通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

摘要

本文介绍了一种通过将同基因型CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠体内，以诱导小鼠结肠炎症的实验方案。该模型的临床表现和组织病理学特征与人类炎症性肠病相似，可用于研究结肠炎症的起始及疾病进展过程。

摘要

目前有多种不同的动物模型可用于研究人类炎症性肠病（IBD）的发病机制，每种模型均有其优缺点。本文描述了一种实验性结肠炎模型，该模型通过同基因型脾脏CD4⁺CD45RB^高 将T细胞转入T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠。CD4⁺CD45RB^高 主要由初始效应T细胞组成的T细胞群体能够诱导慢性肠道炎症，该炎症在很大程度上类似于人类炎症性肠病（IBD）的关键特征。该方法可用于研究疾病发生与进展的各个方面，此外还可用于研究先天性免疫细胞、适应性免疫细胞及调节性免疫细胞群体的功能，以及环境暴露的作用。 即， 肠道菌群在肠道炎症中的作用。本文详细阐述了诱导结肠炎的实验方法，并提供分步操作流程。内容包括关键实验技术的视频演示，以帮助研究人员成功建立用于科研目的的小鼠实验性结肠炎模型。

引言

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是由宿主免疫反应、遗传易感性、环境因素以及肠道腔内容物之间尚未完全明确且复杂的相互作用所导致的¹。近期的全基因组关联研究报道了免疫细胞调控基因与IBD易感性之间的关联^2,3。这些研究中均涉及先天性和适应性免疫细胞的内在基因，表明这些细胞群体在IBD发病机制中具有核心作用。

目前已有超过50种人类炎症性肠病（IBD）的动物模型。尽管尚无一种模型能够完全模拟人类IBD的表型，但许多模型在研究人类疾病的不同方面（包括疾病起始与进展以及伤口愈合反应）具有重要价值。本文所述方法通过将同基因型脾脏CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠，从而诱导肠道炎症⁴。CD4⁺CD45RB^high T细胞群体主要包含处于初始状态、易于活化的T细胞，这些细胞能够诱导慢性小肠和结肠炎症。该方法允许研究人员调控多个关键实验变量，包括先天性和适应性免疫细胞群体，以回答与疾病发病机制相关的生物学问题。此外，该方法可精确控制疾病起始时间，并具有明确的实验时间进程，从而便于对小鼠疾病进展过程中的临床特征进行动力学研究。该方法诱导的肠道炎症在多个方面与人类IBD相似，包括慢性的大肠和小肠透壁性炎症、由TNF和IL-12等细胞因子驱动的发病机制，以及恶病质等全身性症状⁵

方案

注意：确保所有动物实验方案均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定 实验动物护理和使用的指南供体小鼠可为雄性或雌性，但受体小鼠应为雄性。若使用雌性受体小鼠，则供体小鼠必须为雌性⁵使用常规非无菌垫料和非酸化水维持品系，因为这些因素可能影响小鼠肠道微生物群，从而影响结肠炎表型^5,6.

1. 实验准备

1. 使用预冷的培养基和缓冲液。整个实验过程中将细胞置于冰上。
2. 在无菌生物安全柜中采用无菌技术进行实验。

2. 脾脏T细胞的分离

1. 将供体小鼠置于 CO₂ 安乐死舱内实施安乐死，随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇喷洒腹部。
2. 在腹部做一横向切口，剥离皮肤以暴露腹膜。用镊子将腹膜与内脏分离，切开左侧腹膜，暴露并切除脾脏。
3. 将脾脏放入含 10 ml 完全培养基的培养皿中。去除并弃去脾脏上的多余组织。
4. 使用两片灭菌玻璃载玻片将脾脏碾碎并分散成单细胞悬液。将细胞悬液通过 70 μm 细胞筛滤入 50 ml 锥形管中，并用 5 ml 完全培养基冲洗细胞筛。每只 50 ml 锥形管中最多可放入 5 只脾脏。
5. 以....

结果

从10只成年C57BL/6供体小鼠的脾脏中可稳定分离出约10 × 10⁶个CD4⁺CD45RB^high T细胞。该数量会因供体小鼠的年龄、品系以及研究人员的操作熟练程度而有所差异。当将4 × 10⁵个C57BL/6来源的CD4⁺CD45RB^high T细胞转移至C57BL/6 Rag1^-/-受体小鼠后，受体小鼠通常在移植后第5周左右出现疾病临床症状，若小鼠在遗传上更易发展为严重疾病，则症状出现时间可能更早（图2、图3）^11,12。在Rag1^-/-受体小鼠的结肠中，最早可在移植后3周观察到CD3⁺ T细胞的聚集（图3A）¹²。

讨论

本文介绍了一种通过将CD4⁺CD45RB⁺ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠来诱导小鼠结肠炎症的逐步实验方案。我们使用了C57BL/6品系供体的脾脏以及同源的Rag1^-/-受体小鼠，尽管其他品系（例如，BALB/c、129S6/SvEv、非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠）以及其他的免疫缺陷遗传模型（例如，SCID、Rag2^-/-）也可应用^4,14-16。已有充分证据表明，背景品系会影响小鼠实验性结肠炎的严重程度¹。此外，即使在同一机构内的不同实验设施之间，小鼠群体中的肠道微生物群也存在显著差异^6,17。尽管图2和图3未展示Rag1^-/-小鼠在细胞转移后4周时结肠炎的发展情况，但根据我们及其他研究者的经验，Rag1^-/-受体小鼠在接受CD4⁺CD45RB

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备名称	公司	目录编号	备注/描述
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm 圆底管	Falcon	352052
15 ml 锥形离心管	Corning	430790
26 G x 3/8 针头	BD Biosciences	305110
50 ml 锥形离心管	Corning	430828
70 μm 细胞筛	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-巯基乙醇	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
完全培养基			RPMI-1640，1% 青霉素-链霉素，10% 胎牛血清，0.0004% β-ME
FACS 管 + 筛网	BD Falcon	352235
玻璃显微镜载玻片	Fisherbrand	12550A3
热灭活胎牛血清	Gemini	100-106
标记缓冲液			1x PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA
裂解缓冲液			0.08% NH4Cl，0.1% KHCO3，1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
小鼠 CD4 T 淋巴细胞富集试剂盒 - DM	BD Biosciences	558131
小鼠 IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
小鼠 IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
巴斯德吸管	Fisherbrand	13-678-20D
青霉素-链霉素溶液，100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
培养皿	Fisherbrand	875713
纯乙醇，200 证明	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
注射器	BD Biosciences	309597
台盼蓝	Corning Cellgro	25-900-CI
洗涤培养基			RPMI-1640，1% 青霉素-链霉素，0.0004% β-ME