人类诱导性多能干细胞中利用TALEN技术将GFP基因靶向AAVS1安全位点的转染、筛选与克隆挑取

摘要

通过TALEN介导的基因编辑技术对安全港AAVS1位点进行操作，可在人诱导多能干细胞（iPSCs）中实现高效的外源基因插入。本实验方案详细描述了为TALEN系统和供体质粒递送而准备iPSCs、转染iPSCs，以及筛选和分离iPSC单克隆细胞系的操作步骤，以实现绿色荧光蛋白（GFP）基因的靶向整合，从而构建报告细胞系。

摘要

靶向转基因添加可在避免病毒载体介导的随机整合所导致的基因沉默和插入突变的同时，实现持久的基因表达。本方案描述了一种基于已验证的开源TALENs和类似基因捕获（gene-trap-like）供体质粒，在人iPSC中实现通用且高效的靶向转基因添加平台。重要的是，基因编辑效率受限于基因编辑载体的递送效率。因此，本方案首先聚焦于转染前iPSC的制备，以实现高效的核内递送。当使用温和的细胞解离试剂将iPSC解离为单细胞，并采用优化的程序进行转染时，可使超过50%的细胞摄取大尺寸的基因编辑载体。由于AAVS1位点位于一个活跃基因（PPP1R12C）的内含子中，因此采用与剪接受体（splicing acceptor, SA）连接的嘌呤霉素抗性基因（PAC）来筛选靶向整合的iPSC，同时排除仅发生随机整合或未转染的细胞。该策略显著提高了获得靶向克隆的概率，也可应用于其他活跃基因的靶向实验。在根据特定iPSC系调整剂量进行嘌呤霉素筛选两周后，即可通过手动解剖较大的孤立克隆，将其分割为较小片段，并转移至较小孔板中的新鲜培养基中，以进行后续扩增及遗传学和功能筛选。研究人员可依据本方案，快速获得多个GFP报告基因iPSC细胞系，这些细胞系可用于体内（in vivo）和体外（in vitro）成像以及细胞分离研究。

引言

将人类体细胞重编程为类似胚胎干细胞的诱导性多能干细胞（iPSCs）的能力最初由Takahashi发现 等 2007年¹经转导表达四种转录因子（即所谓的山中因子 Oct3/4、Sox2、c-Myc 和 Klf4）的逆转录病毒的人类真皮成纤维细胞，在形态、增殖能力、基因表达和表观遗传状态方面均显示出与人类胚胎干细胞（hESCs）高度相似的特征；关键的是，诱导性多能干细胞（iPSCs）也具有分化为三个胚层各类细胞的能力¹iPSCs 的增殖潜能和分化能力使其成为极具吸引力的工具；通过重编程患有特定疾病的患者的细胞，iPSCs 既可用于 体外 疾病模型系统及潜在治疗手段。

为实现iPSCs在临床应用中的全部潜力，必须首先解决若干问题，其中包括iPSCs的致瘤性潜能 体外 培养的人胚胎干细胞（hESCs）和诱导多能干细胞（iPSCs）、重编程及细胞维持过程中使用异种衍生物，以及对移植细胞进行追踪的需求 体内 都是多能干细胞临床应用的关键障碍（Hentze 综述） 和在.²). 解决移植后追踪已分化细胞的需求，理想方案是采用一种无论在何种应用中均不受沉默和花斑效应影响的可视标记。当外源DNA被导入安全港位点时，整合型转基因的强健且持续表达最容易实现；也就是说，这些基因组位点能够支持整合载体的充分转录，同时最大限度减少对邻近基因表达的干扰....

方案

1. 基底膜基质的制备与塑料器皿的包被

1. 将 -20 °C 保存的冻存基底膜基质原液置于冰上，并在 4 °C 过夜解冻。
2. 解冻后，用移液器将 2 mg 基底膜基质分装至预冷的离心管中。分装后储存于 -20 °C，待需要时使用。
3. 制备包被基底膜基质的培养板时，将一份分装样品置于冰上解冻，直至离心管中最后一块冰完全消失（通常在约 2 小时内）。
4. 解冻后，将基底膜基质加入 12 ml 冰冷（4 °C）的 DMEM/F12 培养基中，配制成基底膜基质包被溶液。
5. 将基底膜基质溶液加入适当的培养容器中。对于 6 孔板，每孔加入 1 ml 。轻轻晃动培养板，确保基底膜基质溶液完全覆盖每个孔的表面。
6. 用 Parafilm 密封包被有基底膜基质的培养板/培养皿，并在使用前于室温孵育 1 小时。或者，可将包被后的培养板/培养皿储存于 4 °C，并在包被后 2 周内使用。
   注意：向包被有基底膜基质的培养板/培养皿中额外加入 DMEM/F12，以防止干燥。使用前，将储存于 4 °C 的培养板/培养皿置于生物安全柜中，使其恢复至室温至少 30 分钟。
7. 在加入培养基和细胞前，彻底吸除基底膜基质。

2. E8 培养基的制备

1. 通过将 E8 添加剂在 4 °C 下过夜解冻来制备 E8 培养基。

结果

该实验方案的示意图见图2，其中诱导性多能干细胞（iPSCs）在不同培养基中培养的时间段分别以绿色（E8培养基）或蓝色（NutriStem培养基）标出。仅可转染高质量的iPSCs；在常规维护过程中应仔细检查培养皿，确保iPSC培养物主要由具有铺路石样形态的独立克隆组成（图3A）；分化细胞所占比例不应超过10%。iPSCs的转染效率通过小尺寸质粒pMax-GFP进行评估和优化（图4A-B），由于pMax-GFP体积较小，其转染效率通常代表了可达到的最高水平。例如，我们使用pMax-GFP实现了68.6%的转染效率（图4B）。为靶向AAVS1安全位点，iPSCs需使用温和的单细胞解离试剂传代，并与AAVS1-TALENs和AAVS1-CAG-EGFP共转染（质粒结构见图1A）。转染后的iPSCs接种于适当密度的DR4 MEFs上（图3B）。AAVS1-CAG-EGFP的瞬时表达在转染后48至72小时达到峰值（图3C

讨论

成功生成AAVS1安全港定点靶向人iPSCs最关键的步骤包括：（1）通过转染将TALEN和供体质粒高效递送至iPSCs；（2）优化转染前iPSCs的单细胞解离以及转染后的铺板密度；（3）根据iPSC细胞系的生长情况优化药物筛选的剂量和时间；（4）仔细分离并挑选靶向克隆，转移至新的培养板/孔中。与Hockemeyer论文¹⁰中使用的类似方法相比，本实验方案采用了一对开源的AAVS1-TALEN、不同的iPSC解离试剂以及不同的转染装置来递送TALEN和供体质粒，从而在实现高转染效率和高靶向效率的同时，减少了实验所用iPSC的数量。

为了在人源iPSCs中实现高效的基因编辑，首先必须优化基因编辑试剂（DNA/RNA）的递送效率，同时平衡递送方法和试剂对iPSCs造成的急性细胞死亡。目标是在维持可接受的低细胞死亡水平的前提下，最大化递送效率。由于AAVS1-TALEN质粒易于大量制备，且在药物筛选的辅助下可在人源iPSCs中实现>50%的同源重组效率，因此无需从TALEN质粒体外转录生成mRNA。递送的主要挑战来自较大的供体质粒，本实验中该质粒约为10 kb.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Matrigel 生长因子减少型（GFR）基底膜基质，*无LDEV，10 ml	Corning	354230	置于 -20 °C 保存。
DMEM/F-12	Life Technologies	11320-033	置于 4 °C 保存。
Costar 6 孔透明 TC 处理多孔板	Corning	3506
Essential 8 培养基	Life Technologies	A1517001	基础培养基置于 4 °C 保存，补充剂置于 -20 °C 保存。
Y-27632 二盐酸盐	Tocris	1254	室温保存。溶解于 H2O 后，置于 -20 °C 保存。
氯化钠	Sigma	S5886-500G
UltraPure 0.5 M EDTA，pH 8.0	Life Technologies	15575-020
不含钙、镁的 DPBS	Life Technologies	14190-250
100 mm TC 处理培养皿	Corning	430167
DR4 MEF 2M IRR - 学术用途	GlobalStem	GSC-6204G	置于液氮中保存。
DMEM，高糖，含丙酮酸	Life Technologies	11995-040	置于 4 °C 保存。
限定型胎牛血清，美国来源	HyClone	SH30070.03	置于 -20 °C 保存。在 4 °C 过夜解冻后分装。分装后保存于 -20 °C，待用。
MEM 非必需氨基酸溶液（100X）	Life Technologies	11140-050	置于 4 °C 保存。
4D-Nucleofector 核心单元	Lonza	AAF-1001B	电穿孔系统的一部分
4D-Nucleofector X 单元	Lonza	AAF-1001X	电穿孔系统的一部分
P3 原代细胞 4D-Nucleofector X 试剂盒 L（24 次反应）	Lonza	V4XP-3024	收到后，取出原代细胞溶液和补充剂，置于 4 °C 保存。
StemPro Accutase 细胞解离试剂	Life Technologies	A1110501	置于 -20 °C 保存。在 4 °C 过夜解冻，使用前将分装液在 37 °C 水浴中预热。
NutriStem XF/FF 培养基	Stemgent	01-0005	置于 -20 °C 保存。在 4 °C 过夜解冻
AAVS1 TALENs（pZT-AAVS1-L1 和 pZT-AAVS1-R1）	Addgene	52637 和 52638
[header]
AAVS1-CAG-EGFP 同源重组供体质粒	Addgene	22212
嘌罗霉素二盐酸盐	Life Technologies	A11138-03	置于 -20 °C 保存。用 ddH2O 配制 1 mg/ml 的工作液并分装。
一次性硼硅酸盐玻璃巴斯德吸管	Fisher Scientific	13-678-20A
Sorvall Legend XTR（带制冷），120 V 60 Hz	Thermo Scientific	75-004-521
TX-750 4 × 750 ml 摆动桶转子	Thermo Scientific	75003607
台盼蓝溶液，0.4%	Life Technologies	15250-061