一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

摘要

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。

摘要

被称为类器官的肠道隐窝-绒毛结构，在添加适当生长因子的条件下，可进行长期的三维培养。由于类器官在稳态干细胞分化、细胞极性以及终末分化细胞类型的组成方面均与原始组织高度相似，能够反映成年肠道上皮的所有已知特征，因此它们已成为上皮组织实验研究中的重要资源。利用慢病毒或逆转录病毒载体在类器官中表达外源基因或干扰RNA的技术，极大拓展了对肠道上皮及肠道干细胞进行功能分析的可能性，在速度和成本上均优于传统的转基因小鼠模型。在本视频方案中，我们展示了如何利用慢病毒载体对小肠类器官进行转导，具体示例包括使用多西环素诱导型外源基因或IPTG诱导型短发夹RNA，以实现基因过表达或基因敲低。此外，考虑到类器官培养所获得的细胞数量极少，且实验处理可能进一步减少细胞量，我们还详细说明了如何对类器官进行处理，以用于后续的定量RT-PCR、RNA微阵列分析和免疫组织化学检测。这些实现外源基因表达和基因敲低的技术，进一步提升了肠道类器官这一上皮结构在科研中的应用潜力，确立了类器官培养作为细胞培养的新标准。

引言

肠上皮是体内增殖最迅速的组织之一，因此在癌症和干细胞研究领域引起了广泛关注。2009年，一种可在Matrigel中长期培养小肠隐窝并维持其三维结构的技术被发表¹。这些被称为肠类器官的结构可通过标准技术进行培养，培养基中需添加多种明确的生长因子，包括Bmp信号通路抑制剂noggin（Nog）、Wnt信号通路增强剂rspondin 1（Rspo1）以及表皮生长因子（Egf），这些因子均被发现可促进肠上皮细胞的增殖^2-4。

类器官在多个方面优于传统的癌细胞系，例如它们未发生突变，保留了干细胞层级结构，具有完整的细胞极性，并能分化为新生小肠上皮中所有类型的细胞谱系。由于类器官可通过转导携带外源基因或RNA干扰载体⁵，因此被广泛用于研究特定的遗传元件，在成本和实验速度方面优于使用转基因小鼠的研究。类器官中的转基因表达可通过小鼠逆转录病毒或慢病毒载体实现^6,7。由于小鼠逆转录病毒仅能转导处于有丝分裂状态的细胞⁸，存在应用局限，因此对于类器官等难以感染的细胞，慢病毒转导更为常用。

经病毒转导并稳定表达转基因的类器官可用于多种下游分析，包括定量RNA分析和免疫组织化学。综上所述，由原代肠上皮细胞培养类器官已发展为一种常规技术，无需特殊实验室条件即可轻松实施，并已成为肠道上皮研究中细胞培养的新型标准。

方案

1. 转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）的制备

1. 将约150 mg的PEI溶解于100 ml的H₂O中。
2. 逐滴加入HCl调节溶液pH至7.4，直至溶液变澄清，并持续搅拌至完全溶解，此过程可能需要10至60分钟，然后加水定容至终浓度为1 mg/ml。
3. 溶液澄清后，将PEI溶液经无菌0.22 µm滤膜过滤，分装为每份5 ml，于-80 °C冰箱中保存。

2. 慢病毒颗粒的制备

第1天：

1. 将HEK293T细胞以60%-80%的融合度接种于162 cm²培养瓶或大型培养皿中，培养基为细胞系培养液（DMEM，添加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM谷氨酰胺补充剂）。

第2天：

2. 通过将慢病毒包装载体（7 µg pVSVg；5 µg pRSV rev；13 µg pMDL）与20 µg编码目的基因或目的shRNA的慢病毒质粒混合，制备含45 µg总质粒DNA的DNA转染溶液。用DMEM调整体积至1 ml。
3. 将90 µl浓度为1 mg/ml的PEI加入930 µl DMEM中，制备PEI转染溶液，并在室温下孵育5分钟。
4. 将DNA转染溶液加....

结果

类器官慢病毒转导

使用慢病毒颗粒进行类器官转导的技术依赖于在转导前后对类器官的正确处理。类器官（图3A）经过培养后被解离为单个隐窝结构（图3B）。如先前报道，这些单个隐窝在存在GSK3抑制剂Chir99021的条件下培养时，会发展为囊状隐窝⁹（图3C）。随后对类器官进行胰蛋白酶消化，以使病毒颗粒能够进入单个细胞。在使用慢病毒颗粒转导细胞时，可尝试多种方法以提高转导效率，例如离心增强转导（spinoculation）或延长孵育时间。本实验采用高滴度的PGK-eGFP慢病毒，以便通过荧光显微镜观察转导效率。该质粒对类器官的转导效率很高，接近100%（图4E, F）。因此，通过离心增强转导（图4A, B）或延长与慢病毒颗粒的孵育时间（图4C, D）来进一步提高效率并未带来额外收益。

R.......

讨论

本视频方案描述了利用慢病毒转导原代肠上皮类器官，并通过定量RNA技术及免疫组织化学方法对这些类器官进行下游分析的过程。

慢病毒转导通常在培养板中的贴壁细胞或悬浮细胞中进行。由于类器官具有三维结构，病毒颗粒难以穿透，因此常采用多种方法以提高转导效率。使用 Chir99021 预处理类器官可促进其增殖，从而提高转导后的存活率。胰蛋白酶消化后应保持较小的细胞簇，因为单个细胞的存活率较低。与使用小鼠逆转录病毒的转导相比，慢病毒转导效率更高，通常无需采用离心增强转导（spinoculation）技术，后者虽已被证明可提高胚胎干细胞中的转导效率¹⁰。当使用小鼠逆转录病毒或慢病毒转导效率较低时，可选择性地采用离心增强转导以提高转导率。我们通常不检测病毒滴度，因为所有来自单次制备的病毒均用于转导最多两个面积为 0.95 cm² 培养孔所获得的类器官。此外，通常会使用抗生素筛选以去除未转导的细胞。然而，当遇到转导效率问题时，检测病毒滴度可能具有参考价值。

与贴壁细胞相同，提高筛选抗生素的浓度可增加病毒.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
聚乙烯亚胺	Polysciences	23966-2
DMEM 培养基	Lonza	BE12-614F
胎牛血清	Lonza	DE14-801F
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
谷氨酰胺	Invitrogen	25030-024
Matrigel	BD	BD 356231
高级 DMEM-F12	Gibco	12634-010
N2	Invitrogen	17502-048
B27	Invitrogen	17504-044
N-乙酰半胱氨酸	Sigma	A9165-1G
小鼠 EGF	Invitrogen	PMG8045
HEPES 1 M	Invitrogen	15630-056
GlutaMAX 100x	Invitrogen	35050-038
Chir 99021	Axon	1386
Y27632	Sigma	Y0503-5MG
聚凝胺	Sigma	107689
烟酰胺	Sigma	N0636
胰蛋白酶	Lonza	BE02-007E
嘌呤霉素	Sigma	P 7255
RNeasy mini 试剂盒	Qiagen	74106
β-巯基乙醇	Merck	8,057,400,0250
Ovation Pico WTA 系统	NuGen	3300-12
多聚甲醛	Sigma	252549-1L
玻璃小瓶，锥形，12 mm × 75 mm，5 mL	VWR	LSUKM12
伊红黄	VWR	1,159,350,025