本文介绍了一种将超声微泡造影剂注射到活体离体晚期妊娠阶段小鼠胚胎中的实验方案。该方法可利用增强型高频超声成像技术，研究胚胎内的灌注参数及血管分子标志物。
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本文内容
摘要
摘要
超声造影增强成像能够提供有关组织血管生成和灌注的重要定量信息，在靶向应用中还可促进在分子水平上检测和测量血管生物标志物。在小鼠胚胎中，这种无创技术可用于揭示早期小鼠循环系统中血管发育的基本机制，以及心血管疾病遗传模型中的相关机制。小鼠胚胎也是研究微泡与血管新生靶点（包括血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）或αvβ3）黏附特性以及评估分子超声定量特征的理想模型。因此，我们建立了一种将超声造影剂引入活体离体胚胎血管系统的方法。该方法在注射控制和位置选择方面具有灵活性，可重复获取无遮挡、无运动干扰的成像平面，并简化图像分析与定量过程。晚期妊娠阶段（胚胎日（E）16.6和E17.5）的小鼠胚胎从子宫中分离后，轻柔地从卵黄囊中取出，并将微泡造影剂注射至胎盘盘绒毛膜表面可及的静脉中。随后采用非线性对比超声成像技术，获取一系列基本灌注参数（峰值增强、流入速率和达峰时间），并在内皮糖蛋白小鼠模型中定量分析靶向微泡的结合情况。我们展示了微泡在活体胚胎中的成功循环，以及该方法在表征胚胎血管系统和微泡行为方面的实用性。
引言
超声造影成像利用微泡造影剂来可视化并表征血管微环境。这些造影剂可实现对微循环、血管分布及心血管功能的无创性评估。此外，通过对微泡表面进行修饰，可使其靶向结合血管内皮生物标志物，这已在血管生成、动脉粥样硬化和炎症等临床前应用中得到验证1,2，从而实现对血管事件的分子超声成像。因此，超声造影可用于识别影响正常与病变血管状态的复杂且多样的微环境3-5。
近年来，人们对微泡成像在多功能小鼠胚胎模型中应用价值的兴趣日益增加。作为哺乳动物发育的模型，将微泡引入胚胎血管系统可增强对发育中循环系统的生理学研究例如、血流、心输出量）以及心脏疾病转基因和靶向突变小鼠模型的情况 6,7，可能为基因因素如何改变心血管功能提供见解。事实上，对胚胎脑血管系统的定性和定量二维分析已经实现8此外，小鼠胚胎是研究靶向微泡与血管标志物结合的理想模型 体内. Bartelle 等9例如，已将链霉亲和素微泡注入胚胎心室，以评估Biotag-BirA转基因胚胎中靶向结合情况并观察血管解剖结构。杂合子和纯合子小鼠模型的构建也可作为肿瘤模型研究的替代手段，用于界定分子超声成像的定量特性——这是将该技术转化为临床应用的重要基准。
微泡通常通过剖腹手术暴露单个胚胎后，进行心内注射引入胚胎循环系统8-....
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方案
注意：本研究中进行的实验操作已获得加拿大安大略省多伦多市松树园研究所动物护理委员会的批准。必须始终遵守动物人道处理的操作规范。假设操作人员已接受过超声成像系统基本操作的培训。本方案由两人协作操作效果最佳。
1. 动物模型
- 与 CD-1 雄性与雌性小鼠交配 Mus musculus 以获取用于灌注研究的野生型胚胎。
- 对于分子成像研究，采用源自129/Ola品系的胚胎干细胞，通过同源重组方法生成Eng+/-小鼠，具体步骤参见Bourdeau的描述。 等14.
- 回交 B6- Eng+/- 小鼠，由Michelle Letarte博士惠赠，回交至CD-1遗传背景。使用 Eng+/- CD-1 回交 胚胎，以及它们的 Eng+/+ 同窝对照。交配小鼠以获得不同发育阶段的胚胎。
2. 实验准备
- 启动小鼠交配，并每天检查阴栓。胚胎发育第0.5天定义为观察到阴道栓当天的中午。
- 通过向500 ml高糖（4,500 mg/L）杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中加入50 ml胎牛血清、5 ml 1 M HE....
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结果
超声造影剂的注射进入 子宫外 小鼠胚胎的存活依赖于从子宫中成功分离出活的晚期妊娠阶段胚胎，并在注射及相关超声成像过程中维持其活力。一旦胚胎被移出并定位，如图所示 图1，可实现向胚胎血管系统精确注射造影剂。图中显示的是 E17.5 小鼠胚胎的典型 B 型超声图像 图2A通过使用非线性对比成像方法，可捕捉到微泡在下腔静脉、心脏、脑部以及整个动物体内的灌注过程及相应的增强效应，从而验证该技术的可行性。各个时间点的情况如图所示。 图 2B 并显示随时间变化的对比度变化。
通过记录微泡团注全过程的流入和清除阶段，可以测量多种灌注参数。在离线分析中，使用对比区域轨迹工具在胚胎左、右脑半球分别创建1.5 mm2的兴趣区（ROI）。然后将这些兴趣区内的平均信号强度随时间变化绘制成曲线，并采用七点中值滤波器进行平滑处理。根据所得的对比强度曲线（见图2C），确定脑部峰值增强程度。流入速率定义为峰值增强（PE）10%至50%之间的.......
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讨论
将超声造影剂注入晚期妊娠的小鼠胚胎，并获取非线性对比图像，以测量灌注参数及靶向微泡的结合情况。成功成像胚胎血管系统内的微泡依赖于多个因素，首要因素是胚胎的存活能力。所有设备和器械均需提前准备，以最大限度缩短从子宫中取出胚胎到开始注射之间的时间。由于目前尚未详细研究单次或重复麻醉暴露对胚胎小鼠的影响，因此在母体牺牲前避免使用麻醉剂16。在胚胎分离过程中，应防止卵黄囊受损，并确保胚胎始终保存在频繁更换的新鲜胚胎培养基中并保持低温。在注射前暴露胚胎及固定过程中，应避开主要的卵黄静脉血管，以减少出血风险，因为出血可能致命。我们发现，在复苏胚胎时，最好先用磷酸盐缓冲液（PBS）覆盖胎盘，再覆盖胚胎，然后前后移动涂抹超声耦合剂，并用镊子清除任何较大的气泡。随后，将平皿其余部分充满PBS。使用耦合剂和PBS可最大限度减少胚胎与探头之间形成气袋的可能性，从而影响图像质量。随着胚胎复苏，血液开始流动，脐动脉可见明显的搏动，而脐静脉则呈现鲜红色23。作为参考，脐静脉在胎盘表面发出的分支通常位于脐动脉分支的上方。尽管可将微泡注射至胎盘迷路区的小动脉，但顺血流方向注射可减少胎盘出血；此外，静脉注射还允许微泡先直接通过.......
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披露
F.S. Foster 承认其担任 VisualSonics Inc. 顾问的角色。
致谢
本工作由加拿大国家癌症研究所的特里·福克斯项目资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| <强>试剂 | |||
| <强>抗体 （生物素标记，eBioscience） — 抗体的选择取决于实验 | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | 该抗体/微泡组合常被用作实验对照 |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| 生物素标记的大鼠 MJ 7/18 抗小鼠内皮糖蛋白抗体 | 自研杂交瘤 | 外部抗体也可能适用：我们 曾使用过 eBioscience（13-1051-85） | |
| 蒸馏水 | |||
| <强>胚胎培养基 | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | 批号 # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 ml，1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 ml，10,000 单位青霉素，10,000 μg Strep |
| 70% 乙醇 | |||
| 冰 | |||
| 多聚甲醛 | Sigma | 76240 | 4% |
| 磷酸盐缓冲液 [1x] | Sigma | D8537 | 1倍浓度，不含氯化钙 &和氯化镁 |
| 中国台湾，CD-1 孕鼠 | 查尔斯河实验室公司 | ||
| 0.9% 氯化钠（生理盐水） | Hospira | 0409-7984-11 | |
| 超声造影剂，靶向与非靶向 | MicroMarker；VisualSonics 公司 | ||
| 超声耦合剂（Aquasonic 100，无色） | CSP Medical | 133-1009 | |
| <强>仪器设备 | |||
| 细胞培养板（4）： 100 x 20 毫米 | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| 细胞培养板（12）：60 x 15 毫米 | Sigma | D8054 | |
| 离心 | Sorvall Legend RT 离心机 | ||
| 50 ml BD Falcon 锥形管 | VWR | 21008-938 | |
| 稀释液 | 贝克曼库尔特 | Isoton II 稀释液，8448011 | |
| 解剖剪（Wagner） | 精细科学工具 | Wagner 14068-12 | |
| 镊子（2 把），Dumont SS（0.10 × 0.06 mm） | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| 镊子，碎屑 | VWR | 25601-134 | |
| 玻璃烧杯，2 L（Griffin 型烧杯） | VWR | 89000-216 | |
| 玻璃毛细管，1 x 90 mm GD-1 带灯丝 | Narishige | GD-1 | |
| 玻璃针拉制仪 | Narishige | PN-30 | |
| 手套 | 安塞尔 | 4002 | |
| 大体解剖探针 | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| 加热板 | VWR | 89090-994 | |
| 冰桶 | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| 成像平台 | VisualSonics 公司 | 集成轨道系统 | |
| 光源，光纤 | Fisher Scientific | 12-562-36 | 理想情况下应具有可调节的臂部 |
| Luers (12)，聚丙烯倒钩雌接头 ¼-28 UNF 螺纹 | Cole Parmer | 45500-30 | |
| 微型超声系统，高频 | VisualSonics 公司 | Vevo2100 | |
| 21号针头 (1”) | VWR | 305165 | |
| 粒径分析仪 | 贝克曼库尔特 | Multisizer 3 库尔特计数器 | |
| 穿孔勺（Moria） | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| 大头针（6个），黑色阳极氧化微型针，直径0.15 mm | 精细科学工具 | 26002-15 | |
| 移液器 [2-20 μl，20-200 μ100-1,000 l μl] | Eppendorf | 研究增强 可调 3120000038 3120000054; 3120000062 | |
| 移液器吸头 [2-200 μl，50-1,000 μl] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; 022491351 | |
| 剪刀 | |||
| Sylgard 184 硅酮弹性体试剂盒 | 道康宁 | ||
| 导管，Tygon 实验室 1/32” x 3/32” | VWR | 63010-007 | |
| 木制涂抹棒（棉签，棉头） | VWR | CA89031-270 | |
| 手术显微镜 5-8倍放大 | Fisher Scientific | Steromaster | |
| 1 ml Normject 注射器 | Fisher | 14-817-25 | |
| 注射器（10个），30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| 注射泵 | Bio-lynx | NE-1000 | |
| 温度计，-20 至 110 °C | VWR | 89095-598 | |
| 计时器 | VWR | 33501-418 | |
| 离心管，Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| 试管架（3） | VWR | 82024-462 | |
| 超声换能器，20 MHz | VisualSonics 公司 | MS250 | |
| 万纳斯-蒂宾根，向上倾斜 | Fine Science Tools | 15005-08 |
参考文献
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
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