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方法文章

免疫缺陷小鼠口咽念珠菌病的Th17炎症模型

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DOI：

10.3791/52538

⸱

2015年2月18日

 ,  , 
1Department of Biological Sciences, School of Dental Medicine, Case Western Reserve University

本文内容

摘要

尽管已有用于研究宿主免疫抗性的 Candida 感染模型，但目前尚缺乏用于研究在 Candida 感染背景下T细胞介导的免疫病理学的模型。本文中，我们描述了一种在免疫缺陷小鼠中建立与口腔念珠菌感染相关的Th17免疫病理学的方法。

摘要

口咽部念珠菌病（OPC）的发病不仅与宿主免疫防御功能缺失有关，也与感染诱导的免疫病理反应缺乏适当调控密切相关。尽管Th17细胞被认为参与抗真菌免疫防御，但其在免疫病理过程中的作用尚不明确。本研究介绍了一种在免疫缺陷小鼠中建立与口腔念珠菌感染相关的口腔Th17免疫病理的方法。该方法基于将淋巴细胞减少的小鼠重建为 体外 培养的 Th17 细胞，随后进行口服感染 白色念珠菌 (C. albicans). 结果表明，不受控制的 Th17 细胞会导致炎症和病理变化，并与多种可测量的指标相关，包括体重减轻、促炎细胞因子产生、舌组织病理学改变和死亡率，说明该模型在研究口腔念珠菌病免疫病理学方面可能具有重要价值。调节性细胞（T调节性T细胞）对照并减轻炎症反应，表明该模型可用于测试抑制口腔炎症的新策略。该模型还可用于研究其他口腔疾病背景下的口腔Th17免疫病理学。

引言

口腔感染和炎症与癌症及心血管疾病相关，对人类整体健康具有显著影响2,3。由C. albicans引起的条件性感染和炎症与原发性免疫缺陷病（PID）4,5、牙周炎等炎症性疾病6,7、干燥综合征以及唾液腺疾病8,9，以及口腔鳞状细胞癌10-12有关。C. albicans是一种双相性共生真菌，可无症状定植于60%健康人群的口腔中，但当宿主防御功能减弱时，它是最常见的致病性真菌13-15。在艾滋病和原发性免疫缺陷病患者以及其他免疫功能低下个体中，该真菌可引起反复性和慢性感染与炎症。作为共生菌，其定植负荷与整体口腔微生物组多样性的变化相关16。作为病原体，它可导致多种类型的口咽念珠菌病，包括急性假膜型、急性萎缩型、慢性萎缩型、慢性肥厚型/增生型以及口角炎。

对 C. albicans 的防护不仅取决于宿主的免疫抵抗力，还取决于适当控制 Candida 诱导的免疫病理损伤的能力。尽管像 C. albicans 这样的共生菌可参与调节并加重其他口腔炎症性疾病，但在机会性感染期间菌群失调的发生机制仍不明确。除了已知的适应性 Th17 细胞在针对 C. albicans17 的记忆免疫应答中的作用外，其在慢性感染过程中炎症病理的启动和持续中的作用仍不清楚。此外，诸如干燥综合征和牙周炎等口腔炎症性疾病均与 Th17 介导的病理过程相关。有趣的是，这些疾病也与频繁发生的口腔假丝酵母菌病（OPC）密切相关。然而，Th17 细胞、OPC 的口腔免疫病理以及其他口腔炎症性疾病之间的相互作用尚未被研究。

尽管已有可用于研究口腔念珠菌病原发性和继发性感染的小鼠模型，但目前尚无用于研究与念珠菌感染相关的 Th17 炎症（尤其是在免疫缺陷背景下）的小鼠模型。本研究提出了一种在小鼠中建立与口腔 Candida 感染相关的口腔 Th17 炎症的方法。Candida 感染的小鼠表现为真菌病灶、舌部炎症、摄食减少、体重下降，并最终进入濒死状态。其口腔病理表现类似于慢性念珠菌感染病灶，以及小鼠口腔癌模型中的上皮异型增生12,18。

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方案

注意：使用小鼠的实验均按照机构动物福利委员会（IACUC）指南进行。

1. 重建 Rag-1-/- 患有 I 的小鼠体外 培养的 Th17 细胞（感染前 3 天）

  1. 为建立 Th17 细胞，培养 CD4+ CD44low CD62Lhigh CD25- 初始T细胞（3 x 104）接种于U型底96孔板中单独培养，或与3 x 104共同共培养 CD4+CD25+Foxp3+ Treg细胞 在Th17诱导条件下（使用IL-6（25 ng/ml）、TGF-β（2 ng/ml）、α-IFN-γ（2 µg/ml）和α-IL-4（2 µg/ml）进行极化），于可溶性α-CD3（1 µg/ml）、α-CD28（2 µg/ml）抗体及抗原呈递细胞存在的情况下培养三至四天。 
    注意：初始细胞和T调节性T细胞 采用荧光激活细胞分选（FACS）和磁性细胞分离方法进行分选，并按先前所述方法进行培养19-22.
  2. 第4天，用移液器重悬Th17细胞后，从培养物中收集细胞，并在无菌条件下离心。
    1. 取少量上述细胞用于检测活力和表型分析。将细胞重悬于500 µl RPMI培养基中，加入碘化丙啶（200 ng/ml），立即通过流式细胞术检测细胞活力。通过流式细胞术检测再刺激后IL-17A的产生，以进行表型分析（参见第6.3节）。
  3. 在所有步骤中，除非另有说明，均以480 × g在4°C下离心无菌PBS中的细胞沉淀6分钟，并进行洗涤。
  4. 将这些细胞用于过继性转移至6-8周龄CD45.2 Rag1-/-免疫缺陷小鼠。
    1. 将细胞重悬至 1 x 107 细胞/ml 细胞密度，使用冷的无菌 PBS。
    2. 使用1 ml结核菌素注射器和25 G针头，通过腹腔注射方式注入100 μl细胞悬液，每只小鼠注射量为1 × 106 细胞。部分小鼠仅接受PBS或Th17细胞，另一些小鼠则接受与Treg细胞共培养后的Th17细胞。
      注意：所有步骤均需无菌操作。

2. 培养用于感染的C. albicans（感染前一天）

  1. 接种前，将CAF2-1 C. albicans 实验室菌株的五个菌落分散于100 µl无菌PBS悬浮液中，并将该悬浮液加入无菌培养基中。
  2. 将C. albicans的五个菌落接种至50 ml酵母氮源基础（YNB不含氨基酸）/蛋白胨/葡萄糖液体培养基中，在30 °C、130 rpm条件下于摇床培养箱中培养15–18小时。
  3. 观察培养基是否变浑浊，浑浊是真菌生长的指示现象。

3. Candida 收集与计数步骤（感染当天）

  1. 在15 ml离心管中收集10 ml Candida 培养液。若需处理更大体积，可使用50 ml离心管收集Candida。
  2. 除另有说明外，所有步骤均在室温下以1900 × g离心5分钟，使芽生孢子沉淀，随后弃去上清液。 
  3. 若使用多个离心管，将来自多个管的Candida芽生孢子合并，向沉淀中加入无菌PBS，并重悬于10 ml PBS中用于计数。
  4. 取20 μl芽生孢子悬液加入1.5 ml微量离心管中，加入20 μl 2倍浓度的多聚甲醛，室温孵育15–20分钟。 在显微镜下使用血细胞计数板对固定后的芽生孢子进行计数。
    注意：多聚甲醛具有致癌性，未稀释溶液仅可在通风橱中开启。
  5. 同时，用PBS对芽生孢子至少洗涤两次，每次均通过离心使芽生孢子沉淀。将沉淀保存在15 ml离心管中，置于ABSL1级生物安全柜内的室温环境中，以备感染使用。
  6. 留取部分无菌PBS置于室温，用于感染前重悬芽生孢子。
  7. 计数后，向芽生孢子沉淀中加入无菌PBS，调节酵母细胞浓度至2 × 108 个细胞/ml。此即用于小鼠感染的芽生孢子悬液。
    注意：所有操作均需无菌进行。

4. 小鼠感染（细胞转移后3-5天）

注意：基本感染步骤按先前所述方法进行19,23-25。

  1. 称量三天前接受PBS或细胞的Rag-1-/-小鼠。
  2. 根据小鼠体重计算麻醉剂剂量。使用1 ml结核菌素注射器和25 G针头，通过腹腔注射给予氯胺酮/赛拉嗪混合物（16.1 mg/ml 和 1.6 mg/ml）以麻醉小鼠。
    1. 按每10克体重给予50 µl。即， 每10克体重注射0.8毫克氯胺酮和0.08毫克赛拉嗪，或每千克体重注射80毫克氯胺酮和8毫克赛拉嗪。麻醉后每15分钟观察一次脚趾夹捏反应。
      注意：此剂量可诱导60–90分钟的麻醉，足以完成感染操作。
    2. 在小鼠眼部涂抹眼用润滑软膏，以防止角膜干燥。由于眼用润滑剂可能变干，每45分钟重复涂抹一次眼用润滑剂。
  3. 在麻醉期间，于小鼠前肢背部附近皮下注射1 ml生理盐水（0.9% NaCl），以帮助小鼠补充水分。
  4. 获取一个全新的洁净笼子。每次对一只小鼠进行感染操作，将感染后的小鼠立即放入新笼中。先进行PBS/假感染操作，然后继续进行后续步骤 假丝酵母 感染组
  5. 拿起麻醉好的小鼠，张大其口腔以暴露舌根部。
    1. 将直径为3 mm、浸有50 µl PBS或分生孢子悬液的棉球置于小鼠口腔舌下，保留90分钟。每15分钟将小鼠前后翻转一次，以防止肺部充血，并确保棉球位置固定不动。
  6. 为每只小鼠设置计时器，以确保假手术组或 假丝酵母 口腔接种。
  7. 将小鼠置于热灯（距离4英尺）下的笼子中，并在每只小鼠下方放置加热凝胶垫。
  8. 确保舌头回缩至牙齿内侧并远离牙齿，以避免牙齿割伤舌头。
  9. 90 分钟结束时，移除小鼠口腔处的棉球。观察是否有小鼠在 75 分钟前恢复麻醉状态；若出现此情况，仅使用氯胺酮（40 mg/kg）再次麻醉。

5. 术后监测（麻醉期间的90分钟）

  1. 在90分钟麻醉期间使用加热凝胶垫。
    1. 为维持体温并防止窒息，不允许小鼠在常规的玉米芯小鼠垫料上恢复。
  2. 麻醉恢复后，在背部两个位置皮下注射额外的1 ml无菌0.9% NaCl溶液。
  3. 每笼饲养最多五只PBS（假处理）接种小鼠。每笼仅饲养1-2只感染小鼠。
  4. 每天操作后在操作卡上签名，记录体重、理毛习惯及整体健康状况的变化。

6. 评估炎症反应

6.1）体重减轻

  1. 从感染前一天开始，在感染期间每天称量小鼠体重。
    注意：通常情况下，注射了Th17细胞但无Tregs的免疫缺陷小鼠会因真菌负荷增加19和炎症加重而出现20-30%的体重下降并最终死亡。

6.2）舌组织学评分

  1. 采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
  2. 打开小鼠下颌，使用剪刀和镊子解剖取出舌组织。用钝头镊夹住舌头，用剪刀伸入口腔后部，切断舌根部位。
  3. 如需对舌组织进行免疫细胞化学苏木精和伊红（H&E）染色，先用预冷的 PBS 冲洗舌组织。在 15 ml 离心管中加入 5 ml 10% 福尔马林固定液，固定 2–3 个舌组织，4°C 过夜固定。
    1. 次日，移除福尔马林固定液，将组织浸入 5 ml 70% 乙醇中，以防止过度固定。随后送至商业服务机构，进行石蜡包埋、切片及石蜡切片染色。
      注意：上述步骤由商业组织学服务机构完成。
  4. 待载玻片从商业组织学服务机构返回后，在光学显微镜下观察组织切片，对炎症程度进行分级。
    1. 评分标准为 0 至 5 分，0 分表示无炎症，5 分表示炎症最严重。参照表 1 对炎症程度进行评分。

6.3）Th17 细胞的细胞因子产生

注意：TNF-α 的过度产生是免疫病理过度反应的指标之一。当仅将 Th17 细胞过继转移至小鼠体内时，会导致免疫病理反应，该反应与 Th17 细胞中 TNF-α 的过度产生相关。

  1. 使用先前所述方法19,26，从脾脏、颈部淋巴结、腋下淋巴结和舌组织中获取单细胞悬液。
  2. 用佛波酯肉豆蔻酸酯乙酸盐（PMA）（50 ng/ml）和离子霉素（Ionomycin）（500 ng/ml）重新刺激细胞4小时，并在最后2小时加入布雷菲德菌素A（Brefeldin A）（10 µg/ml）。用PBS洗涤细胞，并根据制造商说明书使用商用固定/透膜试剂盒对细胞进行固定。
  3. 按照先前描述的方法19，使用荧光染料标记的抗-TNF-α、抗-IL-17A和ROR-γt抗体进行细胞内细胞因子染色。
  4. 简言之，将细胞重悬于1×透化缓冲液中，加入抗-TNF-α、抗-IL-17A和ROR-γt抗体混合物，每种抗体终浓度为2–3 µg/ml。
  5. 在室温下孵育细胞1小时。
  6. 孵育后，用1×透化缓冲液洗涤细胞。
  7. 将细胞沉淀重悬于含0.5%牛血清白蛋白的500 µl PBS中，用于流式细胞术分析。

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结果

在此模型中，两者均 假丝酵母感染小鼠与Rag-1缺陷型未感染小鼠-/- 免疫缺陷背景的小鼠在感染前3-5天过继转移了Th17细胞。实验共使用10-12只小鼠，每组假感染（Sham infected）组包含2只小鼠，每组实验组包含4-5只小鼠 假丝酵母 感染组。初始细胞来源于同源的 Thy1.1 或 CD45.1 小鼠，以便追踪移植的 Th17 细胞 体内 分别使用 Thy1.1 或 CD45.1 染色（图1A。共转移的T调节性T细胞 源自CD45.2小鼠，以便与CD45.1 Th17细胞区分开来。在部分实验中，使用C.B-17 Thy1.2 scid 受体小鼠，从Thy1.1 Balb/C小鼠获取的Th17供体细胞以及T调节性T细胞 来自同源型 Thy1.2 小鼠的样本被使用。仅 假丝酵母感染小鼠而非未感染小鼠表现出重建的CD45.1细胞的募集与扩增+ 舌引流淋巴结中的Th17细胞，即引流淋巴结。该结果表明，真菌特异性的Th17...

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讨论

该模型基于诱导口腔C. albicans感染依赖的Th17型炎症反应。由于缺乏Tregs，Th17细胞介导的炎症反应不受控制，导致免疫病理损伤难以消退。体外诱导分化的初始CD4细胞定向分化为Th17细胞后用于过继性转移。培养约第3天时，40–50%的CD4+细胞可检测到IL-17A的表达（即Th17细胞），因此被用于小鼠注射。该模型的主要优势在于Th17细胞可引发感染特异性的免疫病理损伤，而通过注射Treg细胞可有效缓解该病理过程。因此，该模型可用于评估免疫调节策略，并以Treg细胞注射作为阳性对照。炎症程度可通过小鼠体重下降、组织病理学评分以及感染小鼠Th17细胞产生促炎细胞因子的情况进行简便评估。

在过继性移植 Th17 细胞后，这些细胞迁移至次级淋巴器官及包括舌部（感染的主要部位）在内的多种组织。感染发生后，其他炎性细胞也被募集至舌部以清除感染。然而，在缺乏 Treg 介导的免疫调节情况下，Th17 细胞本身并不能清除感染，反而导致免疫病理反应加剧。共移...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

我们感谢Helene Bernstein博士为我们提供流式细胞仪的使用权限。同时感谢CFAR流式细胞术实验室提供的流式细胞术服务。本项目部分得到了CTSC核心资源使用资金以及STERIS公司/大学医院-传染病科资助项目对PP的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
CAF-2匹兹堡大学 (Sarah Gaffen)-白色念珠菌培养
U型底96孔板 Fisher055588用于细胞培养
a-CD3 eBiosciences16-0031-85将细胞极化为Th17条件
a-CD28 eBiosciences16-0281-85将细胞极化为Th17条件
m-IL-6Bio BasicRC232将细胞极化为Th17条件
h-TGF-b R&D240-B将细胞极化为Th17条件
a-IFN-g eBiosciences16-7311-85将细胞极化为Th17条件
a-IL-4 eBiosciences16-7041-85将细胞极化为Th17条件
α-IL17A ef660eBiosciences50-7177-82用于细胞培养 - 1:50
α-TNFa-PE-Cy7eBiosciences25-7423-41用于细胞培养 - 1:100
α-RORgt PE eBiosciences12-6981-82用于细胞培养 - 1:50
YNB无氨基酸/蛋白胨/葡萄糖培养基 Bio BasicS507.SIZE白色念珠菌生长培养基
摇床培养箱 New Brunswick ScientificInnova 4300白色念珠菌培养孵育
15 ml 离心管Bio BasicBT888-SY用于细胞培养和白色念珠菌生长
50 ml 离心管Bio BasicCT 788-YS用于细胞培养和白色念珠菌生长
台式离心机VWR International LLC82017-654用于沉淀白色念珠菌 - 900 g
Allegra 离心机Beckman Coulter392302细胞培养 - 480 g
1.5 ml 离心管Bio BasicBT620-NS制备白色念珠菌终浓度
2x 多聚甲醛Electron Microscopy Sciences15710固定白色念珠菌用于计数
血细胞计数板VWR International LLC15170-172细胞计数
PBS - 磷酸盐缓冲液Bio BasicPD8117缓冲液制备
氯胺酮/赛拉嗪 凯斯西储大学 - 动物资源中心-从动物资源中心批准的麻醉方案中获取
眼用润滑软膏 Allergan-动物眼部软膏，防止干燥
生理盐水 (0.9% NaCl)G Biosciences786-561给予动物以防止脱水
直径3 mm的棉球 VWR International LLCBP7603用于白色念珠菌感染的3 mm棉球
加热凝胶垫凯斯西储大学 - 动物资源中心-用于维持体温并促进快速恢复
苏木精和伊红染色Histoserv - MD-组织病理学
10% 甲醛 Electron Microscopy SciencesJC1111/MC组织病理学
70% 乙醇 VWR International LLC97064-490用于消毒
PMA - 佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯Sigma-AldrichP1585-1MG细胞再刺激
离子霉素Life Technologies124222 1mg细胞再刺激
固定与破膜试剂盒eBiosciencesE16913-106用于流式细胞术的细胞固定
结核菌素注射器BD Biosciences309659小鼠注射
25 G × 3/8 针头BD Biosciences309626小鼠注射
Rag1 -/- 小鼠Jackson 实验室货号：002216受体小鼠
CD45.1 同源小鼠Jackson 实验室货号：002014 供体 Th17 细胞来源
CB17-SCID 小鼠Jackson 实验室货号：001303受体小鼠
Balb/c 小鼠Jackson 实验室货号：000651供体 Th17 细胞来源

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