本文介绍了一种对骨髓组织学数据进行定量分析的策略。通过对组织切片中荧光标记细胞进行共聚焦显微镜成像，获得二维图像，并对其进行自动分析。通过将不同细胞类型的共定位分析结果与模拟图像数据进行比较，可获得有关细胞间相互作用的定量信息。
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本文内容
摘要
摘要
共聚焦显微镜是分析多种细胞类型在骨髓等复杂组织中定位的首选方法。然而，细胞定位的分析与定量较为困难，因为在许多情况下依赖于人工计数，从而可能引入评分者依赖性偏差，并降低评分者间的一致性。此外，当两种细胞的共定位是由随机分布所致还是反映了细胞间的偏好性关联时，往往难以判断，尤其是在不同细胞类型的出现频率差异较大的情况下。本文介绍了一种对骨髓中细胞共定位进行无偏定量的方法。该方案描述了用于获取包含骨髓的完整小鼠长骨组织切片的样本制备流程，以及染色步骤和高分辨率图像的采集方法。同时提供了一套分析流程，从在二维（2D）骨髓图像中识别造血与非造血细胞类型，到定量分析这些细胞之间的直接接触。该流程还包括邻域分析，以获取围绕特定细胞类型的细胞微环境信息。为了评估两种细胞类型的共定位是随机细胞分布的单纯结果，还是反映了细胞间的偏好性关联，采用了一种适用于检验造血细胞及基质细胞假设的模拟分析工具。该方法不仅限于骨髓研究，还可扩展至其他组织，以实现组织学数据的可重复、定量分析。
引言
由于显微技术（包括光学成像）的近期快速发展，免疫学家越来越能够对完整组织环境中的细胞进行分析。悬浮状态下单个细胞的表征是理解细胞和分子功能的一种重要且不可或缺的方法。然而，对细胞在其（微）解剖学环境中进行分析，对于理解在免疫应答发育等复杂过程中协同作用的不同细胞类型之间的相互作用至关重要。
尽管显微镜观察者从图像中获取定性信息相对容易，但对这些数据进行量化仍是一个挑战，部分原因在于该领域的分析方法落后于图像采集技术的发展。许多研究人员仍然依赖耗时的手动细胞计数方法来分析组织学图像，这不仅在不同评分者之间引入了偏差，也阻碍了其他研究团队的重复验证。通常情况下，一篇论文中仅选择一幅代表性图像来支持关于细胞定位或共定位的结论，使得读者难以判断此类事件的统计学意义。
结合图像数据的全部信息含量很少被充分利用这一事实，凸显了对组织学图像进行更无偏、更快速和更全面分析方法的需求。
骨髓是一种复杂的组织，在成年脊椎动物中作为造血器官承担着重要的生命功能。除了是造血细胞1,2的起源地并在B淋巴细胞发育过程中发挥重要作用3之外，骨髓还是启动免疫反应的场所4，并支持成熟的、再循环的B细胞存活5。此外，在过去十年中，骨髓在维持免疫记忆方面的作用日益受到重视，因为已发现多种构成免疫记忆的细胞类型定位于此....
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方案
动物实验已获得相应的州级动物福利委员会（柏林健康与社会事务局）批准，并依照现行指南和规定进行（动物实验许可证 G0194/11）。
1. 荧光骨髓嵌合小鼠的制备
注意：用于观察骨髓基质细胞的荧光骨髓嵌合小鼠的制备方法如前所述9。
- 开始处理 Del-Cre x ROSA-tdRFP 小鼠（该小鼠普遍表达串联红色荧光蛋白（tdRFP）11-13），以准备进行辐照。或者，也可使用任何其他普遍表达荧光蛋白的小鼠品系。在辐照前两天，通过饮用水给予小鼠 1 mg/ml 新霉素和 1 mg/ml 维生素（A、D3、E、C）。
- 使用铯-137 γ射线辐照仪，在 3 小时间隔内对小鼠进行两次 3.8 Gray 的辐照。操作时，将小鼠放入适用于相应辐照仪的辐照用扇形笼中。
注意： 本研究所对小鼠辐照无需麻醉。 请遵循所在机构关于辐照过程中是否使用麻醉的政策。 若小鼠出现疼痛迹象，应在辐照后每天皮下注射 5 mg/kg 卡洛芬。 - 次日，通过静脉注射将来自 C57BL/6 供体小鼠长骨的 3 × 106 个骨髓细胞悬浮于转移缓冲液9中，以重建小鼠造血系统。继续给予新霉素和维生素达两周，并在此期间监测小鼠的健康状况和体重变化。在开始特定实验处理（....
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结果
采用Kawamoto胶带法切割未脱钙骨的冷冻切片，可将整块骨以完整切片的形式进行切取，骨髓腔内壁区域的骨髓仍附着于矿化骨组织上，无论是在骨干区域还是在富含小梁骨的骨骺区域均能保持完整（图1）。切片的核染色显示，尽管制备过程中难以完全避免出现微小裂纹，但窦状隙、动脉结构以及实质的网状网络均得以完整保留。
以红色荧光嵌合骨髓的免疫荧光染色及其后续分析为例，展示了嗜酸性粒细胞（主要碱性蛋白，MBP）、浆细胞（κ和λ轻链）以及B细胞（B220）的染色结果。小鼠在重建后4周通过腹腔注射含100 µg 4-羟基-3-硝基苯乙酰半抗原偶联鸡γ球蛋白（NP-CGG）的铝佐剂疫苗进行免疫，21天后经尾静脉加强注射50 µg NP-CGG的PBS溶液，并在加强免疫后第30天进行分析。自动图像分析能够非常精确地识别基质结构，包括网状突起的微小片段。由于本系统无法确定基质细胞的数量（另见讨论部分），因此未对基质通道设置大小阈值，以确保图像中所有片段均能被检测到（图2）。浆细胞和嗜酸性粒细胞比B细胞更大，且形态更具异质性。这三种细胞类型在初.......
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讨论
尽管现代光学成像技术已取得进展，但组织学数据的分析仍常受限于缺乏适当的定量工具和方法，或受限于仅关注小范围感兴趣区域的有偏分析。本文介绍的协同方法结合了覆盖整个骨髓区域的图像分析、多种造血和基质细胞类型的自动分割与对象识别、共定位分析，最后通过一款新设计的定制模拟软件提供非随机接触事件的验证工具。
由于骨组织中存在多种不同的组织密度，对包含骨髓在内的完整骨骼进行组织学切片一直较为困难——一方面为非常坚硬的矿化骨组织，另一方面则是极为脆弱的骨髓，后者在与骨骼共同切片时极易遭到破坏。作为一种替代方法，本文所介绍的胶带辅助骨骼切片法14,15具有稳定组织的优势，从而可保持骨内膜区域的完整性（图1）。这些区域不仅富含成骨细胞，还被认为在干细胞维持中发挥一定作用20。
基质细胞在发育过程及骨髓细胞维持中的关键作用正变得日益明确。然而，由于以下两个原因，对这些稀有且脆弱的细胞进行分析已被证明是困难的：首先，它们难以从骨髓中分离；其次，基质细胞群体内部的异质性程度.......
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披露
Juan Escribano Navarro 隶属于德国慕尼黑的 Wimasis GmbH。其他作者声明无利益冲突。
致谢
我们感谢Andreas Radbruch的宝贵讨论。感谢Sabine Gruczek、Patrick Thiemann和Manuela Ohde在动物护理方面的协助，以及Robert Günther提供的出色技术支持。感谢我们培训过的评分员Laura Oehme、Jannike Bayat-Sarmadi、Karolin Pollok、Katrin Roth、Florence Pache和Katharina Horn对组织学样本的评估，以及Randy Lindquist对稿件的校对。我们感谢美国亚利桑那州斯科茨代尔梅奥诊所（Mayo Clinic）的J.和N. Lee提供的MBP特异性抗体。
本工作由德国研究基金会（DFG HA5354/4-1）、DFG 活体显微成像核心设施网络资助项目 JIMI、TRR130/TP17 以及 DFG FOR 2165（HA5354/6-1）资助，资助对象为 A.E.H。S.Z. 获得柏林传染病与免疫学国际马普研究生院（IMPRS-IDI）的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 新霉素 |  Sigma | N6386 SIGMA | 新霉素三硫酸盐水合物，欧盟危险品代码：GHS08 |
| Ursovit AD3EC | Serumwerke Bernburg | 每1 ml含有：50,000 I.E. 棕榈酸视黄酯、5,000 I.E. 胆钙化醇、30 mg 醋酸生育酚、100 mg 抗坏血酸、1 mg 山梨酸、200 mg 聚氧35蓖麻油、0.5 mg 没食子酸丙酯 | |
| 转移缓冲液（100 ml PBS，1 ml 1 M HEPES，50 U/ml 青霉素/链霉素） | Sigma | P4333, H3375 | |
| 与鸡γ球蛋白偶联的4-羟基-3-硝基苯乙酰半抗原 | |||
| 鸡γ球蛋白（CGG）100 mg | Rockland | D602-0100 | |
| 20% 甲醛溶液（电镜级） | Science Services | 15713 | 欧盟危险品代码：GHS02, GHS05, GHS07, GHS08 |
| D(+)-蔗糖 | Carl Roth | 4621.1 | |
| 干冰 | |||
| 丙酮 | Sigma-Aldrich | 179124 SIGMA-ALDRICH | 欧盟危险品代码：GHS02, GHS07 |
| 己烷 | Sigma-Aldrich | 208752 SIGMA-ALDRICH | 欧盟危险品代码：GHS02, GHS07, GHS08, GHS09 |
| Tissue-Tek 冷冻模具（标准型） | Sakura | 4557 | 25 x 20 x 5 mm |
| Tissue-Tek O.C.T. | Sakura | 4583 | |
| Kawamoto 的 SCEM 包埋介质 | Section-Lab, JP | ||
| Kawamoto 的冷冻切片制备试剂盒 | Section-Lab, JP | ||
| Kawamoto 的 Cryofilm 2C(9)型 | Section-Lab, JP | ||
| 切片机刀片 MX35 premier plus，低剖面 | Thermo Scientific | 3052835 | 长 × 宽：80 x 8 mm (31.5 x 3.13")，厚度：0.25 mm (0.01") |
| 兔抗RFP多克隆抗体，生物素标记 | Rockland | 600-406-379 | |
| Alexa Fluor 555 链霉亲和素 | Life Technologies | S-32355 | |
| 大鼠抗MBP | J. and N. Lee | 可从以下地址获取：J. and N. Lee, Mayo Clinic, Scottsdale, AZ, 美国，克隆号 MT-14.7 | |
| 山羊抗大鼠-Alexa Fluor 647 | Life Technologies | A-21247 | |
| 大鼠抗B220 - Alexa Fluor 594 | 由本实验室（DRFZ）自行制备和偶联，克隆号 RA3.6B2，Alexa Fluor 594 来自 Life Technologies | ||
| 小鼠抗Ig轻链 - FITC | 由本实验室（DRFZ）自行制备和偶联，克隆号 LS136 | ||
| 大鼠抗κ轻链 - FITC | 由本实验室（DRFZ）自行制备和偶联，克隆号 187.1 | ||
| DAPI（4′,6-二脒基-2-苯基吲哚二盐酸盐） | Sigma | D9542 SIGMA | |
| 荧光封片介质 | DAKO | S3023 | |
| 盖玻片（24 x 24 x 0.13–0.16 mm） | Carl Roth | H875.2 | |
| Superfrost 载玻片（75 x 25 mm） | VWR | 48311-703 | |
| 激光扫描共聚焦显微镜 | 配备405、488、561、594、633 nm激光线和20X/0.8 NA空气物镜。我们使用的是蔡司LSM710显微镜及Zen 2010版本6.0软件。 | ||
| 骨髓自动图像分析工具 | Wimasis, 慕尼黑 | 细胞接触工具和细胞邻近工具可根据请求由Wimasis提供。 | |
| VC2012运行库 | Microsoft | 免费下载 | |
| 随机细胞定位模拟工具 | 可根据请求由我们提供 | ||
| 具备图像分割功能的图像分析软件 | 我们使用Volocity（Perkin Elmer）测量骨髓中造血细胞类型的细胞大小分布（图5）。其他可选软件包括Definiens图像分析（Definiens）或Cell Profiler（免费下载） | ||
| Fiji图像分析软件 | 免费下载。Fiji由经过培训的评分员用于手动细胞计数（图3）。 |
参考文献
- Kunisaki, Y., Frenette, P. S. The secrets of the bone marrow niche: Enigmatic niche brings challenge for HSC expansion. Nat Med. 18, 864-865 (2012).
- Morrison, S. J., Scadden, D. T. The bone marrow niche for haematopoietic stem cells. Nature. 505, 327-334 (2....
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