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方法文章

使用激光捕获显微切割结合快速免疫标记法从特定细胞亚群中分离RNA

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DOI：

10.3791/52510

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2015年4月11日

 ,  , 
1Department of Psychiatry and Neurosciences, Faculty of Medicine, Université Laval, 2Centre de recherche de l'Institut universitaire en santé mentale de Québec

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

对特定组织中部分细胞的基因表达进行分析是一项重大挑战。本文介绍了如何通过将快速免疫标记方法与激光显微切割技术相结合，从特定细胞群体中分离高质量的总RNA。

摘要

激光捕获显微切割（LCM）能够以高空间分辨率从薄组织切片中分离特定细胞。有效的LCM需要从异质性组织中精确识别细胞亚群。用于LCM的目标细胞识别通常基于形态学标准或荧光蛋白报告系统。将LCM与快速免疫标记相结合，提供了一种可视化特定细胞类型并从周围组织中分离这些细胞的替代且高效的方法。随后可从纯化的细胞群体中提取高质量RNA，并用于下游应用，包括RNA测序、微阵列或qRT-PCR。该方法此前已在少数文献中被实施并简要描述。本文旨在说明如何在保持RNA完整性的前提下对细胞群体进行快速免疫标记，以及如何利用LCM分离这些特定细胞。在此，我们以免疫标记并捕获出生一天小鼠脑组织中的多巴胺能细胞为例，展示了这一多步骤操作流程。我们强调了若干关键且需特别注意的操作步骤。本方案可适用于多种不同组织和目标细胞。不同研究领域的科研人员均可能从本方法的示范中获益。

引言

大脑由多种不同类型的神经元构成，这些神经元形成了复杂的网络。这些神经元根据其形态学特征、连接方式以及基因表达模式被组织成不同的群体和亚群1。微阵列、下一代测序技术和定量逆转录PCR（qRT-PCR）的发展使得在不同生物学背景下比较神经元群体的基因表达谱成为可能1,2。这些高灵敏度的分析方法要求在保持RNA完整性的前提下，精确识别并分离目标细胞类型2-4。荧光激活细胞分选（FACS）技术已被广泛用于基于细胞表面标志物和/或形态学特征来分离特定细胞类型。然而，FACS在分选前需要进行细胞解离步骤，这会导致空间分辨率的完全丧失5。许多神经元亚群之间的区别在于其在大脑中的解剖分布。应用于脑组织薄切片的激光显微切割技术（LCM）为高空间分辨率下特异性分离细胞提供了可行方案6-8。LCM的主要局限性在于必须依赖形态学标准或通过基因工程动物模型中表达的荧光蛋白报告系统来识别目标细胞。近年来，新型快速免疫标记技术的发展实现了在保持RNA完整性的基础上进行标记，结合LCM技术，现已能够分离特定的细胞亚群，进而开展基因表达谱分析实验。

该方法此前已在少数文献中进行过并简要描述1,9-13。本文中，我们展示了一种通过将快速免疫标记与激光显微切割（LCM）相结合，从复杂组织结构中的特定细胞亚群中获取高质量RNA的详细操作流程。我们阐述了如何执行关键步骤，以最大限度地回收RNA并避免RNA降解，因为RNA降解可能显著影响基因表达谱的准确性。

为演示本方案，选取了一日龄小鼠中脑的多巴胺能神经元作为研究对象。多巴胺能神经元可通过针对酪氨酸羟化酶（TH）的抗体进行免疫标记，TH 是多巴胺合成的限速酶。在完成 TH 免疫染色后，可利用激光显微切割技术（LCM）分离单个或多巴胺能神经元群体。显微切割获得的细胞收集于裂解缓冲液中，并使用RNA提取试剂盒提取RNA。采用生物分析仪测定所提取RNA的质量和数量5。随后可进一步开展基因表达分析，包括RNA测序、微阵列分析或实时定量逆转录PCR（qRT-PCR）2,4,6。作为示例，本研究对激光捕获的多巴胺能神经元区域进行了两步法qRT-PCR分析。通过对两个多巴胺能神经元标志基因的表达水平进行相对定量，验证了本方案的特异性。

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方案

注意：实验遵循《加拿大实验动物护理与使用指南》进行，并已获得拉瓦尔大学动物保护委员会的批准。

1. 样品制备

注意：在此示例中，我们使用了出生后第1天的小鼠脑组织。

  1. 将幼鼠置于碎冰中进行低温麻醉，持续 3 至 4 分钟，随后在冰冻的 L15 培养基中尽快解剖脑组织。此步骤应在 2 分钟内完成。
  2. 将解剖好的脑组织转移至包埋模具（cf. 材料清单）中，并加入冷冻组织包埋介质，注意将样本调整至所需方向。立即在液氮中冷冻样本，并于 -80 °C 保存。此步骤应在 30 秒内完成。
    注意：样本可在不影响 RNA 质量的情况下保存数月。

2. 切片

  1. 处理膜包被的玻片（cf使用表面RNase去污染溶液处理载玻片（见材料列表），以消除任何RNase残留。用DEPC水清洗载玻片并使其干燥。或者，可在200 °C下烘烤载玻片过夜。
  2. 将冷冻样本转移至已用表面RNA酶去污染溶液清洁过的冷冻切片机中。设置切片机舱内温度为-20 °C，切片厚度为10 µm。将组织切片收集至膜包被载玻片上，染色前室温干燥10分钟。 alternatively，可将载玻片置于-80 °C保存，直至染色。

3. 染色液的制备

  1. 在实验开始前配制所有溶液，并在所有染色溶液（洗涤溶液除外）中加入RNase抑制剂，以防止RNA降解。
  2. 配制缓冲液：所有溶液中使用相同的缓冲液（由无RNase的磷酸盐缓冲液（PBS）组成，添加1% BSA、0.2% Triton和2% RNase抑制剂）。每张载玻片准备400 µl缓冲液（200 µl用于一抗，200 µl用于二抗）。
  3. 配制固定液：使用保存在-20 °C的70%乙醇。尽量缩短组织固定时间，以避免RNA提取得率显著降低。
    注意：也可使用保存在-20 °C的95%乙醇溶液，其中添加5%乙酸。
  4. 通过将一抗稀释于缓冲液中来配制一抗溶液。用于标记多巴胺能神经元时，使用靶向酪氨酸羟化酶（TH，多巴胺合成的限速酶）的抗体。使用高浓度抗体以补偿较短的孵育时间。TH抗体按1:25稀释使用。
    注意：在常规免疫荧光实验中，该抗体在1:1,000稀释下过夜孵育即可产生强信号。本方案中由于孵育时间短，抗体浓度提高至40倍。由于本方法使用高浓度抗体，建议同时进行标准免疫染色，以检测非特异性标记是否增加。
  5. 通过将二抗稀释于缓冲液中来配制二抗溶液。使用生物素标记的二抗，浓度为1:100。
    注意：本示例中使用了抗兔生物素标记抗体。
  6. 配制用于检测生物素标记二抗的亲和素-生物素复合物（ABC）溶液。将组分A和组分B分别以1:100的比例加入含2% RNase抑制剂的DEPC PBS中，混合制成ABC溶液。在加样到载玻片前30分钟配制亲和素-生物素复合物。

4. 染色

  1. 每次从 -80 °C 取出一张或两张切片，通过在空气中快速弹动使其迅速解冻（或使用吹气装置）。用疏水屏障笔在组织周围画圈，然后静置数秒使其干燥。
    1. 将切片置于 -20 °C 的冷固定液中固定，时间不超过 5 分钟。轻轻在空气中晃动一次以去除多余固定液，随后迅速将切片浸入 DEPC PBS 中清洗 6–8 次。
    2. 弹动切片以去除多余的 DEPC PBS。确保切片解冻步骤不超过 5 分钟。
  2. 将切片置于洁净的托盘上（托盘需预先用表面 RNase 去污染溶液处理，以消除任何 RNase 残留），每张切片上加 200 µl 一抗溶液（兔抗 TH 抗体），室温孵育 10 分钟。迅速将切片浸入 DEPC PBS 中清洗 3 次，然后轻弹一次以去除多余液体。
  3. 每张切片上加 200 µl 二抗溶液，室温孵育 6 分钟。迅速将切片浸入 DEPC PBS 中清洗 3 次，然后轻弹切片以去除多余 DEPC PBS。
  4. 每张切片上加 200 µl ABC 溶液，室温孵育 4 分钟。迅速将切片浸入 DEPC PBS 中清洗 3 次，然后轻弹切片以去除多余 DEPC PBS。
  5. 在 ABC 溶液孵育的 4 分钟内配制 DAB（3,3’-二氨基联苯胺）溶液。使用试剂盒中提供的试剂（DAB 过氧化物酶底物试剂盒）。在 2.5 ml DEPC 水中加入 1 滴试剂盒提供的缓冲液、1 滴 DAB 溶液和 1 滴 30% H2O2，通过倒置混匀溶液。
  6. 取 196 µl DAB 溶液，临上样前加入 4 µl（2%）RNase 抑制剂溶液。将切片置于洁净托盘上（托盘需预先用表面 RNase 去污染溶液处理），每张切片加 200 µl DAB 溶液。
    注意：DAB 溶液应在 1 至 2 分钟内发生反应。
  7. 迅速将切片浸入 DEPC PBS 中清洗 3 次，然后将切片浸入无水乙醇中数秒。通过在空气中弹动（或使用吹气装置）使切片干燥。
    注意：切片可于 -80 °C 保存以备后续使用，或直接进行激光显微切割（LCM）处理。

5. 激光显微切割

  1. 快速在空气中轻弹载玻片以解冻（或使用吹气球）。确保解冻步骤不超过5分钟。
  2. 进行激光显微切割。将载玻片置于显微镜下，使样品面朝向收集管盖。选择适合样品的最佳放大倍数。调节焦距以清晰观察目标细胞。
    1. 确定切割区域，然后使用激光开始切割。将分离的细胞或组织片段收集到装有50 µl裂解缓冲液（来自RNA提取试剂盒）的收集管盖中。确保激光捕获显微切割（LCM）步骤不超过30分钟。
  3. 使用RNA提取试剂盒从分离的细胞中提取总RNA（cf. 材料列表）。请遵循制造商的说明书。
    1. 将收集的细胞在42 °C孵育30分钟以裂解细胞。通过加入250 μl平衡缓冲液预处理RNA纯化柱。向裂解后的细胞中加入50 μl乙醇。将100 μl裂解后的细胞上样至预处理的纯化柱中。 
    2. 在室温下以16,000 × g离心柱子2分钟。用洗涤缓冲液洗涤柱子两次。用推荐的最小洗脱体积（11 µl）的无RNA酶水（勿使用DEPC处理的水，因其可能干扰生物分析仪检测）进行洗脱。保留2 µl用于质量检测。
      注意：所有溶液和试剂均包含在试剂盒中。

6. cDNA 合成与定量 RT-PCR

  1. 使用逆转录酶和寡聚(dT)将激光捕获的多巴胺能细胞的RNA样本逆转录为互补DNA。遵循制造商的说明书（cf. 材料清单）
  2. 使用1 µl cDNA与基因特异性引物进行qRT-PCR扩增。按照制造商推荐，采用20 µl反应体系，使用一种组分的热启动定量PCR预混液进行PCR反应。每个反应设三个重复。
    1. 对于本实验，使用以下引物对：Gapdh-F（5’-CCA CCC AGA AGA CTG TGG AT-3’）/Gapdh-R（5’-GGA TGC AGG GAT GAT GTT CT-3’）；Rpl13a-F（5’-ACA GCC ACT CTG GAG GAG AA-3’）/Rpl13a-R（5’-CTG CCT GTT TCC GTA ACC TC-3’）；Th-F（5’-CAG TGG AGG ATG TGT CTC -3’）/Th-R（5’-GAA AAT CAC GGG CAG ACA G-3’）；Aadc-F（5’-CAT GAG AGC TTC TGC CCT TC-3’）/Aadc-R（5’-GGA TGT GGT CCC CAG TGT AG-3’）。
  3. 使用以下快速循环参数进行定量RT-PCR扩增：95 °C预变性5 min，随后进行45个循环，每个循环为95 °C 10 sec、60 °C 10 sec、72 °C 10 sec。使用仪器默认设置进行熔解曲线分析，以确定产物的均一性。
  4. 使用内置软件分析数据。
    1. 使用参考基因 Gapdh 和 Rpl13a 的表达量对多巴胺能标志基因 Th 和 Aadc 的表达值进行标准化，以获得相对表达水平，具体方法如前所述。14.

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结果

这种快速免疫标记方法可在保持RNA完整性的前提下实现对目标细胞的可视化。图1展示了RNA提取前的组织制备步骤。冷冻切片后，使用针对酪氨酸羟化酶的抗体对多巴胺能神经元进行标记（标记的神经元呈棕色）。根据不同的实验需求，可使用激光显微切割技术（LCM）分离单个细胞或较大的感兴趣区域（图1D-E）。评估提取RNA的质量至关重要，因为降解的RNA将显著影响后续分析的质量。因此，每个样本均需通过基于微流控技术的生物分析仪进行定量并检测RNA完整性。图2展示了降解样本与高质量样本的典型生物分析仪结果。数字凝胶图和电泳图谱均表明，在每种溶液中使用RNase抑制剂对保护RNA的重要性。从500个神经元中提取的RNA预期产量约为1-2 ng。来自多个组织切片的显微切割细胞可汇集至同一管中，以增加RNA总量。

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讨论

该方法最关键的步骤在于标记目标细胞的同时防止RNA降解。由于RNase在水溶液中具有活性，缩短孵育时间有助于提高RNA的保存效果11,15。所使用的所有溶液都必须用DEPC处理以灭活RNase。所有材料和表面均需使用表面RNase去污染溶液处理，以防RNase污染。最后，在这些条件下，所有溶液中添加RNase抑制剂可有效保护RNA不被降解。先前研究表明，抗体孵育过程中使用高盐条件有助于RNA的保存9,10。然而，这种替代方法仅适用于使用稳定性强的抗体进行快速染色。切片厚度是另一个关键因素，需根据目标细胞的大小来确定。由于多巴胺能神经元胞体的平均大小约为10µm，我们选择这一切片厚度以获得单层细胞。

与FACS相比，该技术的主要局限性在于可显微切割的细胞数量较少。进行RNA测序或微阵列基因表达谱分析实验时，需要使用RNA扩增试剂盒16。然而，qRT-PCR可直接进行，无需扩增步骤（图2c）。必须始终对快速免疫标记方案获得的染色结果进行定性评估，其结果不应与常规免疫标记方案获得的染色结果...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC：418391-2012）资助。AC 获得神经科学专题研究中心（CTRN）奖学金。HDB 获得魁北克健康研究基金会（FRSQ）奖学金资助，ML 为 FRSQ 研究员奖学金获得者。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
膜包被载玻片 Leica Biosystems11505158MembraneSlides PEN膜 2.0 µ米；50 件
表面RNA酶去污染溶液Life technologiesAM9780RNaseZap
固定剂70% 乙醇，保存于 -20℃ °C
抗TH Pel-FreezP40101 1:25
RNase 无核酸酶缓冲液DEPC 处理的 PBS + 1% BSA + 0.02% 吐温-20
RNA酶抑制剂PromegaN2615Rnasine Plus RNase抑制剂 40 kU/ml（储存液）
生物素标记的抗兔抗体Vector LaboratoriesBA-1000
Vectastain Elite ABC试剂盒 标准型Vector LaboratoriesPK-61008µl/ml
DAB 过氧化物酶底物试剂盒 Vector LaboratoriesSK-4100
RNA提取试剂盒Life technologiesKIT0204Arcturus PicoPure RNA 提取试剂盒
H2O2 30%SigmaHC4060
无水乙醇
激光显微切割系统徕卡显微系统Model AS-LMD
DEPCAlfa AesarB22753-14
生物分析仪安捷伦安捷伦 2100 生物分析仪
包埋模具 Leica Biosystems147022183116x8毫米
疏水屏障笔 Vector LaboratoriesH-4000
冷冻组织包埋介质Tissue-Tek4583
生物分析芯片安捷伦科技5067-1513Agilent 2100 生物分析仪配套使用的 RNA 6000 Pico LabChip
用于定量 PCR 的热启动反应混合液罗氏6402712001Fast Start Essential DNA Green Master
逆转录酶Life technologies11752-050qRT-PCR用SuperScript III第一链合成预混液

参考文献

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