通过将效应性CD4+CD45RBhigh T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠诱导小鼠肠道炎症

摘要

本文介绍了一种通过将同基因型CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠体内，以诱导小鼠结肠炎症的实验方案。该模型的临床表现和组织病理学特征与人类炎症性肠病相似，可用于研究结肠炎症的起始及疾病进展过程。

摘要

目前有多种不同的动物模型可用于研究人类炎症性肠病（IBD）的发病机制，每种模型均有其优缺点。本文描述了一种实验性结肠炎模型，该模型通过同基因型脾脏CD4⁺CD45RB^高 将T细胞转入T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠。CD4⁺CD45RB^高 主要由初始效应T细胞组成的T细胞群体能够诱导慢性肠道炎症，该炎症在很大程度上类似于人类炎症性肠病（IBD）的关键特征。该方法可用于研究疾病发生与进展的各个方面，此外还可用于研究先天性免疫细胞、适应性免疫细胞及调节性免疫细胞群体的功能，以及环境暴露的作用。 即， 肠道菌群在肠道炎症中的作用。本文详细阐述了诱导结肠炎的实验方法，并提供分步操作流程。内容包括关键实验技术的视频演示，以帮助研究人员成功建立用于科研目的的小鼠实验性结肠炎模型。

引言

炎症性肠病（IBD），包括克罗恩病和溃疡性结肠炎，是由宿主免疫反应、遗传易感性、环境因素以及肠道腔内容物之间尚未完全明确且复杂的相互作用所导致的¹。近期的全基因组关联研究报道了免疫细胞调控基因与IBD易感性之间的关联^2,3。这些研究中均涉及先天性和适应性免疫细胞的内在基因，表明这些细胞群体在IBD发病机制中具有核心作用。

目前已有超过50种人类炎症性肠病（IBD）的动物模型。尽管尚无一种模型能够完全模拟人类IBD的表型，但许多模型在研究人类疾病的不同方面（包括疾病起始与进展以及伤口愈合反应）具有重要价值。本文所述方法通过将同基因型脾脏CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至T细胞和B细胞缺陷型受体小鼠，从而诱导肠道炎症⁴。CD4⁺CD45RB^high T细胞群体主要包含处于初始状态、易于活化的T细胞，这些细胞能够诱导慢性小肠和结肠炎症。该方法允许研究人员调控多个关键实验变量，包括先天性和适应性免疫细胞群体，以回答与疾病发病机制相关的生物学问题。此外，该方法可精确控制疾病起始时间，并具有明确的实验时间进程，从而便于对小鼠疾病进展过程中的临床特征进行动力学研究。该方法诱导的肠道炎症在多个方面与人类IBD相似，包括慢性的大肠和小肠透壁性炎症、由TNF和IL-12等细胞因子驱动的发病机制，以及恶病质等全身性症状⁵。因此，该模型是研究人类IBD发病机制的理想体系。

本文详细描述了通过将CD4⁺CD45RB^high T细胞过继转移至Rag1^-/-小鼠以诱导实验性结肠炎的方法。我们讨论了该技术的关键操作步骤、预期结果、优化策略以及常见问题的解决方案，并阐述了为研究目的成功建立这种小鼠肠道炎症模型所需的各项要素。

方案

注意：确保所有动物实验方案均已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准，并符合美国国家研究委员会（National Research Council）的相关规定。 实验动物护理和使用的指南供体小鼠可为雄性或雌性，但受体小鼠应为雄性。若使用雌性受体小鼠，则供体小鼠必须为雌性⁵使用常规非无菌垫料和非酸化水维持品系，因为这些因素可能影响小鼠肠道微生物群，从而影响结肠炎表型^5,6.

1. 实验准备

1. 使用预冷的培养基和缓冲液。整个实验过程中将细胞置于冰上。
2. 在无菌生物安全柜中采用无菌技术进行实验。

2. 脾脏T细胞的分离

1. 将供体小鼠置于 CO₂ 室内实施安乐死，随后进行颈椎脱位。用 70% 乙醇喷洒腹部。
2. 在腹部做一横向切口，剥离皮肤以暴露腹膜。用镊子将腹膜与内脏分离，切开左侧腹膜，暴露并切除脾脏。
3. 将脾脏放入含 10 ml 完全培养基的培养皿中。去除并弃去脾脏上的多余组织。
4. 使用两片灭菌玻璃片将脾脏碾碎并分散成单细胞悬液。将细胞悬液通过 70 μm 细胞筛滤入 50 ml 锥形管中，并用 5 ml 完全培养基冲洗细胞筛。每只 50 ml 锥形管中最多可放入 5 只脾脏。
5. 以 450 × g 离心 7 分钟。倾去上清液或通过真空抽吸将上清液转移至废液容器中。
6. 每只脾脏加入 5 ml 裂解缓冲液，轻柔重悬细胞，在室温下裂解红细胞 10 分钟。向管中加入等体积的完全培养基（每只脾脏 5 ml）。
7. 以 450 × g 离心 7 分钟。倾去上清液或通过真空抽吸将上清液转移至废液容器中。
8. 用 10 ml 标记缓冲液轻柔重悬细胞。
9. 通过台盼蓝排斥法计数细胞。
   1. 取 20 μl 细胞悬液加入含 180 μl 台盼蓝的微量离心管中，充分混匀。5 分钟后，取 10 μl 染色细胞加入血细胞计数板，在显微镜下计数未染成蓝色的细胞，确定活细胞总数。弃去细胞与台盼蓝混合液。
10. 将细胞在 10 ml 标记缓冲液中以 450 × g 离心 7 分钟。倾去上清液或通过真空抽吸将上清液转移至废液容器中。

3. CD4⁺ T 细胞的富集

注意：本节所用特定产品的操作请遵循制造商的说明。

1. 用预冷的标记缓冲液将细胞轻柔重悬，调整细胞浓度至 20 × 10⁶ 个细胞/ml，形成单细胞悬液。
2. 每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 μl 生物素标记的 CD4 T 细胞富集抗体。将细胞置于冰上孵育 15 分钟。
3. 加入 10 倍体积的标记缓冲液。以 450 × g 离心 7 分钟。使用真空抽吸装置小心吸除所有上清液，并转移至废液容器中。
4. 充分涡旋振荡链霉亲和素偶联的磁性颗粒。每 1 × 10⁶ 个细胞加入 5 μl 磁性颗粒。
5. 轻轻但充分混匀。将混合物置于 6–12 °C 条件下孵育 30 分钟。
6. 用标记缓冲液调整细胞浓度至 20–80 × 10⁶ 个细胞/ml。每根 12 × 75 mm 圆底试管（称为“阳性组分管”）最多加入 1.0 ml 标记后的细胞悬液。
7. 将每根阳性组分管置于磁铁上 6–8 分钟。
8. 保持阳性组分管仍在磁铁上，用玻璃巴斯德吸管小心将上清液从阳性组分管转移至新的无菌 50 ml 锥形管中（称为“富集组分”）。该富集组分含有 CD4⁺ T 细胞。操作时注意不要扰动被磁力吸附在管壁上的标记细胞。
9. 用与步骤 3.6 相同体积的标记缓冲液，通过反复吹打将阳性组分管中残留的细胞充分重悬。将阳性组分管再次放回磁铁上，静置 6–8 分钟。
10. 保持阳性组分管仍在磁铁上，用玻璃巴斯德吸管小心将上清液（富集组分，CD4⁺）从阳性组分管转移至步骤 3.8 中使用的无菌 50 ml 锥形管中，注意不要扰动吸附在磁铁上的细胞。
11. 重复步骤 3.9–3.10 以提高所获得的 CD4⁺ T 细胞得率。后续实验步骤使用富集组分（CD4⁺ 细胞）进行。

4. 细胞标记与分选⁷

1. 在450 × g下离心富集的细胞7分钟。通过倾倒或真空抽吸将上清液弃入废液容器。
2. 用1 ml标记缓冲液重悬细胞。取部分细胞用于计数，并通过台盼蓝排斥法检测细胞活力，步骤同2.9。
3. 加入适量标记缓冲液至 10 x 10⁶ 细胞/毫升；如果细胞已经 <10 x 10⁶，450 × g 离心 7 分钟，倾去上清液或用真空抽吸至废液容器中，加入标记缓冲液至 10 × 10⁶ 细胞/毫升
   1. 准备若干独立等份，每份约 5-10 × 10⁵ 每个微离心管中分别加入未染色、同型染色和单染对照细胞。
4. 加入5 μg/ml CD4-FITC和1 μg/ml CD45RB-PE至细胞中。将同型对照染料和单染染料以相同浓度分别加入微量离心管中的相应分装样品。充分但轻柔混匀，置于冰上避光孵育30分钟。
5. 向细胞及对照组中加入10倍体积的标记缓冲液。以450 × g离心7分钟。通过真空抽吸将上清液弃入废液容器中。
6. 用步骤4.5中的体积的标记缓冲液重悬。以450 × g离心7分钟。通过真空抽滤将上清液弃入废液容器中。
7. 用标记缓冲液重悬至 10 x 10⁶ 细胞/ml。将细胞通过70 μm滤网过滤至FACS管中。置于冰上避光保存，直至进行FACS分析。
8. 使用未染色细胞和单染对照在细胞分选仪上设置并确定适当的补偿。
9. 通过前向散射和侧向散射门控排除非活细胞图1A设置CD4的门控⁺ 和 CD45RB⁺ 细胞与同型染色对照。在CD4上设门进行细胞分析⁺ 群体
10. 分选CD4⁺ 将细胞分选为CD45RB^高 和 CD45RB^低 使用完全培养基2 ml将PE染色的细胞分装至各管中，通过简单的直方图分析细胞群。CD45RB^高 群体代表 CD4 表达水平最高的前 40%⁺CD45RB⁺ 细胞（CD45RB^高），以及 CD45RB^低 群体为 CD4 水平最低的 20%⁺CD45RB⁺ 细胞（CD45RB^低; 图1B).

图 1：FACS 分析过程中 CD4⁺CD45RB T 细胞群体的代表性流式细胞术图谱。（A-C）来自供体 C57BL/6 小鼠的经 FITC 标记 CD4 和 PE 标记 CD45RB 染色的脾细胞，通过 FACS 分选为 CD4⁺CD45RB^high 和 CD4⁺CD45RB^low T 细胞群体。（A）在前向散射图中排除双联体事件。（B）在前向散射与侧向散射图中圈定淋巴细胞门。（C）圈定 CD4⁺ T 细胞，（D）CD4⁺CD45RB⁺ T 细胞在 PE 信号对事件数的直方图中显示。CD4⁺CD45RB^low 细胞定义为 CD45RB⁺ 细胞中表达水平最低的 20%；CD4⁺CD45RB^high 细胞定义为 CD45RB⁺ 细胞中表达水平最高的 40%。

11. 使用流式细胞仪检测每种细胞群体的等分试样，以评估细胞群体的纯度。
12. 将分选后的细胞在450 × g离心7分钟，用1 ml PBS重悬。取部分细胞用于计数，并通过台盼蓝排斥法检测细胞活力，步骤同2.9。

5. 将细胞注射至受体

1. 用 PBS 将分选后的细胞重悬至 4 × 10⁶ 个细胞/ml（CD45RB^high）或 2 × 10⁶ 个细胞/ml（CD45RB^low）。
2. 将每只受体所需的 100 μl CD45RB^high 细胞转移至新的无菌离心管中。向该管中加入每只受体 100 μl 的 PBS。因此，每只动物的总注射体积为 200 μl，每只受体接受的细胞总量为 4 × 10⁵ 个 CD4⁺CD45RB^high 初始 T 细胞。
3. 如需设置接受调节性 T 细胞的实验组，则将每只受体所需的 100 μl CD45RB^high 细胞转移至新的无菌离心管中，并向同一管中加入每只受体 100 μl 的 CD45RB^low 细胞。每只动物的总注射体积为 200 μl；CD45RB^high 与 CD45RB^low 细胞的比例为 2:1。
4. 将 100 μl CD45RB^high 或 CD45RB^high/CD45RB^low CD4⁺ 细胞分别注射至每只受体腹部右侧和左侧腹腔内（总量为 200 μl）。

6. 受体动物疾病进展的监测

1. 为评估受体动物的临床状态，在注射当天、此后每周以及处死时，对以下参数进行综合临床评分⁸：
   1. 通过测量体重减轻来判断消耗情况：0 – 无体重减轻；1 – 初始体重减轻0.1-10%；2 – 初始体重减轻超过10%（图2A）。

图 2：将野生型 CD4⁺CD45RB^high T 细胞转移至 Rag1^-/- 和 NRDKO 受体小鼠后，出现炎症的临床表现及大体病理学征象¹¹。 （A）NRDKO 受体小鼠在细胞转移后 5 周平均体重下降了 10%，而 Rag1^-/- 受体小鼠在此时未表现出疾病的临床症状。每个数据点代表该组小鼠相对于初始体重的平均百分比 ± 标准误（SEM）。**，p <0.005。（B）部分小鼠出现严重肠道炎症，表现为直肠脱垂。此图为 NRDKO 受体小鼠直肠脱垂的代表性图像。（C）大体观察显示，与未经 T 细胞过继转移的 Rag1^-/- 和 NRDKO 小鼠相比，接受转移的 Rag1^-/- 和 NRDKO 受体小鼠结肠均增厚且缩短。NRDKO 受体小鼠的结肠表现出严重炎症，并且结肠重量增加（数据未显示）。请点击此处查看该图的放大版本。

1. 2. 通过将动物置于洁净容器中直至其排便，评估粪便质量：0 – 无粪便；1 – 软便；2 – 水样便和/或血便。
   3. 通过观察动物是否出现以下疾病体征评估其总体健康状况：0 – 无弓背姿势、毛发竖立或皮肤病变；1 – 出现弓背姿势、毛发竖立或皮肤病变中的任意一项。
   4. 评估直肠脱垂情况：0 – 无；1 – 有（图 2B）。
2. 当动物体重减轻达到初始体重的 20%，或到达预定时间点（以先到者为准），采用 CO₂ 吸入法处死动物，随后进行颈椎脱位。
3. 按照先前所述方法^5,7评估疾病严重程度。
   1. 按步骤 6.1⁸进行临床评分。
   2. 测量结肠长度和重量（图 2C）。
   3. 进行组织学炎症分析⁵。
   4. 检测肠道组织外植体培养物⁹、肠系膜淋巴结¹⁰和/或血清¹¹中细胞因子的自发表达。
      1. 简而言之，对于外植体培养⁹，动物处死后立即取出结肠，纵向剖开，并用 PBS 清洗。将结肠置于完全培养基中，在室温下以 250 rpm 的转速在摇床上孵育 30 分钟。
      2. 将组织剪切成小块，于 37 °C 在完全培养基中孵育 24 小时。收集上清液，用于通过 ELISA 检测每 100 mg 组织中细胞因子的含量。
   5. 进行 T 细胞表型和/或功能的离体（ex vivo）表征¹⁰。

结果

从10只成年C57BL/6供体小鼠的脾脏中可稳定分离出约10 × 10⁶个CD4⁺CD45RB^high T细胞。该数量会因供体小鼠的年龄、品系以及研究人员的操作熟练程度而有所差异。当将4 × 10⁵个C57BL/6来源的CD4⁺CD45RB^high T细胞转移至C57BL/6 Rag1^-/-受体小鼠后，受体小鼠通常在移植后第5周左右出现疾病临床症状，若小鼠在遗传上更易发展为严重疾病，则症状出现可能更早（图2、图3）^11,12。在Rag1^-/-受体小鼠的结肠中，最早可在移植后3周观察到CD3⁺ T细胞的聚集（图3A）¹²。

讨论

本文介绍了一种通过将CD4⁺CD45RB⁺ T细胞过继转移至免疫缺陷小鼠来诱导小鼠结肠炎症的逐步实验方案。我们使用了C57BL/6品系供体的脾脏以及同源的Rag1^-/-受体小鼠，尽管其他品系（例如，BALB/c、129S6/SvEv、非肥胖型糖尿病（NOD）小鼠）以及其他的免疫缺陷遗传模型（例如，SCID、Rag2^-/-）也可应用^4,14-16。已有充分证据表明，背景品系会影响小鼠实验性结肠炎的严重程度¹。此外，即使在同一机构内的不同实验设施之间，小鼠群体中的肠道微生物群也存在显著差异^6,17。尽管图2和图3未展示Rag1^-/-小鼠在细胞转移后4周时结肠炎的发展情况，但根据我们及其他研究者的经验，Rag1^-/-受体小鼠在接受CD4⁺CD45RB

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂/设备名称	公司	目录编号	备注/描述
10x PBS	Gibco	14200075
12 mm x 75 mm 圆底管	Falcon	352052
15 ml 锥形离心管	Corning	430790
26 G x 3/8 针头	BD Biosciences	305110
50 ml 锥形离心管	Corning	430828
70 μm 细胞筛	Fisherbrand	22363548
BD IMagnet	BD Biosciences	552311
β-巯基乙醇	Thermo Scientific	35602
CD4-FITC IgG2b	eBioscience	11-0041
CD45RB-PE IgG2a	BD Pharminogen	553101
完全培养基			RPMI-1640，1% 青霉素-链霉素，10% 胎牛血清，0.0004% β-ME
FACS 管 + 筛网	BD Falcon	352235
玻璃显微镜载玻片	Fisherbrand	12550A3
热灭活胎牛血清	Gemini	100-106
标记缓冲液			1x PBS，0.5% BSA，2 mM EDTA
裂解缓冲液			0.08% NH4Cl，0.1% KHCO3，1 mM EDTA
MoFlo XDP	Beckman Coulter
小鼠 CD4 T 淋巴细胞富集试剂盒 - DM	BD Biosciences	558131
小鼠 IgG2a-PE	BD Pharminogen	553457
小鼠 IgG2b-FITC	eBioscience	11-4732
巴斯德吸管	Fisherbrand	13-678-20D
青霉素-链霉素溶液，100X	Corning Cellgro	30-002-CI
[header]
培养皿	Fisherbrand	875713
纯乙醇，200 证明	Decon Labs	2705-HC
RPMI-1640	Gibco	11-875-093
注射器	BD Biosciences	309597
台盼蓝	Corning Cellgro	25-900-CI
洗涤培养基			RPMI-1640，1% 青霉素-链霉素，0.0004% β-ME