本文介绍了在培养的HL-1心房细胞单层中进行双通道光学标测的技术。该独特方案可对同一区域内的钙（Ca）和膜电位（Vm）活动进行同步可视化，从而实现对培养单层细胞电生理特性的详细检测与分析。
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方法文章
培养的HL-1心房肌细胞单层的电压与钙双通道光学标测
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
光学标测已被证明是一种有价值的技術，可用于檢測完整離體心臟和培養的心肌細胞單層中的心臟電活動。ex vivo完整心臟和培養的心肌細胞單層中的心臟電活動。HL-1細胞已被廣泛用作二維細胞模型，以研究心臟生理學的多個方面。然而，在培養的HL-1心房細胞單層中，從同一視野同時光學標測鈣（Ca）瞬變和動作電位一直是一項重大挑戰。這是因為需要特殊的操作和細心處理，以製備出能夠被電激動並進行光學標測的健康細胞。因此，我們開發了一套用於雙通道光學標測的優化操作方案。在本文中，我們詳細描述了如何進行雙通道光學標測實驗。該方案是一種有用的工具，有助於加深對心律失常發展過程中動作電位傳導和鈣動力學的理解。
引言
一种独特的钙离子（Ca）和膜电位（Vm）双通道光学标测技术1-5正逐渐成为一种高效工具，可用于在完整心脏和培养的单层细胞中同步记录Vm和Ca信号。该技术使得获取钙瞬变与动作电位之间关系的有力信息成为可能，从而更深入地理解心脏心律失常潜在的电生理机制。
培养的细胞单层已被证明是研究心脏电生理学及心律失常潜在机制的有用细胞模型。4,6-8 HL-1 细胞是一种特征明确的心房肌细胞培养系。HL-1 细胞还维持一种独特的分化型基因型和表型，包含成年心房肌细胞的形态学、电生理学和药理学特性。这些细胞表达心脏基因和蛋白质，包括重要的心脏离子通道即L型和T型钙通道9 以及在成人房颤肌细胞中通常存在的肌节收缩蛋白的成熟异构体，正如我们及其他研究者先前所报道的。10-13 此外，HL-1 细胞可培养形成二维（2-D）心肌细胞单层。因此，使用培养的 HL-1 单层细胞具有以下优势：1）相较于维持心肌细胞系，培养成本相对较低且操作更为简便 原代细胞的分离与培养 新生小鼠心肌细胞；2）融合的单层细胞可减少由心脏三维结构带来的结构复杂性；3）细胞单层可消除完整心脏中发生的间质纤维化干扰，从而可在无成纤维细胞和间质基质干扰的情况下，解析一群心肌细胞的特定电生理功能；4）在培养的细胞单层中，可有效评估药理或遗传操作所导致的功能性后果。因此，HL-1细胞已成为研究心肌细胞生理学多个方面以及起搏诱导的异常电活动的广泛应用的细胞模型。13-16 然而，为了进行光学标测研究，培养能够对外部电刺激起反应的健康细胞单层需要特殊的操作与护理。此外，双荧光染料染色过程可能容易破坏培养的融合细胞单层的完整性。因此，进行跨膜电位m/CA 在培养的HL-1单层细胞中进行双通道光学标测一直是一项巨大挑战。
本方法旨在提供在培养的HL-1单层细胞中成功进行双通道光学标测的关键步骤。本文详细介绍了HL-1细胞单层培养的优化方案、培养细胞单层的双通道光学标测以及标测数据处理方法。
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方案
1. 溶液配制
- 去甲肾上腺素（NP）溶液
- 将40 mg去甲肾上腺素溶解于25 ml 30 mM抗坏血酸溶液中（将0.1475 g抗坏血酸溶于25 ml纯化Milli-Q（MQ）水中）。配制过程中避免直接光照，因为去甲肾上腺素（NP）对光敏感。
- 使用0.22 µm针头滤器过滤NP溶液。将溶液分装至1 ml无菌微量离心管中，于-20 °C保存。一旦冷冻，NP可稳定保存一个月。
- 添加成分的洗涤液与终末Claycomb培养基
- 取43.5 ml Claycomb培养基，加入5 ml胎牛血清（FBS）、0.5 ml青霉素/链霉素、0.5 ml NP以及1:100稀释的L-谷氨酰胺，配制成50 ml终末添加成分的Claycomb培养基。配制过程中避免直接光照，因为Claycomb培养基对光敏感。
- 配制洗涤用Claycomb培养基时，除添加5% FBS并省略NP和L-谷氨酰胺成分外，其余成分与上述添加成分的Claycomb培养基相同。
注意：添加成分的终末及洗涤用Claycomb培养基在4 °C避光保存条件下可稳定使用两周。
- 大豆胰蛋白酶抑制剂溶液
- 将25 mg大豆胰蛋白酶抑制剂溶解于100 ml无钙无镁的Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS）中。
- 使用0.22 µm针头滤器过滤该溶液。
注意：灭菌后的溶液在4 °C保存条件下可稳定保存一个月。
- 明胶/纤连蛋白包被溶液
- 将0.1 g明胶溶于500 ml MQ水中，配制成0.02%明胶溶液。
- 高压灭菌后，将1 ml纤连蛋白加入199 ml 0.02%明胶溶液中，轻轻混匀。
- 将明胶溶液分装为每管6 ml，分别置于独立管中，于-20 °C保存。
- Hanks盐溶液
- 使用磁力搅拌器将以下盐类溶解于MQ水中（单位：mmol/L）：NaCl（136.9）、KCl（5.366）、KH2PO4（0.4409）、NaH2PO4（0.4000）、MgSO4（0.8142）、D-Glc（5.051）、NaHCO3（4.162）、HEPES（5.042）、CaCl2（1.261）。
- 钙离子敏感性染料（Rhod2）溶液
- 将1 mg Rhod2干粉溶于400 μl含20% Pluronic F-127的DMSO中，配制成Rhod2染料储备液，并于-20 °C保存。
- 实验开始前，将该储备液用Hanks盐溶液按1:1,000比例稀释，得到终末工作液。
- 电压敏感性染料（Rh237）溶液
- 将5 mg Rh237溶于2 ml DMSO中配制成储备液，并于-20 °C保存。实验开始前，将该储备液用Hanks盐溶液按1:1,000比例稀释，得到终末工作液。
注意：溶液1-4基于Claycomb HL-1细胞培养方案稍作修改。
2. 将HL-1心房肌细胞传代并接种于盖玻片上培养
注意：HL-1 细胞可从 Claycomb 博士（路易斯安那州立大学）处获得。
- 在T25培养瓶中培养HL-1细胞，每天加入5 ml添加物补充的Claycomb培养基。根据Claycomb HL-1细胞培养方案（如下所述）每五天传代一次T25培养瓶中的细胞10。
- 在T25培养瓶中的细胞达到完全汇合并准备传代前24小时，将圆形盖玻片（直径20 mm）放入12孔培养板中，然后在37 °C条件下用明胶/纤连蛋白覆盖过夜。
- 次日，吸除并弃去培养板中的明胶/纤连蛋白，每孔加入1.5 ml添加物补充的终末Claycomb培养基。
- 在第5天细胞达到完全汇合后，从T25培养瓶中进行细胞传代。吸除含汇合细胞的T25培养瓶中的培养基，并用37 °C的PBS短暂冲洗细胞。
- 吸除PBS，加入3 ml 0.05%胰蛋白酶/EDTA（37 °C），通过将胰蛋白酶/EDTA滴加至T25培养瓶底部以避免直接接触细胞。在37 °C孵育1分钟。
- 吸除胰蛋白酶/EDTA，每瓶T25培养瓶再加入1.3 ml胰蛋白酶/EDTA。室温孵育1分钟。在显微镜下观察，若细胞仍附着于培养瓶，轻敲培养瓶以完全解离残留细胞。
- 向细胞中加入1.3 ml大豆胰蛋白酶抑制剂，将细胞从培养瓶转移至15 ml离心管中。用5 ml洗涤用Claycomb培养基冲洗空培养瓶，并将冲洗液加入15 ml离心管中的细胞悬液中。以500 × g离心5分钟。
- 离心后，吸除上清液，并在6 ml添加物补充的终末Claycomb培养基中轻柔重悬细胞沉淀。
- 将细胞传代所得的细胞悬液取0.5 ml接种至12孔板的每个孔中。每天用新鲜的添加物补充的终末Claycomb培养基更换培养液。
注意：密切监测细胞生长情况，通常细胞单层在第4天达到汇合状态，且自发活动仍可见。此时，培养的单层细胞在第4至5天即可用于光学标测。
3. 向细胞加载钙离子和电压敏感性染料
- 进行光学标测研究时，轻轻从12孔细胞培养板中取出盖玻片，并用Hanks'盐溶液冲洗。
- 使用Ca²⁺敏感性染料Rhod2对细胞染色时，将盖玻片上的细胞单层与3 ml已氧合（用5% CO2/95% O2气体鼓泡）的Rhod2工作液在37 °C水浴中孵育30分钟。
- 使用Vm敏感性染料Rh237对细胞染色时，将已加载Rhod2的细胞单层浸入3 ml已氧合的Rh237工作液中，在37 °C水浴中再孵育15分钟。
4. 双通道光学成像
- 将用 Vm 和 Ca 染料双染的细胞单层置于倒置荧光显微镜上的灌流 chamber 中。使用加热循环系统，将细胞 chamber 的温度维持在 35 ± 1 °C。通过调节流经 chamber 的灌流速度，精确控制灌流液的温度，避免 chamber 内产生超过 0.3 °C 的温度梯度。
- 在记录 Vm/Ca 信号之前，用新鲜的 Hank 溶液冲洗细胞单层约 5 分钟，以去除前一步染色过程中残留的染料。
- 使用双极电极对健康的细胞单层进行起搏，该电极由一根充满 Hank 盐溶液的玻璃移液管和缠绕在移液管尖端的银丝组成，具体方法如前所述12,17。
- 以 200–500 毫秒的周期长度和 2 毫秒的脉冲宽度对健康的细胞单层进行起搏，预期起搏阈值约为 1 mV。
注意：对于每一批培养的细胞单层，应至少使用两个未经处理的单层来测试该批细胞的状态。健康的对照单层应在 200–500 毫秒的周期长度下能够被电起搏成功。如果对照单层无法被电起搏，表明该批细胞可能不适用于光学标测实验。 - 为同时激发 Vm 和 Ca 敏感染料，使用 LED 光源（520 nm 波长），并配备激发滤光片（510 nm/40）和二向色镜（561 nm）。
- 通过 40X 物镜收集细胞发出的荧光信号，并利用二向色镜（594 nm）将其分为 Vm 信号和 Ca 信号两部分。Vm 通道的发射光使用长通滤光片（700 nm）过滤，Ca 通道的发射光使用带通滤光片（585/40 nm）过滤。
- 使用两台 CCD 相机（80 × 80 像素，1,000 帧/秒；RedShirt Imaging）收集过滤后的荧光信号。
- 为避免染料光漂白，每次视野的记录时间应少于 2 秒，以限制光照暴露时间。通常，对每个单层采集四个不同区域的图像。
5. Vm 或 Ca 记录的数据处理
- 对于 Vm 和 Ca 信号（80 × 80 像素），在不同记录时间点将二十五个（5 × 5）相邻像素的强度值取平均，合并为一个强度值，以降低背景噪声。
注：数据平均后，单个动作电位或钙瞬变的每个记录时间点生成一个包含 16 × 16 个平均强度值（平均数据通道）的数据矩阵，空间分辨率为 50 μm。 - 定义记录的 Vm 或 Ca 信号的激活时间（AT）。
- 为定义单个动作电位或钙瞬变的激活时间（AT），使用先前描述的定制 MATLAB 算法确定 Vm 或 Ca 信号达到峰值幅度 50% 的时间点12。
- 手动校对分析所得的激活时间（AT），以消除程序分析过程中可能出现的任何错误。
- 在所用软件中分别存储记录的动作电位和钙瞬变的激活时间矩阵（16 × 16 平均数据通道）。
- 采用先前描述并稍作修改的矢量场分析方法12,18，基于激活时间（AT）矩阵计算动作电位或钙瞬变的传导速度（CV）矢量。
- 针对某一数据通道，利用其周围激活时间数据点（5 × 5 邻近的平均数据通道），通过 MATLAB 程序中的最小二乘算法拟合激活时间的平滑多项式曲面（AT 曲面），以计算该通道的传导速度（CV）矢量12,18。
- 使用以下公式计算传导矢量
公式 1：
公式 2：
θ = arctan [(dy/dT)/(dx/dT)]
注：Ve 是投影在 x 轴和 y 轴上的传导速度（CV）矢量；dx/dT 是 CV 矢量在 x 轴上的投影；dy/dT 是 CV 矢量在 y 轴上的投影；T 为激活时间曲面（AT 曲面）；x、y 表示二维坐标；Tx = ∂T/∂x 是 T 对 x 的偏导数；Ty = ∂T/∂y 是 T 对 y 的偏导数；θ 为 CV 矢量的最终方向。 - 将 AT 矩阵中的所有矢量按 36 个传导路径进行分组，每个路径覆盖罗盘上 10 度的扇形区域。
- 从 36 个传导路径中选择包含最多 CV 矢量的路径，并计算该路径的平均传导速度（CV），以此代表单层细胞的传导速度。
6. 波前传播的可视化
- 使用 MATLAB 软件将单个动作电位或钙瞬变在不同记录时间点的信号强度归一化为其峰值的相对值。
- 将每个记录时间点归一化后的强度数据临时存储到所用 MATLAB 软件中的一个 16 × 16 强度矩阵中。
- 利用 surf.m 函数，根据每个记录时间点存储的强度矩阵构建颜色编码的强度图。
注意：在强度图中，红色表示 Vm 或 Ca 信号的高强度，蓝色表示荧光信号的低强度。 - 使用 avifile.m 函数创建一个 .avi 文件。
- 使用 addframe.m 函数保存动作电位或钙瞬变在不同记录时间点的所有强度图。
注意：此时将生成两个独立的 avi 文件，分别对应 Vm 和 Ca 信号的传播。
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结果
培养的融合单层细胞表现出规律的固有节律，如视频1所示。随后，我们在完全融合的HL-1单层细胞中进行了Vm/Ca双通道光学标测。图1A展示了记录一次搏动中Vm和Ca信号的示例轨迹。利用双通道光学标测系统获得的均匀传播的Vm和Ca信号的代表性等时图分别显示在图1B和图1C中。从同一HL-1细胞单层培养物中获取了均匀传播的动作电位和钙瞬变的代表性时序图像。最后，视频2和视频3分别提供了HL-1融合单层细胞中均匀传播的动作电位（视频2）和钙瞬变（视频3）的动画示例。
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讨论
本文介绍了在经钙离子和电压敏感性荧光染料染色的培养HL-1心房肌细胞单层中进行光学标测的关键步骤。内容包括培养高质量的HL-1细胞单层、光学标测设备的设置、对培养的细胞单层进行光学标测，以及数据的分析方法。
要成功进行培养细胞的光学标测，关键在于制备均匀分布的单层细胞。将细胞接种到盖玻片上时，务必确保细胞均匀分散。应始终对完全生长且完全融合的单层细胞进行标测，因为这类细胞对电刺激起搏的反应最佳。在加载染料时，保持细胞充分供氧也很重要，但氧气气泡不应直接接触细胞，以免导致细胞死亡或从盖玻片上脱落。降低染料浓度和减少光照强度会减弱信号幅度并降低信噪比，而提高染料浓度和增强光照强度则会增加信号幅度，但同时也会增加噪声。因此，必须确定荧光染料浓度与激发光强度之间的最佳平衡，以提高记录信号的信噪比。此外，在光学标测记录过程中，应避免让单层细胞长时间暴露于高强度光照下，以防光照区域发生光动力学细胞损伤。最后，为获得高质量的数据，需要使用能够提供高时间分辨率和高空间分辨率的光学标测系统。
尽管完整心脏中的双通道光学标测技术因其能够同时采集电...
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致谢
我们感谢Claycomb博士提供了HL-1细胞及其详细的培养方案。同时感谢Elena Carrillo女士和Seth Robia博士在生成细胞影像方面的帮助，以及Pete Caron先生在制作双通道光学标测系统部分配件方面提供的协助。
本研究由美国心脏协会（10GRNT3770030 ＆ 12GRNT12050478，资助对象：XA）、美国国立卫生研究院（HL113640，资助对象：XA）以及洛约拉大学研究发展基金（资助对象：XA）提供支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Rhod2 干粉 | AAT Bioquest | 21062 | |
| 普鲁尼克酸 | AAT Bioquest | 20050 | |
| DMSO | Sigma | 276855 | |
| Rh237 | Invitrogen | S-1109 | |
| NaCl | Sigma | S7653 | |
| KCl | Sigma | P3911 | |
| KH2PO4 | Sigma | P0662 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S9638 | |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | |
| D-葡萄糖 | Sigma | G8270 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | |
| CaCl2 | Sigma | C3881 | |
| HEPES | Sigma | H3375 |
参考文献
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