利用荧光清除实验评估斑马鱼肾功能

摘要

斑马鱼是研究慢性肾病（CKD）的常用模型。然而，由于其体型较小，无法使用传统方法评估其肾功能。本文介绍一种荧光染料肾脏清除实验¹，可实现对CKD斑马鱼模型肾功能的定量分析。

摘要

斑马鱼胚胎为研究器官发生和人类遗传性疾病提供了一个易于操作的模型。尽管相对简单，斑马鱼肾脏的发育和功能几乎与人类相同。人类肾脏结构的一个主要区别在于拥有数以百万计的肾单位，而斑马鱼仅有两个。然而，将如此复杂的系统简化为基本功能单位，有助于我们理解肾脏是如何发育和运作的。在斑马鱼中，位于中线的肾小球负责将血液初步滤过至两条前肾小管，这两条小管分别沿胚胎两侧下行，最终在泄殖腔处汇合。前肾小管内密集分布着可运动的纤毛，这些纤毛促进滤过液沿分段的小管移动，并在最终经由泄殖腔排出之前完成多种溶质的交换^2-4。许多与慢性肾病（CKD）相关的基因，包括与纤毛形成相关的基因，已在斑马鱼中得到研究⁵。然而，一个主要的局限在于难以评估基因操作后斑马鱼肾脏的功能。传统用于测量人类肾功能障碍的检测方法被证明无法直接应用于斑马鱼，主要原因是其水生环境和体型微小。例如，由于胚胎期鱼类体型过小，无法实际采集其血液以分析尿素和肌酐含量。此外，斑马鱼产生的尿液量不足以使用常规的蛋白尿“试纸条”进行检测，而这种检测常用于患者的初步检查。本文描述了一种荧光检测方法，利用斑马鱼身体的光学透明性，定量监测荧光染料随时间从血管系统经肾脏清除的过程，从而反映肾功能状态^1,6-9。

引言

人类肾脏在清除血液中代谢废物以及重吸收维持细胞稳态所需溶质方面发挥着关键作用。存在多种可导致肾功能障碍的人类遗传性疾病。其中最常见的遗传性肾病是常染色体显性多囊肾病（ADPKD），其特征是在肾小管内形成充满液体的囊泡；囊泡生成所造成的损伤对肾脏功能具有严重危害¹⁰。ADPKD 的发病率约为 1:800 至 1:1,000，占终末期肾功能衰竭（ESRF）患者总数的 8% 至 10%¹¹。目前已发现多个与 ADPKD 发病相关的基因，其中多囊蛋白-1（PKD1）和多囊蛋白-2（PKD2）分别约占病例的 85% 和 15%^12,13。此外，PKD1 和 PKD2 基因产物定位于纤毛，并在纤毛发生过程中起基础性作用^14,15。目前公认存在一类影响纤毛功能并导致慢性肾病（CKD）的人类遗传性疾病家族，统称为纤毛病（ciliopathies）¹⁶。

影响纤毛发育和功能的人类遗传性疾病数量日益增加，这使得这一曾被认为退化的细胞器受到全球关注。纤毛是一种毛发状的细胞突起，富含受体和离子通道，对关键细胞信号转导事件至关重要。纤毛由基于微管的轴丝结构组成，通常由九组呈放射状排列的微管双联体构成，可带有或不带中央单微管对。轴丝结构决定了纤毛的类型及其作用方式。9+2微管排列赋予纤毛运动能力，使其可用于推动上皮表面液体的流动；而9+0结构则无运动能力，但被认为主要参与细胞信号传导事件

方案

伦理声明：动物的饲养、管理和实验操作均受《1986年动物（科学程序）法案》的规定和监管。所有动物实验均在英国内政大臣颁发的许可证（PIL编号：70/7892）授权下进行，符合英国伦敦圣乔治大学（SGUL）生物服务管理组及生物服务伦理委员会的要求。所有实验均尽可能减少动物使用数量，并优化实验操作和饲养条件，以最大限度减轻动物痛苦并提升其福利。

1. 仪器、麻醉剂和荧光染料的准备

1. 使用微电极拉制仪和标准壁硼硅酸盐毛细管（无 filament）拉制适合显微注射长度的针头（图 1A）。
2. 制作琼脂糖模具，用于固定胚胎方向，以便于向心包腔注射（图 1B）。将约十片玻璃载玻片粘合在一起，形成错位排列的“阶梯状”结构。为获得最佳效果，每片载玻片中央滴加一滴快速固化环氧树脂胶水。
3. 使用经本生灯加热的手术刀，在两个 10 ml 塑料移液管的中部切下一长约 78 mm 的片段，适当去除移液管末端。将移液管片段用环氧树脂胶水粘附并固定在堆叠的玻璃载玻片上，以提供稳定性，使模具可浸入 90 mm 培养皿中。应尽可能确保载玻片边缘与培养皿底部垂直对齐。待胶水完全固化。
4. 在含有鱼用水（来自水族箱）的 2% 琼脂糖溶液中浇铸模具。将琼脂糖倒入 90 mm 培养皿中，将模具置于敞开的培养皿上方，使堆叠载玻片的边缘以一定角度浸入琼脂糖液面下。在实验台上静置 30....

结果

Bardet-Biedl 综合征（BBS）是一种罕见的异质性纤毛病，全球发病率约为 1:160,000¹⁶。患者常伴有多种相关问题，包括多囊肾，因此常需接受肾脏透析或移植治疗²⁴。终末期肾病（ESRF）是 BBS 患者最常见的死亡原因，约 30% 的患者会发展为慢性肾病（CKD）¹⁶。目前已有 20 个无关联基因被证实与 BBS 相关，但尚未见已发表的基因型-表型关联研究。BBS 蛋白在纤毛和基体中具有共同的蛋白定位结构域，结合患者的特征性表型，可推断其为纤毛病。BBS9 编码甲状旁腺激素反应性 B1 蛋白（PTHB1），该蛋白与其他 BBS 蛋白（BBS1、BBS2、BBS4、BBS5、BBS7、BBS8）共同组成核心 BBSome 复合物，负责初级纤毛的形成²⁴。BBS9 基因突变占所有 BBS 病例的 6%²⁴。此外，甲状旁腺激素（PTH）已被证实可通过促进肾上皮细胞增殖参与肾囊肿的形成，提示斑马鱼中 bbs9 功能的缺失可能导致肾脏缺陷²⁵。既往利用 bbs9 沉.......

讨论

斑马鱼为模拟人类遗传性疾病提供了有价值的工具，其作为 体内 研究的科学手段，已推动了对包括肾脏在内的多种生物系统遗传机制的深入研究。目前，人们对斑马鱼肾脏的发育过程和功能已有深入了解。斑马鱼与人类在肾发生过程中的显著相似性，以及与致病基因的高度同源性²¹，凸显了其在揭示基因功能缺陷如何导致肾脏疾病病理机制方面的重要作用。事实上，利用反义吗啉代寡核苷酸敲低技术，或更先进的靶向基因组编辑工具如 TALENS 或 CRISPR，可轻松实现对斑马鱼的遗传操作。构建疑似致肾病基因的敲低或突变模型，是理解这些基因在疾病表型中作用的第一步。为此，需要一种可靠的肾功能检测方法，以判断候选基因是否可能与患者中观察到的病理表现相关。

肾功能检测在人类中操作简便且成本相对较低，通常通过检测血液或尿液中溶质的水平来进行。然而，由于斑马鱼体型微小且生活在水生环境中，这些方法无法适用于斑马鱼。本文所述的罗丹明葡聚糖检测利用了前肾小管从血液中滤过低分子量成分的能力。位于肾脏肾小囊（包裹肾小球毛细血管）内的足细胞，可通过裂孔隔膜允许水、离子盐和葡萄糖等.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
P-97 SUTTER Flaming/Brown型微电极拉制仪	Intracel	P-97
硼硅酸盐标准壁毛细管	Harvard Apparatus	30-0017
玻璃显微镜载玻片	VWR International	631-0109
环氧树脂胶	Evo-Stik
罗丹明B标记的10,000 MW葡聚糖	Life technologies	D-1824
N-苯基硫脲	Sigma-Aldrich	P7629
亚甲蓝	Sigma-Aldrich	M9140
氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	A5040
甲基纤维素	Sigma-Aldrich	M0512
空气压缩机	Jun-Air	OF302-15
Picospritzer III	Parker Instruments	051-0500-900
紧凑型三轴控制显微操作器	Marzhauser	MM33
解剖体视显微镜	Nikon	SMZ1000
微量移液加载吸头	Eppendorf	5242956003
Dumont #5镊子	Sigma-Aldrich	F6521
载物台测微尺	Pyser- SGI	02A00404