。然而，这些方法分辨率较低，仅能提供有关二级结构整体变化的信息。利用FTIR进行的固态结构表征与长期储存稳定性之间的相关性较弱^13,14或较差¹⁵。这些局限性凸显了开发适用于检测固态蛋白质结构扰动的高分辨率方法的必要性。

化学标记结合蛋白酶解和质谱分析已成为监测水溶液中蛋白质结构和分子相互作用的有力方法。在药物研发中，氢氘交换质谱（HDX-MS）已被用于抗原-抗体相互作用中的表位作图^16,17，受体-药物相互作用的定位¹⁸，监测翻译后修饰对蛋白药物构象的影响¹⁹，以及在生物类似药开发过程中比较批次间的差异²⁰。类似地，光激活配体已被用于鉴定药物靶点，并确定药物-受体相互作用的结合亲和力与特异性^21,22。为了将这些方法的应用扩展到冻干制剂，本课题组开发了固态氢氘交换质谱（ssHDX-MS）和固态光解标记质谱（ssPL-MS），以高分辨率研究冻干样品中的蛋白质构象及辅料相互作用。

在固相氢氘交换质谱（ssHDX-MS）和固相侧链标记质谱（ssPL-MS）中，蛋白质在冻干固体中于理想反应条件下进行标记，随后将样品重新溶解，并通过质谱分析，可选择是否进行蛋白酶消化。ssHDX-MS 提供有关蛋白质主链暴露于氘代蒸气的信息，而 ssPL-MS 则提供有关侧链微环境的信息（图1）。因此，这两种方法可为固态下蛋白质构象提供互补的信息。本文以肌红蛋白（Mb）为模型蛋白，提供了利用 ssHDX-MS 和 ssPL-MS 研究冻干固体中蛋白质的一般实验方案（图2）。我们展示了这两种方法区分含有两种不同辅料配方之间差异的能力。

图 1：ssHDX 和 ssPL 通过不同的标记机制测定冻干固体中的蛋白质结构。（A）在氢-氘交换（HDX）中，骨架酰胺氢原子根据蛋白质结构和 D₂O 的可及性与氘发生交换。在固态下，氘交换的速率和程度取决于 D₂O 的吸附水平、蛋白质的流动性（去折叠和再折叠事件）以及固体基质中赋形剂的性质。（B）在光标记（PL）中，365 nm 的紫外照射引发 pLeu 的重氮丙烯功能基团生成高活性的卡宾中间体，该中间体可非特异性地插入任意 X-H 键（X = 任意原子），或加成到邻近的 C=C 双键上。在固态下，标记的速率和程度取决于标记试剂的局部浓度、照射时间、蛋白质结构以及固体基质中赋形剂的性质。图 A 和图 B 分别展示了蛋白质骨架和侧链上可能达到的最大理论标记程度。

图 2：冻干制剂中蛋白质的固态氢氘交换-质谱（A）和光解标记-质谱（B）示意图。

方案

1. 样品制备与冻干

1. 将所需体积的肌红蛋白（Mb）储备液在适当的缓冲液中透析，并通过0.22 µm的无菌滤膜过滤。
2. 在适当的缓冲液中配制所需体积的辅料和光亮氨酸（L-2-氨基-4,4-叠氮戊酸；pLeu）储备液。将储备液通过0.22 µm的无菌滤膜过滤。
3. 使用蛋白质、辅料、pLeu和缓冲液的储备液，按照表1所示配制制剂。
4. 将样品通过0.22 µm的无菌滤膜过滤，以去除步骤1.3中形成的任何颗粒。将样品分别分装至2 ml玻璃小瓶中，每瓶0.2 ml。在ssPL-MS研究中为激活pLeu，需使用对紫外光（365 nm）透明的玻璃小瓶。
5. 将小瓶放入冻干机中，并设计合适的冻干程序以启动冻干过程。
   1. 此处，先在-40 °C下冷冻样品，随后在-35 °C和真空（70 mTorr）条件下进行12小时的初级干燥，再在25 °C下进行12小时的次级干燥。也可采用其他冻干程序或干燥方法（例如，喷雾干燥）。
6. 在封盖前，用氮气对含有冻干样品的小瓶进行回填。

配方	冻干前的组成（mg/ml）
	Mb	海藻糖	山梨醇	pLeu c	钾、磷酸盐，pH 7.4
MbT a	1.7	3.4	-	-	0.4
MbS a	1.7	-	3.4	-	0.4
MbT + pLeu b	1.7	3.4	-	14.3 x 10-3 至 1.43	0.4
MbS + pLeu b	1.7	-	3.4	14.3 x 10-3 至 1.43	0.4

表1：冻干肌红蛋白（Mb）制剂的组成。 ^a 用于ssHDX-MS研究的制剂。 ^b 用于ssPL-MS研究的制剂。 ^c L-2-氨基-4,4-叠氮戊酸或光交联亮氨酸（pLeu）。将pLeu以五种不同浓度（14.3 × 10^-3 至 1.43 mg/mL），分别相当于相对于Mb的1倍、10倍、20倍、50倍和100倍摩尔过量，与MbT和MbS制剂共冻干。

2. 完整蛋白质的ssHDX-MS

1. 在干燥器的下层 compartment 中预先放置的 200 ml D₂O 中加入饱和量（约 440 g）的 K₂CO₃。将干燥器密封并置于 5 °C 下平衡，直至达到约 43% 的稳定相对湿度（RH）。通过选择不同的饱和盐溶液，可获得其他感兴趣的 RH 值^23,24。
2. 将装有冻干蛋白且未加盖的小瓶置于干燥器上层 compartment 中，以启动 ssHDX 反应。将干燥器密封并在 5 °C 下孵育，使氢氘交换发生（图 2A）。
3. 在不同时间点以三份重复收集 ssHDX 样品。对于 Mb 制剂，在 1、2、4、8、16、32、56、92 和 144 小时共九个时间点取样。
4. 从干燥器中取出小瓶后立即加盖，并通过液氮快速冷冻小瓶以淬灭反应。将小瓶储存于 -80 °C，直至进行质谱分析。
5. 采用合适的高分辨液相色谱-质谱（LC-MS）方法分析样品。设计或购置合适的冷藏 LC 系统，以最小化样品分析过程中的回交换。使用先前报道的柱温控制装置和 LC-MS 方法²⁵。
   注意：由于酰胺质子交换速率依赖于 pH 和温度，蛋白中引入的氘可能会与流动相中的氢发生交换（“回交换”），导致信息丢失。尽管淬灭缓冲液和 HPLC 溶剂的酸性 pH（pH 2.5）可在很大程度上抑制回交换，但通过合适的柱温控制系统将温度降低（≤0 °C）可进一步防止蛋白发生回交换。
6. 将样品环和蛋白捕获柱连接至可自动控制脱盐和洗脱过程的阀门。通过向质谱仪注入飞行时间（TOF）低浓度调谐混合物，在 m/z 范围 200–3,200 内校准质谱仪。完整蛋白分析无需使用固定化胃蛋白酶柱和分析柱。
7. 将冷藏系统的温度设置为 ≤0 °C，并等待系统达到约 0 °C 的稳定工作温度。
8. 将样品从 -80 °C 快速转移至液氮中，用于质谱分析。使用镊子小心地从液氮中取出每个小瓶，并向小瓶中加入特定体积的冰上预冷的淬灭缓冲液（含 0.2% 甲酸（FA）（pH 2.5）和 5% 甲醇的水溶液），以重新溶解样品。
9. 使用控制软件设定合适的 HPLC 和质谱方法。对于 Mb 制剂，将含有 20 pmol Mb 的样品在蛋白捕获柱中以含 5% 乙腈、95% 水和 0.1% 甲酸（FA）的溶液脱盐 1.7 分钟，随后在 3.3 分钟内采用梯度洗脱至 80% 乙腈、20% 水和 0.1% FA。在 m/z 范围 200–3,200 内采集质谱数据。
10. 为确定完整蛋白的质量，使用步骤 2.9 的方法，在水溶液中采集未氘代蛋白样品（即 未经 ssHDX 处理的蛋白）的数据。
11. 使用数据分析软件对原始谱图进行去卷积，获得未氘代和氘代样品的质量。此处设定 Mb 质量计算参数为：质量范围 15,000–18,000 Da，质量分辨率 1.0 Da，峰高阈值 90%。
12. 通过从每个交换时间点的氘代蛋白质量中减去未氘代蛋白质量，计算完整蛋白（此处为 Mb）中引入的氘原子数目。
13. 使用以下公式（公式 1）计算相对于理论最大值的氘摄取百分比
    
    其中可交换酰胺总数 = 氨基酸总数 – 脯氨酸残基数 – 2（“2”用于校正N端氨基和易发生快速回交换的酰胺氢）。
14. 使用合适的指数方程拟合 ssHDX 动力学数据。双指数方程（公式 2）通常是能够合理拟合 ssHDX 数据的最简模型。在本研究中，对 MbT 和 MbS 的数据采用双指数模型，将氘分配至“快速”和“慢速”交换池。
    
    其中 N_fast 和 N_slow 分别表示“快速”和“慢速”交换池中的可交换酰胺数量，k_fast 和 k_slow 为与两个池相关的的一级反应速率常数。

3. 肽段水平蛋白质的ssHDX-MS分析

1. 按照步骤 2.1 至 2.8 进行 ssHDX 实验，但在步骤 2.6 中进行如下修改：将固定化胃蛋白酶柱和分析柱按先前报道的方法连接至阀门²⁵ 更换连接到阀门的蛋白捕获柱为肽段捕获柱。将质谱仪的质荷比范围设置为100至1,700进行校准。
   注意：在复溶步骤（步骤 2.8）中，可在淬灭缓冲液中加入还原剂和变性剂，以促进胃蛋白酶对含二硫键蛋白的消化例如，单克隆抗体。
2. 使用控制软件设置合适的高效液相色谱（HPLC）和质谱分析方法。对于肌红蛋白（Mb）制剂，将含有20 pmol Mb的样品在线用0.1%甲酸（FA）进行消化，随后在肽段捕获柱中以含10%乙腈、90%水和0.1% FA的溶液进行捕获和脱盐，持续1.7分钟。在4.0分钟内采用梯度洗脱，将片段以含60%乙腈、40%水和0.1% FA的流动相洗脱至分析柱。在m/z 100−1,700范围内采集质谱数据。
3. 通过非氘代蛋白质样品的 MS/MS 分析鉴定胃蛋白酶消化片段。使用质谱分析软件将肽段碎片离子的实验质量与自定义数据库中预测的肽段碎片质量进行比对。设定质量截断值（例如 10 ppm）以鉴定误差较低的质量。对于匹配的肽段，准备一个包含（i）肽段序列、（ii）电荷态和（iii）保留时间的列表。
4. 使用第3.3步生成的列表，对每个胃蛋白酶消化片段进行映射，并确定其掺入的氘原子平均数目。可通过使用适当的氢氘交换质谱（HDX-MS）数据分析软件实现。²⁴.
5. 为计算氘代摄取百分比并对每种胃蛋白酶片段的ssHDX动力学数据进行拟合，请执行步骤2.13和2.14。在本研究中，MbT和MbS制剂中六个非冗余胃蛋白酶消化片段的HDX动力学数据均采用双指数关联模型（公式2）进行拟合。

4. 完整蛋白质的ssPL-MS分析

1. 开始光解标记反应时，首先打开紫外交联仪，使灯管预热5分钟。确保紫外光源配备波长为365 nm的灯管，以激活pLeu中的重氮丙烯基团。
   警告：当灯管开启时，切勿打开紫外交联仪的门。如果光源未被防紫外线玻璃门封闭，应保护眼睛和皮肤免受紫外线照射。
2. 在打开门之前，先关闭紫外交联仪。待灯管关闭后，打开含有冻干制剂的小瓶盖子，并将其放入紫外交联仪腔室内，如图2B所示。用紫外光照射样品40分钟。
3. 通过按照步骤4.1至4.3对以下样品进行操作，开展对照实验：(i) 未添加pLeu冻干的样品；(ii) 使用水复溶的含pLeu冻干样品。
4. 盖紧小瓶，并在-20 °C下保存，直至进行质谱分析。
5. 通过加入适量的质谱级蒸馏水复溶固体样品，使终浓度达到2 µM。
6. 开始样品分析时，按照步骤2.6和2.9进行。
   注意：由于共价标记不存在回交换问题，ssPL-MS无需使用特殊的低温液相色谱系统。
7. 为确定蛋白质的天然质量，对未经ssPL处理的蛋白质样品按照步骤2.9采集数据。通过步骤2.11所述方法对原始谱图进行去卷积，获得未标记和标记样品的质量。
8. 使用以下公式计算掺入的pLeu数量：
   
   其中M_L为标记蛋白质的质量，M_N为天然蛋白质的质量，115为单个pLeu掺入后添加到天然蛋白质上的平均质量（Da）。注意，标记反应过程中会失去N₂（28 Da）。pLeu的单同位素质量为143.07。
9. 利用提取离子色谱图中的峰高，计算具有不同标记数量的蛋白质群体的百分比：
   
   其中“i”表示标记数量，PH_i表示标记蛋白质L_i的峰高，PH_u表示质谱检测到的未标记蛋白质的峰高。

5. 肽段水平蛋白质的ssPL-MS分析

1. 按照步骤 4.1 至 4.4 进行 ssPL 操作。
2. 进行肽段水平分析时，将固体样品重悬于碳酸氢铵缓冲液（100 mM，pH 8.0）中。
3. 复溶后，将标记的蛋白质溶液与胰蛋白酶按10:1的蛋白质与胰蛋白酶摩尔比混合，于60 °C孵育16小时。
4. 通过向样品中加入含0.1%甲酸的水溶液，使蛋白终浓度达到2 µM，以终止反应。
5. 将样品环、肽捕获柱和分析柱连接至与HPLC系统相连的阀门。
6. 使用控制软件设置合适的高效液相色谱和质谱方法。对于肌红蛋白制剂，将20 pmol消化后的蛋白质注入样品环中，用含5%乙腈、95%水和0.1%甲酸的溶液在肽捕获柱中脱盐1.5分钟，随后在分析柱中以梯度洗脱，22分钟内将乙腈比例升至55%，水比例降至45%，并含0.1%甲酸。在m/z 100–1,700范围内采集质谱数据。
7. 使用 ExPASy 等在线工具制备肽-pLeu 加合物的理论质谱列表²⁶ 结合先前从完整蛋白质分析中计算出的 pLeu 数量。应包含至少 4 个未完全切割位点。注意标记反应会伴随 N 的丢失₂因此，肽段-pLeu 加合物的质量 = 未标记胰蛋白酶肽段的质量 + n（pLeu 的质量）－ n（N 的质量）₂），其中“n”为掺入的pLeu数量。
   注意：如果完整蛋白质的质谱分析显示出多达三种标记的蛋白质群体，则每种肽段最多可考虑三个可能的pLeu标记。对于分子量为1,000 Da的肽段，含有一个pLeu掺入的肽段-pLeu加合物的理论分子量为1,000 + 1(143) - 1(28) = 1,115 Da。类似地，含有两个pLeu、三个pLeu的肽段-pLeu加合物的理论分子量分别为 等等。 1,230 Da，1,345 Da 等等。分别。
8. 使用质谱分析软件将步骤 5.7 中生成的理论质量列表与实验中观测到的质量进行匹配。设置一个质量截断点（例如，50 ppm）以鉴定低误差质量。
9. 对于匹配的肽段，使用步骤4.8下的公式（公式3）确定实际掺入的pLeu数量，其中M_L 和 M_N 分别为标记肽和天然肽的质量。

结果

本研究采用ssHDX-MS和ssPL-MS方法，考察了辅料对冻干肌红蛋白（Mb）制剂构象及其固态相互作用的影响。表1列出了本研究中使用的蛋白质和辅料浓度。以下述方案制备的冻干Mb样品，其ssHDX-MS和ssPL-MS分析的代表性结果已展示。

完整蛋白质水平的氘代摄取

ssHDX-MS 能够在完整蛋白水平上区分 Mb 的不同制剂。在 ssHDX 反应 144 小时后，MbS 制剂的完整 Mb 去卷积质谱显示其氘代摄取量高于 MbT 制剂（图 3A）。平均而言，MbS 的氘代摄取量比 MbT 高 46%（表 2）。

图3：完整肌红蛋白（Mb）的固态氢氘交换质谱分析（ssHDX-MS）：(A) 经144小时固态氢氘交换（ssHDX）后，MbT（实线）和MbS（虚线）两种制剂中氘代完整Mb的解卷积质谱图。未氘代完整Mb的解卷积质谱图也一并显示（点线）。(B) MbT（实线）和MbS（虚线）制剂中完整Mb的ssHDX动力学。ssHDX的时间进程采用Graph Pad Prism软件5版拟合为双相指数关联方程（n = 3，± 标准差）。

在早期时间点（1-4 小时），完整 MbS 和 MbT 的氘代动力学相似，但随着孵育时间的延长（8-144 小时），MbS 显示出更高的氘交换水平（图 3B）。这表明在较低相对湿度和温度条件下进行固态氢氘交换（ssHDX）时，选择较长的时间点尤为重要。此外，D₂O 的吸附与扩散过程可能会影响早期时间点的 ssHDX 速率。我们先前的研究表明，ssHDX 中的水分吸附在数小时内即可完成，此后对交换动力学的贡献极小。因此，所观察到的交换速率和程度并不仅仅是 D₂O 吸附的反映^27,28。图 3B 中较小的误差棒（表示三次独立 ssHDX-MS 样品的标准偏差）表明该实验具有高度可重复性。

	氘摄取率 (%) b	Nfast c	kfast c	Nslow c	kslow c
MbT a	15.9 ± 0.5	13.1 (0.8)	0.43 (0.03)	11.0 (0.9)	0.019 (0.001)
MbS a	23.2 ± 0.5	15.4 (0.7)	0.49 (0.04)	19.2 (0.6)	0.024 (0.002)
% 变化 d	46%	18%	14%	75%	26%

表2：肌红蛋白制剂在固相氢氘交换（ssHDX）研究中氘摄取量的定量测量。 ^a 配方组成见表1。 ^b 在5 °C、43% 相对湿度条件下进行144小时氢氘交换后，完整肌红蛋白相对于理论最大值的氘摄取百分比（n = 3，均值 ± 标准差）。 ^c 通过非线性回归拟合ssHDX-MS动力学数据确定的参数。完整肌红蛋白的氘交换时间过程采用双指数关联模型（公式2）进行拟合。括号中的数值为回归参数的标准误差。 ^d 测量值的变化百分比计算公式为：100 × [（MbS的数值 – MbT的数值）/（MbT的数值）]。

MbT 和 MbS 的氘吸收动力学回归参数（N_fast、N_slow、k_fast 和 k_slow）见表 2。尽管 MbS 的 N_fast 和 N_slow 值均大于 MbT，但 N_slow 值的差异大于 N_fast 值的差异。具体而言，MbS 的 N_fast 值比 MbT 高 18%，而 MbS 的 N_slow 值则比 MbT 高 75%。这表明 MbT 中较小的 N_slow 值可能是由于 Mb 结构的更高保留程度，或辅料对在 MbS 中暴露于 D₂O 的酰胺基团提供了保护作用。然而，其详细机制尚不明确。两种制剂的速率常数（k_fast 和 k_slow）非常相似。

肽段水平的氘代摄取

胃蛋白酶消化后，共鉴定出52种肽段。本研究分析中使用了6个非冗余片段，对应肌红蛋白（Mb）序列的100%。通过使用重叠片段，还可获得更多信息，我们课题组此前已有相关报道²⁴。计算了每种肽段的氘代摄取百分比，并绘制了144小时样品的结果（图4A）。这6个胃蛋白消化片段的氢氘交换（HDX）动力学呈双指数行为（图4B），表明酰胺氢存在发生“快速”和“慢速”交换的亚群。

图 4：肌红蛋白（Mb）在肽段水平的ssHDX-MS分析：(A) Mb在MbT（灰色）和MbS（白色）两种制剂中，经过144小时氢氘交换后，6个非冗余胃蛋白酶片段的氘吸收百分比。（B）Mb在MbT（实线）和MbS（虚线）两种制剂中6个非冗余胃蛋白酶片段的ssHDX动力学。ssHDX的时间过程采用Graph Pad Prism软件5版拟合为双相指数关联方程（n = 3，± 标准差）。

非冗余肽段的回归参数见图5。由于拟合得到的肽段片段速率常数并非各个酰胺基团的平均速率常数，因此胃蛋白酶解片段的观测速率常数无法与完整蛋白的速率常数呈线性关联。在MbS制剂中，大多数胃蛋白酶解片段（除片段56-69外）的N_fast值略高于MbT制剂中的对应值（图5A）。类似地，k_fast值在不同制剂之间以及Mb分子的不同区域之间总体差异较小（图5B）。然而，MbS制剂中所有片段的N_slow和k_slow值均显著高于MbT制剂（图5C和图5D）。MbS中N_slow和k_slow的显著升高可能反映了“慢”交换池中酰胺基团具有更高的流动性。

图 5：Mb 胃蛋白肽段的 ssHDX 动力学参数：N_fast (A)、k_fast (B)、N_slow (C) 和 k_slow (D) 值，由 Mb 在 MbT（灰色）和 MbS（白色）制剂中六个非冗余胃蛋白肽段的 ssHDX-MS 动力学数据经非线性回归分析获得（n = 3，± 标准误）。

完整蛋白质水平的光解标记

在存在20倍过量pLeu的情况下，Mb经辐照后形成了多种Mb-pLeu加合物，通过LC-MS检测得到证实（图6A）。对MbT在20倍pLeu存在下辐照40分钟后的去卷积质谱显示，最多出现3个标记峰，其质量相对于未标记的Mb分别增加了+115、+230和+345 Da。在相同条件下以20倍pLeu辐照的MbS在完整蛋白水平上pLeu的结合较少，LC-MS检测到最多两个被标记的组分。

图6：完整肌红蛋白（Mb）的ssPL-MS分析：(A) 使用20倍过量（5% w/w）pLeu标记的MbT（实线）和MbS（虚线）的去卷积质谱图。天然Mb（未添加pLeu，经冻干并照射）的去卷积质谱图以点线表示。U 表示照射后仍保持未标记状态的蛋白质群体。携带1、2和3个pLeu标记的蛋白质群体分别表示为1L、2L和3L。(B) 在含不同浓度pLeu的MbT（实心圆）和MbS（空心圆）制剂中，完整Mb的ssPL-MS反应动力学。所有样品均照射40分钟。误差棒位于符号内部。(C) 在含100倍过量pLeu（20.7% w/w）条件下冻干并照射的MbT（实心圆）和MbS（空心圆）制剂中，完整Mb的ssPL-MS反应动力学随照射时间的变化。误差棒位于符号内部。

在动力学研究中，随着照射时间的延长，MbT 和 MbS 的标记蛋白百分比均呈指数增长（图 6B）。在每个照射时间点，MbS 的 pLeu 摄取量均低于 MbT。两种制剂似乎均在 40 分钟时达到平台期。因此，动力学研究可用于确定实现 pLeu 完全活化所需的照射时间。还研究了标记动力学与 pLeu 浓度的关系（图 6C）。对于 MbT 和 MbS，标记蛋白百分比均随 pLeu 浓度的增加而升高。然而，在 pLeu 浓度为 20.7% w/w 时，MbT 的 pLeu 摄取量下降。这可能是由于高浓度 pLeu 导致其被排斥在蛋白表面之外所致。因此，应开展不同 pLeu 浓度的研究，以选择合适的 pLeu 浓度，从而在蛋白表面实现充分标记，同时避免表面排斥现象。本研究中，选择 20 倍过量的 pLeu 用于后续的肽段水平研究。

MbS在pLeu基质中标记减少的整体现象表明其侧链对基质的可及性较差。这与在山梨醇存在下发生构象变化导致标记减少的结果一致。

肽段水平的光解标记

根据完整蛋白质标记研究，选择20倍过量的pLeu，以在肽段水平上比较MbT和MbS。标记后的样品经胰蛋白酶消化后进行LC-MS分析。在MbT和MbS样品中，共检测到40个肽段，覆盖Mb序列的100%。在某些情况下，若赖氨酸和/或精氨酸残基被大量标记，胰蛋白酶消化可能导致蛋白质序列覆盖度受限。为提高序列覆盖度，可使用胰蛋白酶与糜蛋白酶的混合物对标记蛋白进行消化。

图7：肌红蛋白（Mb）在肽段水平的ssPL-MS分析：在存在海藻糖（A）和山梨醇（B）的条件下，肌红蛋白与20倍过量的pLeu（5% w/w）进行标记的示意图。标记后的蛋白质经胰蛋白酶消化，将鉴定出的标记肽段映射至Mb的晶体结构（PDB ID 1WLA）。标记区域和未标记区域分别以品红色和绿色表示。

使用胰蛋白酶消化的ssPL-MS可提供有关被标记肽段的定性信息。由于在完整蛋白水平上存在不同的标记群体、pLeu标记的非特异性机制以及标记与未标记肽段电离效率的差异，因此在消化后难以获得ssPL-MS的定量数据。然而，这些定性信息仍可揭示蛋白质在肽段水平上的构象变化。本研究中，MbT和MbS两种制剂均显示出在整个蛋白表面广泛摄取pLeu。与MbS相比，MbT中肽段片段32-42、134-139和146-153出现了pLeu标记（图7）。这表明这些氨基酸的侧链暴露于pLeu，因为这些区域的α螺旋在MbT基质中保持完整。相反，MbS基质中这些区域对pLeu标记的保护作用则与这些区域的结构扰动一致。

总体而言，ssHDX-MS 和 ssPL-MS 的结果表明，这些方法可提供关于冻干蛋白制剂中骨架（ssHDX-MS）和侧链（ssPL-MS）暴露情况以及赋形剂效应的互补性高分辨率肽段水平信息。

讨论

多项研究表明，冻干样品中的局部环境会影响蛋白质的降解^5,29,30。然而，由于缺乏高分辨率的分析方法，建立蛋白质结构与固态稳定性之间的直接关系一直不可行。将现有的高分辨率方法（如氢氘交换和光交联）应用于冻干粉末时，需要对溶液中的实验方案进行修改，并谨慎解读数据。氢氘交换质谱（HDX-MS）和光交联质谱（PL-MS）已成功用于监测固态中蛋白质的构象。本文及其他研究^27,28,31-33的结果表明，这些方法能够在固态环境中以高分辨率监测蛋白质构象。尽管数据分析中的关键步骤与溶液中标记方法并无差异^34-36，但在实验设计和数据解读过程中，固态化学标记仍需特别注意若干重要因素。

标记试剂的选择必须基于其尺寸和标记机制。氘的尺寸较小，可轻松探及肽主链；而相对较大的pLeu则仅限于对侧链进行标记。ssHDX和ssPL均对任何氨基酸无偏好性，因此标记程度仅取决于主链和侧链在基质中的暴露程度。为了有效探测固态下蛋白质的构象，必须严格控制影响标记过程的外部因素。在冻干固体中，标记试剂的总量及其空间分布与水溶液中不同。

在ssHDX中，固体基质中D₂O的含量可能影响蛋白质的去折叠（或部分去折叠）、再折叠以及氘交换速率。这与溶液HDX不同，后者通常将蛋白质样品用大量D₂O稀释。通过仔细筛选水分含量对ssHDX速率的影响，有助于确定理想的相对湿度（RH）条件。为了控制水分吸附速率，并避免在含有吸湿性辅料（例如蔗糖和海藻糖）的制剂中粉末塌陷，ssHDX可在冷藏条件下（2–8 °C）进行。我们先前关于水分影响的研究表明，随着水分含量增加，交换速率和程度均有所提高，符合预期。在我们的多数研究中，5 °C下43%的中等相对湿度被证明可在合理时间内有效区分不同制剂²⁴。反应通常持续至达到平台期，以确保水分吸附及向固体内部扩散不再限制HDX速率。使用较小的固体量（预冻干体积≤2 mL）也有助于确保在交换初期D₂O蒸气吸附基本完成。尽管ssHDX-MS可提供有关固态蛋白质构象的定量信息，但在某些情况下，数据解释不能完全依赖ssHDX研究。例如，样品中观察到的氘摄取减少（相对于对照）可能源于蛋白质结构保持更完整，或样品中存在大量蛋白质聚集体。在此情况下，ssHDX数据的解释需结合其他互补方法的结果。在多种肌红蛋白（Mb）制剂中观察到氘代质谱峰展宽现象^27,28。这可能由多种因素引起，如部分去折叠蛋白群体的存在、样品的空间异质性，或D₂O浓度的空间梯度。然而，ssHDX-MS未能区分这些因素，仍需进一步研究。

由于ssPL-MS与其他方法相比相对较新，因此需要持续了解其应用范围和局限性。在ssPL中，光交联剂与蛋白质共冻干。缺乏水分限制了固体基质中各组分的流动性，而ssHDX中因水分吸附可能导致的部分结构松弛现象在ssPL中不会发生。这使得ssPL的标记局限于光交联剂附近的区域。然而，与HDX-MS不同的是，对共价标记蛋白质进行MS/MS分析可提供残基水平的结构信息。由于ssPL标记是共价且不可逆的，不会发生反向交换，因此样品可在无需担心标签丢失的情况下进行制备和分析。为了促进标记试剂在固态基质中的扩散并提高标记效率，ssPL可在逐渐增加相对湿度（% RH）的条件下进行。通过提高光反应性试剂的浓度也可改善pLeu的摄取。蛋白质与pLeu的摩尔比可根据需要进行调整。通常，pLeu相对于蛋白质使用100倍的摩尔过量即可确保充分的标记。然而，过高的pLeu浓度可能导致固体基质中蛋白质三级结构的破坏。因此，除了标记动力学和制剂组成外，pLeu浓度的选择还必须以维持蛋白质结构完整性为依据。由于pLeu非特异性地标记X-H基团（其中X = C、N、O），含有类似标记位点的辅料可能显著影响蛋白质的标记程度。目前尚未明确辅料对pLeu可用于蛋白质标记的干扰情况。已知由二氮杂环丙烯活化生成的卡宾并不具有残基特异性，但有研究报道其对Asp和Glu存在偏好性³⁶。尽管了解残基特异性相互作用是有益的，但肽段水平的信息同样具有价值，可用于设计能够阻断固态下高暴露区域的辅料。ssPL-MS可提供详细的定性信息，但尚需获取定量数据，并建立可靠的分析指标，以比较多种冻干体系之间的制剂差异。

使用位点特异性标记物结合串联质谱分析可进一步将分辨率提升至氨基酸水平。例如，可使用2,3-丁二酮作为标记试剂对精氨酸（Arg）进行标记， N用于Lys的羟基琥珀酰亚胺衍生物 N-烷基马来酰亚胺衍生物可用于半胱氨酸，以精确绘制冻干粉末中的分子相互作用。然而，这些试剂对pH值依赖性强，其反应在固态下可能不如光解标记那样易于控制。另一种方法是利用营养缺陷型细胞系、位点特异性突变或侧链衍生化，将光交联剂整合到蛋白质序列中。

我们先前的ssHDX-MS和ssPL-MS研究已表明，蛋白质的标记程度取决于所用辅料的种类和用量^{24,27,28,31-33,37,38}。肌红蛋白（Mb）与盐酸胍（Gdn.HCl）共冻干后的ssHDX-MS结果显示，其氘代摄取量高于与低分子量糖类共冻干的Mb³²。在另一项独立的ssPL-MS研究中，与蔗糖共冻干的Mb相比，与Gdn.HCl共冻干的Mb对光解标记表现出更强的保护作用³³。此外，ssHDX-MS获得的定量测量结果与蛋白质在长期储存过程中的稳定性高度相关²⁸。这些研究表明，蛋白质的ssHDX或ssPL能够反映其在冻干粉末中结构保留的程度。我们认为，冻干粉末中二级结构的保留为侧链与pLeu的标记提供了有利环境，同时保护了酰胺氢免于发生氘交换。然而，未来仍需对这些方法所提供的信息内容进行更详细的比较。尽管要确立ssHDX-MS和ssPL-MS作为制剂筛选工具的实用性，最终还需将其应用于多种蛋白质，但我们近期的研究结果支持其更广泛的应用。随着进一步的发展，这些方法有望在生物制药行业中广泛用于固态蛋白质制剂的表征。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
马肌红蛋白	Sigma-Aldrich	M0630-5G
D-(+)-海藻糖二水合物	Sigma Aldrich	#T9531
D-山梨醇	Sigma Aldrich	#240850
L-光-亮氨酸	Thermo Scientific	#22610
磷酸二氢钾	Sigma-Aldrich	#P0662
磷酸氢二钾	Sigma-Aldrich	#P3786
氧化氘	Cambridge Isotope Laboratories	#DLM-4-PK	替代产品（货号：151882，Sigma-Aldrich）
固定化胃蛋白酶	Applied Biosystems	#2-3132-00
胰蛋白酶	Promega	#V511A	也可额外使用糜蛋白酶（货号：#V1062，Promega）
水，Optima LC/MS 级	Fisher Chemical	#7732-18-5
乙腈	Sigma-Aldrich	#34998
甲酸	Thermo Scientific	#28905
ESI-TOF 校准液	Agilent Technologies	#G1969-85000	高度易燃液体
蛋白质微捕获柱	Michrom Bioresources	TR1/25108/03
肽段微捕获柱	Michrom Bioresources	TR1/25109/02
分析柱	Agilent Technologies	Zorbax 300SB-C18
冷冻干燥机	VirTis AdVantage Plus
配备五个 365 nm 灯的交联仪	Stratagene Corp.	Stratalinker 2400
高效液相色谱仪（HPLC）	Agilent Technologies	1200 系列 LC	用于氢氘交换质谱（HDX-MS）的冷藏液相系统
电喷雾离子化四极杆飞行时间质谱仪（ESI-qTOF MS）	Agilent Technologies	6520 qTOF
HDExaminer（HDX-MS 数据分析软件）	Sierra Analytics		http://www.massspec.com/HDExaminer.html