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方法文章

一种用于肠道类器官慢病毒转导及下游分析的实验方案

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DOI：

10.3791/52531

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2015年4月20日

 ,  ,  ,  , 
1Tytgat Institute for Liver and Intestinal Research, Department of Gasteroenterology and Hepatology, Academical Medical Center

本文内容

摘要

在本视频方案中，我们将逐步讲解如何对原代肠上皮类器官进行慢病毒转导，并介绍这些培养物的后续处理及定量RT-PCR、RNA微阵列和免疫组织化学分析方法。

摘要

被称为类器官的肠道隐窝-绒毛结构，在添加适当生长因子的条件下，可进行长期的三维培养。由于类器官在稳态干细胞分化、细胞极性以及终末分化细胞类型的组成方面均与原始组织高度相似，能够反映成年肠道上皮的所有已知特征，因此它们已成为上皮组织实验研究中的重要资源。利用慢病毒或逆转录病毒载体在类器官中表达外源基因或干扰RNA的技术，极大拓展了对肠道上皮及肠道干细胞进行功能分析的可能性，在速度和成本上均优于传统的转基因小鼠模型。在本视频方案中，我们展示了如何利用慢病毒载体对小肠类器官进行转导，具体示例包括使用多西环素诱导型外源基因或IPTG诱导型短发夹RNA，以实现基因过表达或基因敲低。此外，考虑到类器官培养所获得的细胞数量极少，且实验处理可能进一步减少细胞量，我们还详细说明了如何对类器官进行处理，以用于后续的定量RT-PCR、RNA微阵列分析和免疫组织化学检测。这些实现外源基因表达和基因敲低的技术，进一步提升了肠道类器官这一上皮结构在科研中的应用潜力，确立了类器官培养作为细胞培养的新标准。

引言

肠上皮是体内增殖最迅速的组织之一，因此在癌症和干细胞研究领域引起了广泛关注。2009年，一种可在Matrigel中长期培养小肠隐窝并维持其三维结构的技术被发表1。这些被称为肠类器官的结构可通过标准技术进行培养，培养基中需添加多种明确的生长因子，包括Bmp信号通路抑制剂noggin（Nog）、Wnt信号通路增强剂rspondin 1（Rspo1）以及表皮生长因子（Egf），这些因子均被发现可促进肠上皮细胞的增殖2-4。

类器官在多个方面优于传统的癌细胞系，例如它们未发生突变，保留了干细胞层级结构，具有完整的细胞极性，并能分化为新生小肠上皮中所有类型的细胞谱系。由于类器官可通过转导携带外源基因或RNA干扰载体5，因此被广泛用于研究特定的遗传元件，在成本和实验速度方面优于使用转基因小鼠的研究。类器官中的转基因表达可通过小鼠逆转录病毒或慢病毒载体实现6,7。由于小鼠逆转录病毒仅能转导处于有丝分裂状态的细胞8，存在应用局限，因此对于类器官等难以感染的细胞，慢病毒转导更为常用。

经病毒转导并稳定表达转基因的类器官可用于多种下游分析，包括定量RNA分析和免疫组织化学。综上所述，由原代肠上皮细胞培养类器官已发展为一种常规技术，无需特殊实验室条件即可轻松实施，并已成为肠道上皮研究中细胞培养的新型标准。

在类器官中进行病毒转导及后续下游分析的技术操作繁琐耗时。为了辅助类器官实验，我们制作了本视频方案，展示对培养的类器官进行慢病毒转导的方法。我们还进一步说明了如何通过正确处理类器官以提高得率，从而增强基于RNA技术或免疫组织化学的下游分析效果。本方案中仅使用了源自小肠隐窝的类器官，但所述技术同样适用于结肠类器官。

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方案

1. 转染试剂聚乙烯亚胺（PEI）的制备

  1. 将约150 mg的PEI溶解于100 ml的H2O中。
  2. 逐滴加入HCl调节溶液pH至7.4，直至溶液变澄清，并持续搅拌至完全溶解，此过程可能需要10至60分钟，然后加水定容至终浓度为1 mg/ml。
  3. 溶液澄清后，将PEI溶液经无菌0.22 µm滤膜过滤，分装为每份5 ml，于-80 °C冰箱中保存。

2. 慢病毒颗粒的制备

第1天：

  1. 将HEK293T细胞以60%-80%的融合度接种于162 cm2培养瓶或大型培养皿中，培养基为细胞系培养液（DMEM，添加10%胎牛血清、1%青霉素/链霉素和2 mM谷氨酰胺补充剂）。

第2天：

  1. 通过将慢病毒包装载体（7 µg pVSVg；5 µg pRSV rev；13 µg pMDL）与20 µg编码目的基因或目的shRNA的慢病毒质粒混合，制备含45 µg总质粒DNA的DNA转染溶液。用DMEM调整体积至1 ml。
  2. 将90 µl浓度为1 mg/ml的PEI加入930 µl DMEM中，制备PEI转染溶液，并在室温下孵育5分钟。
  3. 将DNA转染溶液加入PEI溶液中。涡旋振荡或反复倒置数次，室温孵育5分钟，以获得DNA转染复合物。
  4. 将2 ml DNA转染溶液滴加至HEK293T细胞中，在37 °C、湿润的细胞培养箱中孵育4小时。
  5. 4小时后更换培养基以去除PEI。添加新培养基前无需洗涤细胞。
    注意：PEI具有细胞毒性，孵育时间超过4小时可能对HEK293T细胞造成损伤。

第4天：

  1. 弃去上清液，加入新鲜培养基。保留上清液（含有病毒），此上清液将在步骤 2.10 中使用。
  2. 将上清液转移至 15 ml 离心管中。为去除死细胞，以 500 × g 离心 5 分钟。
  3. 使用较大的 60 ml 注射器将上清液通过 0.45 µm 滤膜过滤。于 4 °C 过夜保存。

第5天：

  1. 收集第二批上清液；按照步骤 2.8–2.9 进行离心和过滤。
  2. 将步骤 2.9 和 2.10 中获得的上清液合并至超速离心管中，在超速离心机中以 50,000 × g 离心 90 分钟。
  3. 非常小心地取出装有超速离心管的转头外壳，放入超净工作台中，并记住离心时离心管在转头中的方向。
  4. 打开盛有超速离心管的转头外壳，小心倾倒上清液，使沉淀位于管的上方一侧。由于病毒沉淀可能难以观察，需记住沉淀形成于管的哪一侧。使用移液器小心吸除残留的上清液，注意不要扰动可见于超速离心管底部侧壁的不透明棕褐色沉淀。
  5. 将该沉淀重悬于 500 µl 器官样培养基中，培养基中添加 10 mM 烟酰胺、10 µM Chir99021、10 µM Y27632 和 8 µg/ml 多聚素（polybrene）。使用该培养基重悬至关重要，因为需使用高滴度病毒直接转导器官样结构。
  6. 可选步骤：将病毒在该培养基中分装为两份，每份 250 µl，于 -80 °C 冻存。

3. 类器官的慢病毒转导

第0天：

  1. 在转导前两天，将一个完整的0.95 cm2培养孔中的类器官分种至新孔中，目标获得约50个小型类器官。类器官的分种操作请参照先前发表的方案1（图3A、B）。
  2. 在类器官培养基中添加10 µM Chir99021和10 mM烟酰胺，以获得囊状高增殖性隐窝（图3C）。
    注意：当新分种的类器官在含有Chir99021的条件下培养时，囊状隐窝的发育效果最佳。

第2天：

  1. 使用移液器反复吹打 Matrigel 和培养基，利用 1000 µL 微量移液器破坏类器官混合物，随后将混合物转移至 15 mL 离心管中。
  2. 使用尖端开口经熔融缩小的巴斯德移液器进一步破坏类器官。在 100 × g 条件下离心 5 分钟，使类器官沉淀。
    注意：离心速度需根据离心机型号进行调整。必须确定能够使破碎后的类器官与混合物有效分离的精确离心速度。
  3. 弃去上清液，加入 500 µl 预热的 1× 胰蛋白酶溶液（相当于 0.25% 胰蛋白酶）。将类器官重悬于胰蛋白酶中，并在 37 °C 水浴中孵育 3 分钟。
  4. 加入 3.5 ml 细胞系培养基（DMEM，添加 10% FCS、1% 青霉素/链霉素和谷氨酰胺）以终止胰蛋白酶反应。在 500 × g 条件下离心 5 分钟。
  5. 弃去上清液，保留约 20 µl 培养基中的沉淀。将含有少量培养基的类器官转移至 48 孔板中的一个孔内。
  6. 按照步骤 2.14 所述，在转导培养基中加入高滴度慢病毒，重悬后继续进行步骤 3.10。若转导效率较低，可增加步骤 3.9。
    注意：为实现高效转导，通常向一个类器官孔中加入 250 µl 高滴度慢病毒的一份等分试样。这相当于本方案第 2 步所述单次制备所得慢病毒总量的 50%。
  7. 可选：为提高转导效率，可进行自旋感染（spinoculation），即将含有类器官的 48 孔板置于预热至 32 °C 的离心机中，在 600 × g 条件下旋转 1 小时。
  8. 将类器官-病毒混合物放入培养箱，在 37 °C 条件下孵育 1 小时，以促进转导过程。
  9. 可选：为进一步提高转导效率，可在培养箱中继续于 37 °C 孵育类器官额外 3 小时。
  10. 加入 1 ml 类器官培养基，重悬类器官-病毒混合物，转移至微量离心管中，在微量离心机中以 850 × g 离心 5 分钟，使类器官沉淀。
  11. 弃去上清液，将沉淀重悬于 20 µl 冰冷的 Matrigel 中。由于该材料在温度升高时会凝固，建议使用经多次反复吸取冰冻 PBS 预冷的枪头进行操作。
  12. 将液滴置于 48 孔板每孔中央，在 37 °C 培养箱中孵育 15 分钟，使其凝固。
  13. 15 分钟后，小心加入 250 µl 类器官培养基，并补充 10 mM 烟酰胺、10 µM Chir99021 和 10 µM Y27632。破碎后的类器官小片段将在 24 小时内形成小型囊状类器官。

第5天：

  1. 更换培养基，并添加筛选抗生素（使用嘌呤霉素时，浓度为 4 µg/ml）。

第7天：

  1. 更换为添加了筛选抗生素的标准类器官培养基。
    注意：在撤除 Chir99021 后 2-3 周，出芽过程将完成。筛选后，类器官可在不含筛选抗生素的条件下培养。

4. 类器官RNA制备用于定量RT-PCR或微阵列分析

  1. 进行RNA制备时，按照试剂盒生产商的说明书使用商业试剂盒。移除类器官的培养基，直接向含有类器官的Matrigel半球中加入350 µl含β-巯基乙醇的RLT缓冲液。使用P1000移液器吹打重悬材料。
  2. 根据生产商说明书继续完成后续RNA制备步骤。
  3. 可选：使用Ovation Pico WTA系统进行扩增以提高RNA得率，初始需加入总量为50 µg的RNA，具体操作依据生产商说明书。
  4. 可选：在进行RNA微阵列分析前，使用2100生物分析仪配合真核生物总RNA纳米芯片对样本进行质量控制检测，目标RNA完整性数值（RIN）应达到8.5或以上（图5），具体操作依据生产商说明书。

5. 类器官的石蜡包埋与免疫组织化学处理

  1. 在开始类器官包埋前，将一个带有可容纳12 mm直径玻璃管孔洞的铝块放入70 °C的培养箱中预热，以保持石蜡处于液态。
  2. 取一个含有完全生长的类器官的单孔，移除培养基，保留包埋的类器官完整无损。
  3. 直接向孔中加入1 ml 4%多聚甲醛PBS溶液，并在4 °C下固定1小时至过夜。
  4. 用1 ml冰冷的PBS替换多聚甲醛。
    可选：此步骤后可将固定的类器官在4 °C下保存于PBS中，最长可达1周。
  5. 将固定的类器官重悬于1 ml PBS中，并转移至玻璃小瓶中。
  6. 让类器官静置沉降至底部约1分钟，弃去PBS，加入70%乙醇，并在其中溶解数滴伊红溶液，以便在包埋过程中可视化类器官。
  7. 将类器官置于室温下的70%乙醇中。30分钟后，小心倾去70%乙醇，由于伊红染色呈现轻微粉红色，可肉眼观察到类器官。更换为96%乙醇。
  8. 重复步骤5.7，每次更换为下一种试剂。依次使类器官经过以下溶液：70%乙醇、90%乙醇、96%乙醇、100%乙醇、100%乙醇、二甲苯、二甲苯。
  9. 倾去最后一次二甲苯洗涤液，向管中倒入石蜡。立即将管放入预热至70 °C的铝块中，孵育30分钟，然后更换为新鲜干净的石蜡。
  10. 倒出石蜡，使用预热的大口巴斯德吸管将类器官转移至石蜡包埋模具中。使用本生灯保持巴斯德吸管处于温热状态。将所有类器官置于液态石蜡的一薄层中。
  11. 尽可能使用加热的解剖针将所有类器官调整至石蜡包埋模具的中心位置。使用本生灯保持解剖针温热。
  12. 当类器官在模具中的位置满意后，轻微冷却模具以使石蜡层凝固。
  13. 在顶部再倒入更多石蜡完成包埋块，并加入标准组织学包埋盒。

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结果

类器官慢病毒转导

使用慢病毒颗粒进行类器官转导的技术依赖于在转导前后对类器官的正确处理。类器官（图 3A）经培养后被解离为单个隐窝结构（图 3B）。如先前报道，这些单个隐窝在存在GSK3抑制剂Chir99021的条件下培养时，会发育为囊状隐窝9（图 3C）。随后对类器官进行胰酶消化，以使病毒颗粒能够进入单个细胞。在使用慢病毒颗粒进行细胞转导时，可尝试多种方法以提高转导效率，例如离心增强转导（spinoculation）或延长与病毒颗粒的孵育时间。本研究使用高滴度的PGK-eGFP慢病毒，以便通过荧光显微镜观察转导效率。该质粒对类器官的转导效率很高，接近100%（图 4E, F）。因此，采用离心增强转导（图 4A, B）或延长与慢病毒颗粒孵育时间（图 4C, D）并未带来额外的提升效果。

...

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讨论

本视频方案描述了利用慢病毒转导原代肠上皮类器官，并通过定量RNA技术及免疫组织化学方法对这些类器官进行下游分析的过程。

慢病毒转导通常在培养板中的贴壁细胞或悬浮细胞中进行。由于类器官具有三维结构，病毒颗粒难以穿透，因此常采用多种方法以提高转导效率。使用 Chir99021 预处理类器官可促进其增殖，从而提高转导后的存活率。胰蛋白酶消化后应保持较小的细胞簇，因为单个细胞的存活率较低。与使用小鼠逆转录病毒的转导相比，慢病毒转导效率更高，通常无需采用离心增强转导（spinoculation）技术，后者虽已被证明可提高胚胎干细胞中的转导效率10。当使用小鼠逆转录病毒或慢病毒转导效率较低时，可选择性地采用离心增强转导以提高转导率。我们通常不检测病毒滴度，因为所有来自单次制备的病毒均用于转导最多两个面积为 0.95 cm2 培养孔所获得的类器官。此外，通常会使用抗生素筛选以去除未转导的细胞。然而，当遇到转导效率问题时，检测病毒滴度可能具有参考价值。

与贴壁细胞相同，提高筛选抗生素的浓度可增加病毒...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

J. Heijmans 获得荷兰癌症基金会（KFW）提供的奖学金资助。G.R. van den Brink 获得欧洲研究理事会欧洲共同体第七框架计划（FP7/2007-2013）资助协议编号 241344 以及荷兰科学研究组织（GvdB）VIDI 项目资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
聚乙烯亚胺Polysciences23966-2
DMEM 培养基LonzaBE12-614F
胎牛血清LonzaDE14-801F
青霉素-链霉素Invitrogen15140-122
谷氨酰胺Invitrogen25030-024
MatrigelBDBD 356231
高级 DMEM-F12Gibco12634-010
N2Invitrogen17502-048
B27Invitrogen17504-044
N-乙酰半胱氨酸SigmaA9165-1G
小鼠 EGFInvitrogenPMG8045
HEPES 1 MInvitrogen15630-056
GlutaMAX 100xInvitrogen35050-038
Chir 99021Axon1386
Y27632 SigmaY0503-5MG
聚凝胺Sigma107689
烟酰胺SigmaN0636
胰蛋白酶LonzaBE02-007E
嘌呤霉素SigmaP 7255
RNeasy mini 试剂盒Qiagen74106
β-巯基乙醇Merck8,057,400,0250
Ovation Pico WTA 系统NuGen3300-12
多聚甲醛Sigma252549-1L
玻璃小瓶，锥形，12 mm × 75 mm，5 mLVWRLSUKM12
伊红黄VWR1,159,350,025

参考文献

  1. Sato, T., et al. Single Lgr5 stem cells build crypt-villus structures in vitro without a mesenchymal niche. Nature. 459 (7244), 262-265 (2009).
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