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方法文章

从手术组织中分离原代人结肠肿瘤细胞并直接在软弹性基质上培养用于牵引力显微镜检测

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DOI：

10.3791/52532

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2015年6月4日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Mechanical Science and Engineering, University of Illinois at Urbana-Champaign, 2College of Medicine, University of Illinois at Urbana-Champaign, 3Provena Covenant Medical Centre, 4Micro and Nanotechnology Laboratory, University of Illinois at Urbana-Champaign

本文内容

摘要

本文描述了一种从手术切除的结肠肿瘤及正常组织中分离原代人源细胞的实验方案。分离得到的细胞随后被培养在经细胞外基质蛋白功能化处理、并嵌入荧光微球的软性弹性基质（聚丙烯酰胺凝胶）上。通过牵引力显微镜技术评估细胞的收缩应力。

摘要

癌细胞通过由黏附受体及相关的信号转导膜蛋白、细胞骨架结构和分子马达组成的协调性、层级化的力-化学系统，以复杂的方式响应基质的力学刚度1, 2不同癌细胞的机械敏感性 体外 主要使用永生化细胞系或小鼠来源的原代细胞进行研究，而非原代人类癌细胞。因此，关于原代人类结肠癌细胞的机械敏感性知之甚少 体外在此，我们开发了一种优化的实验方案，用于从健康和癌变的人体手术组织样本中分离原代人结肠细胞。分离得到的结肠细胞随后被成功培养于柔软（2 kPa 刚度）、坚硬（10 kPa 刚度）的聚丙烯酰胺水凝胶以及刚性聚苯乙烯基底（~3.6 GPa 刚度）上，这些基底均通过细胞外基质蛋白（本实验中为纤连蛋白）进行功能化修饰。在靠近细胞培养表面的柔软凝胶中嵌入荧光微球，并利用免费开源软件进行牵引力测定，以评估细胞的收缩应力。此外，在不同刚度的基底上进行免疫荧光显微镜观察，可获得关于原代细胞形态、细胞骨架组织以及含纽蛋白（vinculin）的黏着斑随基底刚度变化的有用信息。

引言

近年来，越来越多的证据表明，除了生化因素外，机械微环境在调控细胞功能方面也起着重要作用。细胞能够感知并响应其所黏附（如二维培养）或所处（如三维培养）基质的刚度3-7。通过这种方式，细胞可以调节其分化3、形态4、迁移/运动能力5、生物物理特性6、生长7以及其他过程。

癌细胞也会通过整合黏附受体及其相关的信号转导膜蛋白、细胞骨架结构和分子马达，以协调的、多层次的力学-化学机制响应二维（2D）和三维（3D）基质的刚度1, 2。例如，当在刚度约为150 Pa（类似于正常乳腺组织刚度）的基质上培养时，乳腺上皮细胞（MECs）可形成正常的腺泡实质结构；而有趣的是，当在模拟肿瘤间质刚度的较硬基质（> 5,000 Pa）上培养时，它们则表现出发育中肿瘤的结构和转录特征8。此外，另一项实验表明，乳腺肿瘤的发生伴随着胶原交联和细胞外基质（ECM）的硬化9。最近的研究显示，当人结肠癌（HCT-8）细胞在具有生理相关刚度（20–47 kPa）的二维基质上培养时，会表现出类似转移的表型（MLP），但在非常坚硬的基质（3.6 GPa）上则不会出现该表型10-12。这些细胞首先形成类似肿瘤的细胞簇，随后从边缘开始彼此解离。随着上皮样到圆形的形态转变（E到R转变）的发生，细胞开始增殖，细胞间及细胞与ECM间的黏附减弱，并获得迁移能力。而在非常坚硬的聚苯乙烯基质上培养的HCT-8细胞则不会表现出这些恶性特征。因此，人们推测HCT-8细胞之所以发生转移，是由于其暴露于适当的微环境所致。值得注意的是，这些实验使用的是永生化癌细胞系或小鼠来源的原代细胞，而非原代人癌细胞。

最近一项研究提出，增强的细胞牵引应力可能作为转移性细胞的一种潜在生物物理标志物13。该研究通过在聚丙烯酰胺凝胶上测量不同人源癌细胞系的牵引力发现，在所有情况下，转移性癌细胞施加的牵引应力均显著高于非转移性细胞13。然而，这些结果与先前关于小鼠来源乳腺癌细胞系的已发表研究结果直接相矛盾14。此外，最近另一项研究强调了永生化人细胞与原代人细胞在细胞骨架重塑相关蛋白谱型及细胞存活蛋白表达方面存在显著差异15。因此，重新审视包括牵引力在内的多种针对原代人癌细胞的生物物理检测方法显得尤为重要。这将有助于回答原代细胞是否能够重现永生化癌细胞系的牵引力趋势这一科学问题。

本文所述方案经过优化，适用于分离原代人结肠细胞（包括健康和癌变细胞），并可在软质基底（聚丙烯酰胺水凝胶）及培养皿上进行培养。该方案基于对手术组织样本进行消化，继而通过酶解法将其解离为单细胞悬液16。据我们所知，这是首次展示将分离的原代结肠肿瘤细胞和正常细胞直接培养在嵌有荧光微球的软质水凝胶基底上，用于牵引力细胞测量学研究。透明的凝胶基底还允许进行免疫荧光染色。该检测方法揭示了随着基底刚度变化，原代人结肠细胞中F-肌动蛋白的排列结构和黏着斑的差异。这一细胞培养平台为探索原代人细胞的多种生物物理特性（如细胞刚度和牵引力）作为癌症预后参数的可能性开辟了新途径。

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方案

以下所述方案遵循伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校人类研究伦理委员会的指导原则。

1. 外科组织样本的采集与消化

  1. 在结肠切除术后立即采集肿瘤组织样本（图 1A 和 1B）。同时从邻近的健康部位采集组织样本。
  2. 立即将组织转移至含有 12 ml HBSS 溶液的 15 ml 离心管中。将离心管置于装有冰块的隔热泡沫箱内保存。
  3. 在 45 分钟内将含组织的离心管运送至组织培养超净台进行后续处理。在超净台内将离心管置于冰块上。
  4. 用移液器将所提供的组织转移至含有 6–7 ml HBSS 溶液的 6 孔板中。
    注意：此冲洗步骤中每孔的组织量无需精确。
  5. 将 6 孔板置于冰块上。用 HBSS 溶液冲洗组织两次。
  6. 使用无菌剪刀将组织整齐地剪成独立片段，再用无菌手术刀片将组织切碎为不超过 1–2 mm3 大小的小块。
  7. 在转移组织前，称量一支已标记的含 0.1% 胰蛋白酶溶液（1 ml）的离心管。用移液器将约 20 mg 组织转移至每支 0.1% 胰蛋白酶管中。
  8. 尽量减少将 HBSS 转移至胰蛋白酶管中，以避免胰蛋白酶进一步稀释。
  9. 组织转移后再次称量胰蛋白酶管，记录前后重量差作为组织质量。
  10. 将约 20 mg 组织和 1 ml 胰蛋白酶溶液加入 24 孔板的每个孔中。
  11. 将 24 孔板置于冰箱中，在 4 °C 条件下置于摇床上孵育 16–20 小时。在此期间或更早时间，按照第 3 节所述方法制备聚丙烯酰胺凝胶基底，并用 ECM 蛋白对其进行功能化处理。

2. 将组织样本通过酶解法解离为单细胞悬液，并在细胞外基质功能化的弹性基底和刚性聚苯乙烯培养皿上培养分离的细胞

  1. 在4 °C摇床中胰蛋白酶孔内孵育16-20小时后，用移液器将组织从4 °C的胰蛋白酶溶液转移至含有2-3 ml完全培养基的4 °C完全生长培养基小瓶中。确保转移到生长培养基中的胰蛋白酶量最少。
    注意：完全生长培养基的配制如下：RPMI 1640基础培养基，添加马血清至终浓度10%，青霉素-链霉素至总体积的1%。
  2. 将含有组织的培养基小瓶置于37 °C温水浴中，孵育12-15分钟。
  3. 用移液器将组织转移至含有HBSS溶液的15 ml小瓶中，轻轻振荡。
  4. 重复步骤2.3。
  5. 将组织从HBSS溶液中取出，转移至含有1 ml 0.1%胶原酶溶液（溶于HBSS）的小瓶中。在湿润的细胞培养孵育箱中，于37 °C和5% CO2环境下孵育45分钟。在此期间，将15 ml小瓶中的培养基在37 °C水浴中预热。
  6. 用移液器尽可能减少胶原酶残留，将所有组织碎片吸出，并仅将组织碎片排入预热的培养基小瓶中。
  7. 将40 µm孔径的插入式滤器放入6孔板的每个孔中，用1 ml细胞培养基润湿滤器。
  8. 用10 ml玻璃移液器在培养基中反复吹打组织，直至组织完全解离。
  9. 保持移液器尖端尽可能靠近小瓶底部。
  10. 将溶液滴加到滤器上，以去除碎片和未解离的组织部分。
  11. 将滤过的细胞悬液在培养基中以150 × g离心5分钟，室温操作。
  12. 随后弃去上清液，并用2 ml新鲜培养基重悬细胞沉淀。
  13. 使用血细胞计数板计数细胞（如需要）。将分离的原代细胞以所需浓度接种于细胞外基质（ECM）功能化的凝胶或聚苯乙烯培养皿上。

3. 不同硬度聚丙烯酰胺（PA）凝胶和聚苯乙烯基底的制备与功能化

注意：有关第3节的可视化演示，请参阅近期发表在《视觉化实验杂志》（Journal of Visualized Experiments，JoVE）的一篇文章17。

  1. 采用已发表的方案18, 19，对12 mm2的玻璃盖玻片进行化学活化，以确保水凝胶能够共价结合。
    1. 首先，在室温下用3-氨基丙基三甲氧基硅烷（ATS）处理玻璃盖玻片7分钟。
    2. 用去离子水彻底冲洗去除ATS，并用0.5%戊二醛溶液（用PBS将70%戊二醛储备液稀释而成）处理盖玻片30分钟。
  2. 通过将5% w/v丙烯酰胺溶液与0.05% N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（bis）溶液混合于10 mM HEPES缓冲盐水中，制备2 kPa凝胶溶液20。对于10 kPa凝胶，使用8% w/v丙烯酰胺和0.13% N,N'-亚甲基双丙烯酰胺（bis）溶液溶于10 mM HEPES缓冲盐水中20。
    1. 在这两种情况下，分别使用1:200的过硫酸铵（10% w/v）和1:2,000的N,N,N',N'-四甲基乙二胺（TEMED）作为聚合反应的引发剂和催化剂。
    2. 此外，向2 kPa凝胶溶液中加入100 µl荧光微球作为定位标记21, 22。
  3. 在12 mm2活化的玻璃盖玻片上滴加20 μl预聚合的PA凝胶溶液。将另一片12 mm2普通玻璃盖玻片覆盖在液滴上。确保液滴因毛细作用在两片盖玻片之间充分铺展。对于2 kPa凝胶，将夹心结构倒置，以确保大部分微球靠近细胞培养表面。
  4. 在室温下使PA凝胶固化45分钟。
  5. 使用单刃剃刀剥离顶部盖玻片。
    注意：剥离过程中，分离从夹心结构的一侧边缘开始。凝胶仍牢固附着于活化的玻璃载片上。
  6. 使用前将凝胶保存在PBS溶液中。
  7. 按照已发表的方法23，用细胞外基质分子——浓度为50 µg/ml的人纤维连接蛋白（fibronectin）对PA凝胶和玻璃进行功能化处理。
    1. 简言之，将基底与2 ml纯肼水合物在4°C下孵育过夜（O/N）。
    2. 去除肼水合物，并用去离子水彻底冲洗基底。
    3. 用5%乙酸洗涤基底30分钟。
    4. 去除乙酸，并用去离子水彻底冲洗基底。
    5. 将基底浸没于去离子水中30分钟。
    6. 在50 µg/ml浓度下，用氧化的纤维连接蛋白孵育基底35分钟。
    7. 在摇床上以低转速用PBS冲洗基底10分钟。
    8. 在接种细胞前，将所有基底置于37 °C的2–3 ml培养基中孵育30分钟。
      注意：以低密度方式接种细胞（1,000–3,000个细胞/cm2）。每片覆盖凝胶的玻璃盖玻片应置于一个35 mm的培养皿中。在进行任何显微观察前，需让细胞完全贴壁（至少过夜）。

4. 牵引力显微镜与免疫荧光显微镜检测

  1. 牵引力显微镜检测
    1. 将0.25%胰蛋白酶-EDTA/10% SDS溶液置于37 °C水浴中预热10分钟，然后开始牵引实验。
    2. 每次从细胞培养孵箱中取出一块凝胶，置于倒置荧光显微镜载物台上（32倍放大）。
    3. 在视野中找到单个细胞。移去培养皿盖。
    4. 拍摄细胞的相差图像（例如, 图3).
    5. 切换至荧光成像模式并选择合适的滤光片。在此期间，切勿移动显微镜载物台或样品。
    6. 拍摄细胞牵引力位移的荧光微球图像图4C).
    7. 向培养皿中加入1 ml胰蛋白酶/SDS溶液，以使细胞从凝胶上脱离。在此期间，不要移动显微镜载物台或样品。同时，拍摄细胞的对照图像，以确认细胞已完全从凝胶上移除。
    8. 细胞移除后，采集珠子的参考（零力）图像。
    9. 对所有其他凝胶重复步骤 4.1.2–4.1.8。
    10. 使用 ImageJ 将每个样本在步骤 4.1.6 和 4.1.8 中获取的两幅图像生成图像堆栈。在 ImageJ 中打开图像后，依次执行以下命令以生成图像堆栈：图像 → 堆栈 → 图像到堆栈。
    11. 使用 ImageJ 插件，依据已发表的方法获取位移场和牵引力 21, 22通过以下链接获取这些插件的代码和详细教程： https://sites.google.com/site/qingzongtseng/imagejplugins.
      1. 使用“模板匹配”（Template Matching）插件对图像堆栈进行对齐。在 ImageJ 中打开步骤 4.1.10 生成的图像堆栈后，依次执行以下命令：插件（Plugins）→ 模板匹配（Template Matching）→ 对齐堆栈切片（Align Slices in Stack）→ 确定（OK）。随后保存该图像堆栈。后续步骤中请使用此新生成的图像堆栈。
      2. 使用PIV（粒子图像测速）插件获取位移场图 4D）。打开步骤 4.1.11.1 中保存的图像堆栈后，依次执行以下命令：Plugins → PIV → Iterative PIV (Basic) → OK → Accept this PIV and output → Ok。将 PIV 输出结果保存至与原始图像堆栈相同的目录中，并在下一步中将其用作输入。
      3. 最后使用 FTTC（傅里叶变换牵引力显微镜）插件获取牵引力图谱图 4E）。使用以下命令序列：Plugins → FTTC → Insert material properties 即，PA凝胶的杨氏模量和泊松比 → 确定 → 选择在步骤4.1.11.2中保存的PIV输出文件 → 确定。将FTTC结果保存至与图像堆栈和PIV输出相同的目录中。
  2. 免疫荧光显微镜检测
    1. 将待免疫染色的样本转移至超净工作台，并移除培养基。
    2. 用 PBS 清洗底物，并在室温下用 PBS 中的 4% 多聚甲醛固定细胞 20 分钟。
    3. 用 PBS 清洗底物 3 次（每次 5 分钟）。随后，将底物与 500 µl 信号增强剂孵育 30 分钟，并用 PBS 冲洗。
    4. 在 PBS 中以 1:250 稀释单克隆抗 vinculin 抗体，室温孵育细胞 45 分钟。用 PBS 洗涤底物 3 次，每次 5 分钟。
    5. 将样本在室温下用PBS按1:200稀释的Alexa Fluor 488标记的山羊抗小鼠IgG二抗孵育30分钟。用PBS洗涤底物3次，每次5分钟。
    6. 为了观察F-肌动蛋白结构，在室温下用浓度为50 µg/ml的TRITC鬼笔环肽缀合物孵育细胞45分钟。用PBS洗涤载片3次，每次5分钟。
    7. 使用共聚焦扫描激光显微镜对样品进行成像（图 5A-5D).

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结果

上述方案已根据机构审查委员会的指导，成功应用于四位不同患者的多个组织样本（n=12）。图1A展示了手术后具有代表性的结直肠肿瘤，从中获取用于细胞培养的组织切片。将组织转移至超净工作台进行后续处理后，在HBSS溶液中的典型组织切片如图1B所示。图2展示了将手术组织样本消化并酶解为单细胞悬液的示意图。

成功解离组织后，将分离得到的原代人源细胞接种于PA凝胶和聚苯乙烯培养皿上。相差显微图像（图3A 和 3B）展示了原代人源结肠癌细胞及正常细胞在不同基质刚度下的典型形态。可见，无论是健康还是癌变的原代结肠细胞，在聚苯乙烯培养皿上的铺展程度均高于PA凝胶（图3A 和 3B）。

在通过病理学H&E染色确认浸润性腺癌后（图4A），于包被了细胞外基质（纤连蛋白）的2 ...

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讨论

细胞牵引力最近已成为一种潜在的生物物理指标，可用于指示转移状态13。然而，迄今为止，文献中尚无关于原代肿瘤细胞的实验性牵引力数据。此外，将分离的原代结肠细胞直接培养在不同刚度的聚丙烯酰胺凝胶上也尚未见报道。因此，我们建立了优化的原代结肠细胞在凝胶和聚苯乙烯表面的培养条件（图2）。在软凝胶制备过程中，将荧光微珠包埋于细胞培养表面附近，可实现对原代人源细胞产生的位移场和牵引力的测量（图4C、4D 和 4E）。此外，免疫荧光检测可提供有关细胞骨架组织和黏着斑在基底刚度变化下的重要信息（图5A–5D）。需要注意的是，不同的癌细胞系和正常永生化细胞系也表现出随着基底刚度增加，细胞铺展增强、肌动蛋白应力纤维束形成增多以及成熟且伸长的黏着斑增多的现象4, 24–25。

该方案可轻松采用或修改，用于从不同人体器官或其他动物的手术组织中分离原代细胞。组织在...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本项目由美国国家科学基金会ECCS资助项目10-02165以及伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校跨学科创新计划资助项目12035提供资金支持。M.Y.A.在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的研究工作由美国国立卫生研究院国家癌症研究所纳米技术抗癌联盟“中西部癌症纳米技术培训中心”资助项目R25 CA154015A提供资助。免疫染色与共聚焦显微镜成像实验在伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校基因组生物学研究所（IGB）完成。M.Y.A.感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的B. J. Williams就分离实验提供的讨论与建议。M.Y.A.感谢伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校的C. Nemeh和Abdul Bhuiya在示意图绘制和材料清单准备过程中提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
HBSSLife technologies14175-095
PBSLonza17-516F
胰蛋白酶WorthingtonLS003736
胶原酶WorthingtonLS004176
3-氨基丙基三甲氧基硅烷（ATS） Sigma-Aldrich281778
戊二醛Polysciences, Inc.01201-5
丙烯酰胺Sigma-AldrichA4058
N-亚甲基双丙烯酰胺（bis）Sigma-AldrichM1533
HEPES 缓冲液Sigma-Aldrich83264
过硫酸铵Bio-Rad161-0700
人纤维连接蛋白BD biosciences354008
水合肼Sigma-Aldrich18412危险品
乙酸Sigma-AldrichA6283
多聚甲醛 Electron Microscopy SciencesRT15710
信号增强剂Life technologiesI36933
单克隆抗连环蛋白抗体 Sigma-AldrichV9131
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgGLife technologiesA11001
TRITC-鬼笔环肽偶联物 Sigma-AldrichP1951
0.1 µm 荧光微球Life technologiesF8801
0.25% 胰蛋白酶-EDTALife technologies25200-056
材料
12 mm2 玻璃盖玻片Corning2865-12

参考文献

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