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方法文章

利用荧光清除实验评估斑马鱼肾功能

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DOI：

10.3791/52540

⸱

2015年2月20日

 ,  , 
1Genetics and Genomic Medicine, Institute of Child Health, University College London, 2Molecular Cell Science Research Centre, St. George's University of London

本文内容

摘要

斑马鱼是研究慢性肾病（CKD）的常用模型。然而，由于其体型较小，无法使用传统方法评估其肾功能。本文介绍一种荧光染料肾脏清除实验1，可实现对CKD斑马鱼模型肾功能的定量分析。

摘要

斑马鱼胚胎为研究器官发生和人类遗传性疾病提供了一个易于操作的模型。尽管相对简单，斑马鱼肾脏的发育和功能几乎与人类相同。人类肾脏结构的一个主要区别在于拥有数以百万计的肾单位，而斑马鱼仅有两个。然而，将如此复杂的系统简化为基本功能单位，有助于我们理解肾脏是如何发育和运作的。在斑马鱼中，位于中线的肾小球负责将血液初步滤过至两条前肾小管，这两条小管分别沿胚胎两侧下行，最终在泄殖腔处汇合。前肾小管内密集分布着可运动的纤毛，这些纤毛促进滤过液沿分段的小管移动，并在最终经由泄殖腔排出之前完成多种溶质的交换2-4。许多与慢性肾病（CKD）相关的基因，包括与纤毛形成相关的基因，已在斑马鱼中得到研究5。然而，一个主要的局限在于难以评估基因操作后斑马鱼肾脏的功能。传统用于测量人类肾功能障碍的检测方法被证明无法直接应用于斑马鱼，主要原因是其水生环境和体型微小。例如，由于胚胎期鱼类体型过小，无法实际采集其血液以分析尿素和肌酐含量。此外，斑马鱼产生的尿液量不足以使用常规的蛋白尿“试纸条”进行检测，而这种检测常用于患者的初步检查。本文描述了一种荧光检测方法，利用斑马鱼身体的光学透明性，定量监测荧光染料随时间从血管系统经肾脏清除的过程，从而反映肾功能状态1,6-9。

引言

人类肾脏在清除血液中代谢废物以及重吸收维持细胞稳态所需溶质方面发挥着关键作用。存在多种可导致肾功能障碍的人类遗传性疾病。其中最常见的遗传性肾病是常染色体显性多囊肾病（ADPKD），其特征是在肾小管内形成充满液体的囊泡；囊泡生成所造成的损伤对肾脏功能具有严重危害10。ADPKD 的发病率约为 1:800 至 1:1,000，占终末期肾功能衰竭（ESRF）患者总数的 8% 至 10%11。目前已发现多个与 ADPKD 发病相关的基因，其中多囊蛋白-1（PKD1）和多囊蛋白-2（PKD2）分别约占病例的 85% 和 15%12,13。此外，PKD1 和 PKD2 基因产物定位于纤毛，并在纤毛发生过程中起基础性作用14,15。目前公认存在一类影响纤毛功能并导致慢性肾病（CKD）的人类遗传性疾病家族，统称为纤毛病（ciliopathies）16。

影响纤毛发育和功能的人类遗传性疾病数量日益增加，这使得这一曾被认为退化的细胞器受到全球关注。纤毛是一种毛发状的细胞突起，富含受体和离子通道，对关键细胞信号转导事件至关重要。纤毛由基于微管的轴丝结构组成，通常由九组呈放射状排列的微管双联体构成，可带有或不带中央单微管对。轴丝结构决定了纤毛的类型及其作用方式。9+2微管排列赋予纤毛运动能力，使其可用于推动上皮表面液体的流动；而9+0结构则无运动能力，但被认为主要参与细胞信号传导事件17。除了慢性肾病（CKD）外，纤毛功能障碍还会导致一系列典型的纤毛病特征，包括肥胖、视网膜变性、多指（趾）畸形以及认知障碍16。然而，CKD对患者生活质量的危害最为严重，因此成为建立适用于纤毛相关CKD的in vivo模型的主要推动力。

斑马鱼是研究人类遗传病病因的优良模型。其发育迅速、产卵量大、组织透明，且 子宫外 生长使斑马鱼的发育过程能够被直观观察，并可相对容易地操控生物学事件。利用近年来基因组编辑工具（CRISPR）的成功，可对基因进行遗传修饰。18 以及 TALENS19），使用反义吗啉代寡核苷酸技术进行敲低20，或通过向其水生环境中添加化合物进行药理学调控。事实上，斑马鱼为开展其他动物模型难以实施的实验提供了平台。尽管斑马鱼相较于人类属于结构较为简单的脊椎动物，但其在器官、基因及信号通路等方面与人类共享许多功能上保守的特征。例如，斑马鱼肾脏在结构和功能上与人类肾脏极为相似21,22然而，与通过一系列阶段发育的哺乳动物肾脏不同（每个阶段均以更发达的肾脏为标志，即前肾、中肾和后肾），胚胎期斑马鱼仅发育出前肾，这是肾脏最不成熟的形态。尽管哺乳动物肾脏由数百万个肾单位构成其基本结构单元，斑马鱼胚胎仅有两个肾单位。允许初始血液滤过的肾小球在腹侧中线处融合，位于主动脉正下方。血液经肾小球滤过后进入前肾小管，小管沿身体纵轴向尾部延伸，并在经泄殖腔排出之前汇合。前肾小管具有大量带动力纤毛的结构，这些动力纤毛促进滤液向尾部出口方向流动3,4这一简单的前肾结构可在斑马鱼幼体生长的数周内维持其体内稳态，随后逐渐发育为更为复杂的中肾结构。21然而，斑马鱼从未发育出后肾21尽管斑马鱼具有其独特性，其肾单位仍具有与哺乳动物相似的基因表达谱，因此提供了无与伦比的研究优势 体内 肾发生模型3,22.

常规情况下，通过一系列血液和尿液检测来评估患者的肾功能。通常对血液中的溶解盐、尿素和肌酐进行分析。尿素、肌酐水平升高以及电解质浓度异常提示肾功能可能存在障碍。利用比色试纸条进行尿液分析，可检测尿液样本中蛋白质、血液、脓液、细菌和糖分的异常含量。此类检测通常需要约30 ml尿液或5–10 ml血液。将这些类型的检测方法转化为小样本量检测一直存在困难 在体 模式生物（如斑马鱼）的肾脏功能检测一直面临挑战，主要原因是难以收集足够量的血液或尿液以进行检测。本文针对目前缺乏合适的斑马鱼肾功能检测方法的问题，介绍一种创新性的研究技术。通过向血液循环中注射荧光染料，我们能够实时监测并分别定量分析荧光信号经由肾脏从血液中滤过和排泄的过程。该方法可用于研究疾病所致的肾脏损伤，本文亦提供了相关示例。

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方案

伦理声明：动物的饲养、管理和实验操作均受《1986年动物（科学程序）法案》的规定和监管。所有动物实验均在英国内政大臣颁发的许可证（PIL编号：70/7892）授权下进行，符合英国伦敦圣乔治大学（SGUL）生物服务管理组及生物服务伦理委员会的要求。所有实验均尽可能减少动物使用数量，并优化实验操作和饲养条件，以最大限度减轻动物痛苦并提升其福利。

1. 仪器、麻醉剂和荧光染料的准备

  1. 使用微电极拉制仪和标准壁硼硅酸盐毛细管（无 filament）拉制适合显微注射长度的针头（图 1A）。
  2. 制作琼脂糖模具，用于固定胚胎方向，以便于向心包腔注射（图 1B）。将约十片玻璃载玻片粘合在一起，形成错位排列的“阶梯状”结构。为获得最佳效果，每片载玻片中央滴加一滴快速固化环氧树脂胶水。
  3. 使用经本生灯加热的手术刀，在两个 10 ml 塑料移液管的中部切下一长约 78 mm 的片段，适当去除移液管末端。将移液管片段用环氧树脂胶水粘附并固定在堆叠的玻璃载玻片上，以提供稳定性，使模具可浸入 90 mm 培养皿中。应尽可能确保载玻片边缘与培养皿底部垂直对齐。待胶水完全固化。
  4. 在含有鱼用水（来自水族箱）的 2% 琼脂糖溶液中浇铸模具。将琼脂糖倒入 90 mm 培养皿中，将模具置于敞开的培养皿上方，使堆叠载玻片的边缘以一定角度浸入琼脂糖液面下。在实验台上静置 30 分钟使其凝固。
  5. 取出载玻片模具，用含 Tricaine 麻醉剂（见步骤 1.9）的新鲜鱼用水（按 1:25 比例）覆盖模具上留下的琼脂糖印迹。
  6. 配制罗丹明葡聚糖（RD）染料溶液。将标记罗丹明 B 的 10,000 MW 葡聚糖溶于高压灭菌的超纯水中，配制成 50 mg/ml 的储存液。显微注射前，再用高压灭菌的超纯水稀释至终浓度为 5 mg/ml。
    注意：斑马鱼色素细胞自受精后 24 小时（hpf）开始分化；这些细胞可能在图像采集过程中遮蔽荧光标记物。
  7. 使用 N-苯硫脲（PTU）抑制黑色素细胞的形成，该试剂通过抑制酪氨酸酶活性阻断黑色素生成。将 PTU 粉末溶于水族箱水中，配制成 0.003% 的储存液，并在 60 °C 加热以充分溶解。
  8. 将斑马鱼胚胎孵育于亚甲蓝溶液（一种温和的杀菌剂）中，以防止真菌滋生并提高存活率。将含 0.1% 亚甲蓝的储存液 2 ml 加入 1 L 超纯水中，作为标准胚胎培养基使用。
  9. 按照《斑马鱼手册》23 中的说明，配制 15 mM 的 Tricaine（ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt）储存液。对胚胎进行麻醉，使其固定不动，以便进行显微注射操作。
  10. 麻醉胚胎后，利用甲基纤维素的无毒且黏稠的特性对其进行定位，以便成像。配制 200 ml 的 3% 甲基纤维素溶液：将 130 ml 水在 -20 °C 冰箱中预冷 30 分钟，然后置于冰上；在玻璃烧杯中将 70 ml 水加热至 80 °C，加入 6 g 甲基纤维素，用玻璃棒搅拌至所有颗粒润湿并均匀分散；加入冰水混合，混匀后于 4 °C 冷却 30 分钟，再分装至 50 ml 离心管中。
    注意：降低温度有助于甲基纤维素溶解。随着粉末水合，溶液将逐渐变稠。3% 甲基纤维素可在 4 °C 短期保存一周，或在 -20 °C 长期保存，且不易滋生细菌。使用前确保甲基纤维素已恢复至室温。
  11. 对斑马鱼进行荧光染料注射时，使用标准显微注射装置（图 1C）。该装置由空气压缩机连接压力调节系统，驱动直式移液管持针器，适用于外径 1.0 mm 的毛细管。移液管持针器应安装在 MM33 紧凑型三轴控制显微操作器上，并通过磁力支架固定于钢板底座。胚胎的观察、操作和注射均在体视解剖显微镜下完成。

2. 斑马鱼饲养与注射前处理

  1. 按照先前所述方法饲养斑马鱼23。使用循环水系统，将水温恒定维持在28.5 °C，用碳酸氢钠和Instant Ocean海盐分别调节pH至6.8–7.2，电导率至450–550 μS。根据实验需要使用野生型或转基因斑马鱼品系，每8 L水族箱中饲养密度为15尾雄鱼与15尾雌鱼。将斑马鱼养殖设施的光周期设定为每天9:00至23:00共14小时光照。
  2. 斑马鱼产卵始于光周期开始时，即早晨开灯后。为在不干扰鱼类的情况下最大程度收集卵，应在收集前一晚将带有网状插件（可从斑马鱼专业供应商处获得）的繁殖箱浸入野生型种鱼水族箱中。
  3. 在收集当天，让鱼产卵30–40分钟，随后使用茶筛和新鲜养殖用水收集并冲洗卵。将清洗后的卵置于含胚胎培养基的90 mm培养皿中，并在28.5 °C下孵育。
  4. 使用PTU处理胚胎以抑制黑色素生成。在受精后8小时（8 hpf），将存活的胚胎连同少量液体转移至含有1:100 PTU胚胎培养基的新培养皿中，继续在28.5 °C下孵育至72 hpf。
    注意：若在更早阶段使用PTU可能引起发育异常，因此应仅限于8 hpf之后使用，但最晚可处理至24 hpf。较晚添加PTU不能完全阻断眼部色素沉着，但通常可有效抑制躯干黑色素细胞的形成。

3. 显微注射

注意：心包包裹着心脏，但心包腔内的液体使其与心脏分离，从而起到保护作用并便于心脏运动。本实验的目的是将RD注入心包腔，以便染料快速被血管系统吸收。

  1. 使用微量加样器吸头将 6 μl 稀释后的 RD 溶液吸入针头中，并固定于显微操作仪的针头夹持器内。用精细镊子折断针头末端（图 1A）。通过将脉冲持续时间调至分钟级以推动 RD 溶液移至针尖，完成后切换回毫秒级。
  2. 利用载物台测微计、压力调节器以及通过镊子精细调整针尖长度，将喷出液滴的直径调节至 100 μm，相当于 0.5 nl 的体积（图 2A）。
    注意：折断针头时，注意不要折除过多，否则将难以校准注射体积。如有必要，可进一步折断针尖以增大液滴尺寸，但应保持针头足够粗细，以确保其能顺利进入心包腔而不发生过度弯曲或对组织造成损伤。
  3. 注射前，将胚胎置于含 Tricaine 的胚胎培养基中进行麻醉。准备两个 35 mm 的培养皿，各加入 5 ml 胚胎培养基，并分别标记为“Tricaine”和“恢复”。
  4. 向标记正确的培养皿中加入 200 μl 的 Tricaine 原液。准备注射时，选取 72 hpf 的单个胚胎，并用最少液体转移至含 Tricaine 的培养皿中。监测胚胎活动状态，使用截短的微量加样器吸头轻轻搅动，检测胚胎是否已充分麻醉并固定。
  5. 将麻醉后的胚胎转移至注射模具中，将其置于琼脂糖槽内，使左侧朝上，确保心脏位于视野左侧。
  6. 为将 RD 注入心脏，用针头穿刺心包膜，向麻醉胚胎的心包腔内注入 1 nl 的 RD 溶液（图 2B，右图）。注射后撤出针头。将注射后的胚胎以最少液体转移至“恢复皿”中，观察 1 分钟。随后将该胚胎转移至含有 1 ml 新鲜胚胎培养基（含 PTU）的 24 孔板中，并做好相应标记。
    注意：心包膜较坚韧，但在心包膜与腹尾侧咽弓及背头侧卵黄囊交汇处存在一个明显的薄弱点（图 2B 箭头所示）。针头应朝向此沟槽位置。当针头到位后，轻敲显微操作仪顶部，有助于针头进入心包腔。
  7. 对每组实验至少重复步骤 3.2–3.6 共 10 个胚胎，将每条鱼分别置于独立孔中并进行唯一编号，以便后续个体化追踪。在 28.5 °C 下孵育 3 小时。

4. 成像采集

  1. 注射后3小时（hpi），按照前述方法麻醉胚胎，并转移至含有3%甲基纤维素的35 mm培养皿中。轻柔地将胚胎推入甲基纤维素中，并调整方向，使胚胎侧壁朝上以便成像。
  2. 在紫外光下获取胚胎图像，使用可观察570 nm发射光的滤光片（图2C). 完成图像采集后，让胚胎恢复，再将其放回指定的孔中。对所有注射后的胚胎进行图像采集，并于28.5 °C继续孵育。
    注意：本实验方案中使用了配备TXR滤光片组的荧光体视显微镜、DFC300FX相机及相应的应用软件。请记录确切的图像采集参数，以便后续图像采集时保持一致。
  3. 在感染后24小时获取第二轮图像，方法同上。在完成感染后3小时和24小时的所有图像采集后，人道处死胚胎或将其用于其他实验用途。 例如， 免疫组织化学

5. 图像处理

  1. 使用美国国立卫生研究院（NIH）的 ImageJ 软件分析图像，量化每个注射后胚胎在感染后3小时（3 hpi）和24小时（24 hpi）的荧光强度。测量荧光强度时，在 ImageJ 中打开图像，并设定一个面积为 100 px2 的感兴趣区域（roi）（编辑 → 选择 → 指定）。
  2. 将心脏置于 roi 的中心位置（图 2C），设置测量参数以包含平均灰度值和面积（分析 → 设置测量），执行测量（分析 → 测量）。对每个胚胎在 3 hpi 和 24 hpi 的每组图像均完成上述操作，并将平均灰度值导入电子表格以进行后续处理。
    注意：我们选择固定大小为 100 px2 的 roi，因为该尺寸可涵盖不同胚胎之间的心脏区域。选择心脏作为测量部位，是因其体积较大，便于在血液进入肾脏之前测量其荧光含量。
  3. 使用适当的统计学软件进行统计分析，采用学生 t 检验（student’s t-test）比较各组之间的统计学显著性。

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结果

Bardet-Biedl 综合征（BBS）是一种罕见的异质性纤毛病，全球发病率约为 1:160,00016。患者常伴有多种相关问题，包括多囊肾，因此常需接受肾脏透析或移植治疗24。终末期肾病（ESRF）是 BBS 患者最常见的死亡原因，约 30% 的患者会发展为慢性肾病（CKD）16。目前已有 20 个无关联基因被证实与 BBS 相关，但尚未见已发表的基因型-表型关联研究。BBS 蛋白在纤毛和基体中具有共同的蛋白定位结构域，结合患者的特征性表型，可推断其为纤毛病。BBS9 编码甲状旁腺激素反应性 B1 蛋白（PTHB1），该蛋白与其他 BBS 蛋白（BBS1、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS8）共同组成核心 BBSome 复合物，负责初级纤毛的形成24。BBS9 基因突变占所有 BBS 病例的 6%24。此外，甲状旁腺激素（PTH）已被证实可通过促进肾上皮细胞增殖参与肾囊肿的形成，提示斑马鱼中 bbs9 功能的缺失可能导致肾脏缺陷25。既往利用 bbs9 沉...

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讨论

斑马鱼为模拟人类遗传性疾病提供了有价值的工具，其作为 体内 研究的科学手段，已推动了对包括肾脏在内的多种生物系统遗传机制的深入研究。目前，人们对斑马鱼肾脏的发育过程和功能已有深入了解。斑马鱼与人类在肾发生过程中的显著相似性，以及与致病基因的高度同源性21，凸显了其在揭示基因功能缺陷如何导致肾脏疾病病理机制方面的重要作用。事实上，利用反义吗啉代寡核苷酸敲低技术，或更先进的靶向基因组编辑工具如 TALENS 或 CRISPR，可轻松实现对斑马鱼的遗传操作。构建疑似致肾病基因的敲低或突变模型，是理解这些基因在疾病表型中作用的第一步。为此，需要一种可靠的肾功能检测方法，以判断候选基因是否可能与患者中观察到的病理表现相关。

肾功能检测在人类中操作简便且成本相对较低，通常通过检测血液或尿液中溶质的水平来进行。然而，由于斑马鱼体型微小且生活在水生环境中，这些方法无法适用于斑马鱼。本文所述的罗丹明葡聚糖检测利用了前肾小管从血液中滤过低分子量成分的能力。位于肾脏肾小囊（包裹肾小球毛细血管）内的足细胞，可通过裂孔隔膜允许水、离子盐和葡萄糖等...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

技术协助由 Jaipreet Bharj 提供。本工作得到欧盟第七框架计划（SYSCILIA -241955）和荷兰肾脏基金会（CP11.18）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
P-97 SUTTER Flaming/Brown型微电极拉制仪IntracelP-97
硼硅酸盐标准壁毛细管Harvard Apparatus30-0017
玻璃显微镜载玻片VWR International631-0109
环氧树脂胶Evo-Stik
罗丹明B标记的10,000 MW葡聚糖Life technologies D-1824
N-苯基硫脲 Sigma-Aldrich P7629
亚甲蓝 Sigma-AldrichM9140
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐Sigma-AldrichA5040
甲基纤维素Sigma-AldrichM0512
空气压缩机 Jun-AirOF302-15
Picospritzer III Parker Instruments 051-0500-900
紧凑型三轴控制显微操作器 MarzhauserMM33 
解剖体视显微镜NikonSMZ1000
微量移液加载吸头Eppendorf5242956003
Dumont #5镊子 Sigma-AldrichF6521
载物台测微尺 Pyser- SGI02A00404

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