本文描述了一种从手术切除的结肠肿瘤及正常组织中分离原代人源细胞的实验方案。分离得到的细胞随后被培养在经细胞外基质蛋白功能化处理、并嵌入荧光微球的软性弹性基质（聚丙烯酰胺凝胶）上。通过牵引力显微镜技术评估细胞的收缩应力。
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本文内容
摘要
摘要
癌细胞通过由黏附受体及相关的信号转导膜蛋白、细胞骨架结构和分子马达组成的协调性、层级化的力-化学系统，以复杂的方式响应基质的力学刚度1, 2不同癌细胞的机械敏感性 体外 主要使用永生化细胞系或小鼠来源的原代细胞进行研究，而非原代人类癌细胞。因此，关于原代人类结肠癌细胞的机械敏感性知之甚少 体外在此，我们开发了一种优化的实验方案，用于从健康和癌变的人体手术组织样本中分离原代人结肠细胞。分离得到的结肠细胞随后被成功培养于柔软（2 kPa 刚度）、坚硬（10 kPa 刚度）的聚丙烯酰胺水凝胶以及刚性聚苯乙烯基底（~3.6 GPa 刚度）上，这些基底均通过细胞外基质蛋白（本实验中为纤连蛋白）进行功能化修饰。在靠近细胞培养表面的柔软凝胶中嵌入荧光微球，并利用免费开源软件进行牵引力测定，以评估细胞的收缩应力。此外，在不同刚度的基底上进行免疫荧光显微镜观察，可获得关于原代细胞形态、细胞骨架组织以及含纽蛋白（vinculin）的黏着斑随基底刚度变化的有用信息。
引言
近年来，越来越多的证据表明，除了生化因素外，机械微环境在调控细胞功能方面也起着重要作用。细胞能够感知并响应其所黏附（如二维培养）或所处（如三维培养）基质的刚度3-7。通过这种方式，细胞可以调节其分化3、形态4、迁移/运动能力5、生物物理特性6、生长7以及其他过程。
癌细胞也会通过整合黏附受体及其相关的信号转导膜蛋白、细胞骨架结构和分子马达，以协调的、多层次的力学-化学机制响应二维（2D）和三维（3D）基质的刚度1, 2。例如，当在刚度约为150 Pa（类似于正常乳腺组织刚度）的基质上培养时，乳腺上皮细胞（MECs）可形成正常的腺泡实质结构；而有趣的是，当在模拟肿瘤间质刚度的较硬基质（> 5,000 Pa）上培养时，它们则表现出发育中肿瘤的结构和转录特征8。此外，另一项实验表明，乳腺肿瘤的发生伴随着胶原交联和细胞外基质（ECM）的硬化9。最近的研究显示，当人结肠癌（HCT-8）细胞在具有生理相关刚度（20–47 kPa）的二维基质上培养时，会表现出类似转移的表型（MLP），但在非常坚硬的基质（3.6 GPa）上则不会出现该表型10-12。这些细胞首先形成类似肿瘤的细胞簇，随后从边缘开始彼此解离。随着上皮样到圆形的形态转变（E到R转变）的发生，细胞开始增殖....
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方案
以下所述方案遵循伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校人类研究伦理委员会的指导原则。
1. 外科组织样本的采集与消化
- 在结肠切除术后立即采集肿瘤组织样本（图 1A 和 1B）。同时从邻近的健康部位采集组织样本。
- 立即将组织转移至含有 12 ml HBSS 溶液的 15 ml 离心管中。将离心管置于装有冰块的隔热泡沫箱内保存。
- 在 45 分钟内将含组织的离心管运送至组织培养超净台进行后续处理。在超净台内将离心管置于冰块上。
- 用移液器将所提供的组织转移至含有 6–7 ml HBSS 溶液的 6 孔板中。
注意：此冲洗步骤中每孔的组织量无需精确。 - 将 6 孔板置于冰块上。用 HBSS 溶液冲洗组织两次。
- 使用无菌剪刀将组织整齐地剪成独立片段，再用无菌手术刀片将组织切碎为不超过 1–2 mm3 大小的小块。
- 在转移组织前，称量一支已标记的含 0.1% 胰蛋白酶溶液（1 ml）的离心管。用移液器将约 20 mg 组织转移至每支 0.1% 胰蛋白酶管中。
- 尽量减少将 HBSS 转移至胰蛋白酶管中，以避免胰蛋白酶进一步稀释。
- 组织转移后再次称量胰蛋白酶管，记录前后重量差作为组织质量。
- 将约 20 mg 组织和 1 ml 胰蛋白酶溶液加入 ....
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结果
上述方案已根据机构审查委员会的指导，成功应用于四位不同患者的多个组织样本（n=12）。图1A展示了手术后具有代表性的结直肠肿瘤，从中获取用于细胞培养的组织切片。将组织转移至超净工作台进行后续处理后，在HBSS溶液中的典型组织切片如图1B所示。图2展示了将手术组织样本消化并酶解为单细胞悬液的示意图。
成功解离组织后，将分离得到的原代人源细胞接种于PA凝胶和聚苯乙烯培养皿上。相差显微图像（图3A 和 3B）展示了原代人源结肠癌细胞及正常细胞在不同基质刚度下的典型形态。可见，无论是健康还是癌变的原代结肠细胞，在聚苯乙烯培养皿上的铺展程度均高于PA凝胶（图3A 和 3B）。
在通过病理学H&E染色确认浸润性腺癌后（图4A），于包被了细胞外基质（纤连蛋白）的2 .......
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讨论
细胞牵引力最近已成为一种潜在的生物物理指标，可用于指示转移状态13。然而，迄今为止，文献中尚无关于原代肿瘤细胞的实验性牵引力数据。此外，将分离的原代结肠细胞直接培养在不同刚度的聚丙烯酰胺凝胶上也尚未见报道。因此，我们建立了优化的原代结肠细胞在凝胶和聚苯乙烯表面的培养条件（图2）。在软凝胶制备过程中，将荧光微珠包埋于细胞培养表面附近，可实现对原代人源细胞产生的位移场和牵引力的测量（图4C、4D 和 4E）。此外，免疫荧光检测可提供有关细胞骨架组织和黏着斑在基底刚度变化下的重要信息（图5A–5D）。需要注意的是，不同的癌细胞系和正常永生化细胞系也表现出随着基底刚度增加，细胞铺展增强、肌动蛋白应力纤维束形成增多以及成熟且伸长的黏着斑增多的现象4, 24–25。
该方案可轻松采用或修改，用于从不同人体器官或其他动物的手术组织中分离原代细胞。组织在.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本项目由美国国家科学基金会ECCS资助项目10-02165以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校跨学科创新计划资助项目12035提供资金支持。M.Y.A.在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的研究工作由美国国立卫生研究院国家癌症研究所纳米技术抗癌联盟“中西部癌症纳米技术培训中心”资助项目R25 CA154015A提供资助。免疫染色与共聚焦显微镜成像实验在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校基因组生物学研究所（IGB）完成。M.Y.A.感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的B. J. Williams就分离实验提供的讨论与建议。M.Y.A.感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的C. Nemeh和Abdul Bhuiya在示意图绘制和材料清单准备过程中提供的帮助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| HBSS | Life technologies | 14175-095 | |
| PBS | Lonza | 17-516F | |
| 胰蛋白酶 | Worthington | LS003736 | |
| 胶原酶 | Worthington | LS004176 | |
| 3-氨基丙基三甲氧基硅烷（ATS） | Sigma-Aldrich | 281778 | |
| 戊二醛 | Polysciences, Inc. | 01201-5 | |
| 丙烯酰胺 | Sigma-Aldrich | A4058 | |
| N-亚甲基双丙烯酰胺（bis） | Sigma-Aldrich | M1533 | |
| HEPES 缓冲液 | Sigma-Aldrich | 83264 | |
| 过硫酸铵 | Bio-Rad | 161-0700 | |
| 人纤维连接蛋白 | BD biosciences | 354008 | |
| 水合肼 | Sigma-Aldrich | 18412 | 危险品 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich | A6283 | |
| 多聚甲醛 | Electron Microscopy Sciences | RT15710 | |
| 信号增强剂 | Life technologies | I36933 | |
| 单克隆抗连环蛋白抗体 | Sigma-Aldrich | V9131 | |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG | Life technologies | A11001 | |
| TRITC-鬼笔环肽偶联物 | Sigma-Aldrich | P1951 | |
| 0.1 µm 荧光微球 | Life technologies | F8801 | |
| 0.25% 胰蛋白酶-EDTA | Life technologies | 25200-056 | |
| 材料 | |||
| 12 mm2 玻璃盖玻片 | Corning | 2865-12 |
参考文献
- Ingber, D. E. Can cancer be reversed by engineering the tumor microenvironment. Semin. Cancer Biol. 18, 356-364 (2008).
- Kumar, S., Weaver, V. M. Mechanics, malignancy, metastasis: the force journey of a tumor cell. Cancer Metastasis Rev. 28
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重印与许可
