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环介导等温扩增（LAMP）检测法用于特异性检测感染鸡的Eimeria物种

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DOI：

10.3791/52552

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2015年2月20日

 ,  ,  , 
1Department of Pathology and Pathogen Biology, Royal Veterinary College, London, 2BIOPHARM, Research Institute of Biopharmacy and Veterinary Drugs

本文内容

摘要

鸡球虫（Eimeria）感染的诊断仍然具有挑战性。基于寄生虫形态学和宿主病理学的方法通常无法得出明确结论，而基于PCR的分子检测方法则在成本和专业技术方面要求较高。本实验方案旨在建立环介导等温扩增（LAMP）技术，作为一种简便的球虫感染分子诊断方法。

摘要

艾美球虫 物种寄生虫，即引起肠道疾病球虫病的原生动物，对鸡的生产和福利构成严重威胁。若缺乏有效的控制措施，临床球虫病可能造成毁灭性后果。鸡群对常用于防控球虫病的化学预防药物已普遍产生耐药性。 艾美球虫 很常见，亚临床感染广泛存在，会影响饲料转化率以及其他病原体（如 产气荚膜梭菌尽管已有基于聚合酶链式反应（PCR）的检测工具，但诊断仍存在困难。 艾美球虫 感染的诊断目前几乎完全依赖于传统的手段，如病变评分和卵囊形态学观察，但二者均存在操作困难。现有分子检测工具的局限性包括需要专业设备以及难以获取作为模板的DNA。为此，已开发出一种简易的现场DNA制备方案，以及一套针对七种物种的特异性环介导等温扩增（LAMP）检测方法 艾美球虫属 已知可感染鸡。本文现提供一份详细方案，描述从死后采集的肠道组织中提取基因组DNA的步骤，随后进行LAMP检测的建立与结果判读。 艾美球虫 物种特异性的LAMP可用于监测寄生虫的发生情况，评估农场抗球虫策略的有效性，并诊断亚临床感染或临床疾病，尤其在缺乏专业监测条件时具有重要价值。

引言

在过去50年中，全球鸡肉产量增长了十倍，其中发展中国家的增长规模接近发达国家的四倍(www.faostat.org)。随着鸡肉生产对全球粮食安全的重要性日益增加，可导致鸡严重疾病的病原体也受到越来越多关注。一个典型例子是艾美耳球虫属（Eimeria）物种，这是一类普遍存在的原生动物寄生虫，可引起肠道疾病球虫病1。只要有养鸡的地方，就很可能普遍存在一种或多种Eimeria物种2-4。在发达国家，主要通过化学预防来控制Eimeria感染，采用轮换用药或交替用药方案以最大限度减少耐药性的影响5。在鸡只价值足够高、能够负担疫苗成本的养殖体系中（例如，种鸡、蛋鸡以及部分肉鸡5），也会使用活疫苗。由于采取了这些防控措施，临床上的球虫病通常能得到较好控制，但亚临床感染仍较为常见5。在发展中国家，疫苗接种较为罕见，药物使用也往往缺乏科学指导。因此，亚临床和临床型球虫病更为普遍，并造成显著的经济损失3。

传统上，艾美耳球虫感染的诊断依赖于死后病变成分评分，尽管最广泛使用的评分系统的作者也指出，对于某些虫种，“似乎值得怀疑这种操作是否应在中度至重度感染以外的情况下进行”6。可通过在粪便或垫料样本中显微检测环境抗性较强的卵囊生命周期阶段来获取补充证据，但由于形态学重叠，除专家外通常难以准确鉴别6,7。利用聚合酶链式反应（PCR）、随机扩增多态性DNA PCR（RAPD-PCR）和定量PCR技术的分子检测方法已有近20年的应用历史8-10，但至今未能得到广泛应用。尽管传统的基于病理学和显微镜的方法通常具有主观性强和技术要求高的缺点，但分子方法因相对较高的成本以及需要专业实验室设备或处理流程，限制了其推广使用10,11。此类限制在世界许多较贫困地区（如东南亚）尤为突出，而球虫病对这些地区的贫困影响可能更为严重12。因此，迫切需要开发新型简便、敏感且具有成本效益的艾美耳虫（Eimeria）虫种特异性诊断检测方法。

环介导等温扩增（LAMP）是一种易于制备、由DNA聚合酶驱动的技术，能够扩增大量DNA。最重要的是，LAMP使用的是Bst DNA聚合酶，而非PCR中常用的Taq DNA聚合酶，这使得DNA扩增可在单一恒定温度下进行，无需热循环过程13,14。LAMP适用于最基础的实验室环境甚至野外现场。由于具有对多种PCR抑制剂相对耐受、高灵敏度和高特异性的特点，LAMP检测已广泛应用于多种病原体的检测，包括传染性法氏囊病病毒、Clostridium perfringens和Cryptosporidium15-17。为满足对新型经济高效的Eimeria物种特异性诊断方法的需求，研究人员已开发出一套针对感染鸡的七种Eimeria物种各自的LAMP检测方法18。这些新检测方法的应用包括监测寄生虫的发生情况，尤其在Eimeria maxima或Eimeria necatrix等与生产性能下降密切相关的物种中具有重要价值3,4。其他应用还包括评估农场抗球虫策略的有效性、诊断亚临床感染或临床疾病，以及评估Eimeria对农场构成的风险。

方案

1. 模板制备

注意：任何疑似含有源自七种之一的基因组DNA模板 艾美球虫 可感染鸡的物种可作为基于LAMP的模板 艾美球虫 物种鉴定。用于现场诊断分析的肠道组织样本应按照此处所述在常规尸体解剖过程中采集。

  1. 选择待检测的肠段（或多个肠段）。样本采集位点的选择可参考表1。 艾美球虫 最可能存在的物种18 和 图1 物种特异的分布范围及采样点位置。
    注意：这一点至关重要，因为 艾美球虫 具有明显的宿主部位特异性。每种感染鸡的物种均由其靶向的肠道区域所定义19。该决定可能受到农场既往经验以及对一个或多个特定方面的兴趣影响 艾美球虫 物种或其他诊断指标6.
  2. 切除选定用于检测的肠段，长度为5 cm或更长 艾美球虫 使用无菌剪刀或手术刀。可选择将样品置于固定剂（如RNAlater）中保存，以备后续分析18 或 95% 乙醇。
    注意：若在乙醇中保存，使用前应将样品用无菌三（羟甲基）氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）缓冲液彻底洗涤。
  3. 沿纵向切开样本，移除大部分肠内容物（如有），然后使用无菌玻璃载玻片边缘或经乙醇/火焰灭菌的剪刀刀片刮取黏膜层细胞。若为混合样本，可选择将该物种特异的四个肠段位点的细胞合并至同一管中。
  4. 将刮取的材料放入含有100 µl无菌TE缓冲液（含10% (w/v) Chelex 100树脂）的无菌1.5 ml螺口微量离心管中。
  5. 剧烈振荡每个样品1分钟。确保螺旋盖紧密闭合，然后在沸水浴中孵育10分钟。
  6. 煮沸后，让每个样品在室温下冷却1-2分钟。
  7. 使用微型离心机以最大转速离心每个样品（例如， ~10,000 × g，离心1分钟。
  8. 取2 µl上清液作为模板用于每项LAMP检测。可选地，将多个肠道部位样本混合于同一管中，以进行多部位联合检测。

2. Eimeria LAMP 引物制备（预实验）

  1. 准备足够进行 100 次检测的 Eimeria LAMP 引物储备液：
    1. 通过加入分子级水，将每种冻干的 Eimeria LAMP 引物重悬至 100 µM 的浓度（按制造商说明）。若未提供说明，则根据各引物的物理和分子量计算所需分子级水的体积。
    2. 为每种待检测的 Eimeria 物种，分别向一个 0.5 ml 翻盖微量离心管中加入 60 µl 分子级水。
    3. 按照表 2 所示体积，向水中加入针对目标 Eimeria 物种特异的 FIP、BIP、F3、B3、LF 和 LB 引物，制备出七种物种特异性的引物混合液。
    4. 短暂涡旋混匀引物溶液，然后瞬时离心，并在使用前冷冻保存。
  2. 为每种待检测的 Eimeria 物种配制 LAMP 反应主混合液。将表 3 中所示体积乘以样本数量，并额外增加三个反应量（用于阳性对照、阴性对照及加样余量）。将混合液加入 0.5 或 1.5 ml 翻盖微量离心管中。

3. Eimeria LAMP 检测

  1. 用移液器将 23 µl 球虫（Eimeria）物种特异性的 Bst DNA 聚合酶/LAMP 预混液加入到一个 0.5 ml 微量离心管中。
  2. 加入 2 µl DNA 模板（按第 1 节制备），最终反应体积为 25 µl。
  3. 在一个反应中加入 2 µl 球虫（Eimeria）物种特异性基因组 DNA（阳性对照）。在另一反应中加入 2 µl 分子生物学级水（阴性对照）。
    注意：若无物种特异性基因组 DNA，可改用先前获得的阳性 LAMP 或标准 PCR 产物。
  4. 在 62oC 水浴或加热块中孵育 30 分钟。若反应不立即读取结果，可选择在 80oC 加热 10 分钟以灭活 Bst DNA 聚合酶。

4. LAMP 检测结果读取

  1. 在室内光线下，肉眼观察每个反应在孵育结束后的颜色变化。阴性结果呈粉红色至紫色，阳性结果呈天蓝色20。
  2. 可选步骤：在实验室中通过将 5 µl LAMP 反应产物与 1 µl DNA 上样缓冲液混合，使用含 1× Tris/Borate/EDTA (TBE) 缓冲液的 2% 琼脂糖凝胶进行琼脂糖凝胶电泳，以确认 LAMP 检测结果。琼脂糖凝胶需预先加入核酸染料染色（每 50 ml 琼脂糖中加入 5 µl 染料）。在凝胶第 1 泳道中加入 5 µl 1Kb DNA 分子量标记物，以便计算片段大小。

结果

检测方法验证

在验证过程中，每种针对Eimeria物种特异性的LAMP检测均使用一组纯DNA样本进行测试，这些样本包含感染鸡的全部七种Eimeria物种的DNA，以及鸡基因组DNA作为宿主对照。通过琼脂糖凝胶电泳分析每项检测，结果显示对目标物种具有绝对特异性，且无宿主交叉反应18。随后，使用纯化的Eimeria tenella基因组DNA进行十倍系列稀释，发现该检测的灵敏度极限为1至10个基因组拷贝18。未观察到检测的上限，因为在最高浓度（100,000个基因组拷贝）下仍可获得阳性结果18。

野外样品的应用

用于 Eimeria 检测的样本通常来源于死亡鸡只、因健康状况不佳而被淘汰的鸡只，或用于哨点健康监测而被淘汰的鸡只，因此在常规操作中样本量可能为一至三只。在美国肉鸡场开展监测项目时采集的三只鸡共获得了三组肠道样本。针对每种 Eimeria 物种优先感染的肠道部位（表1），应用特异性环介导等温扩增（LAMP）检测方法，并以羟基萘酚蓝作为指示剂，可肉眼观察到所有被检鸡只均存在艾美耳球虫感染（图2A）。使用羟基萘酚蓝时，LAMP阴性反应的颜色可呈紫红色至粉红色，但始终与阳性结果产生的蓝色明显不同。通过琼脂糖凝胶电泳进行验证，结果具有一致性（图2B）。在实际现场应用中，操作者可选择对全部七种艾美耳球虫进行全覆盖检测，或仅针对被判定为重要物种或已知在该农场及周边地区流行的物种进行检测。

基于PCR的方法未能成为Eimeria检测的常规诊断手段，这凸显了任何新检测方法对简便性的需求。尽管LAMP技术相比PCR具有更简单的样本制备和操作流程，但每只禽类仍需检测多个肠道部位，这一要求仍令人望而却步。若能为每只禽类制备一份混合DNA样本，再用一种或多种LAMP检测方法进行分析，则更具吸引力。将每只禽类来自表1所述各个特定肠道部位的样本在DNA提取前混合，形成一份合并样本，并用全部七种LAMP检测方法进行检测，所得结果与对每个肠道部位单独处理时的结果一致（图2与图3对比）。

Bird digestive system diagram highlighting organs and sections including gizzard and cloaca anatomy.
图1. 用于LAMP检测的肠道采样位点 艾美球虫属 感染鸡的物种寄生虫。 每个目标肠道区域 艾美球虫属 物种由彩色线条标出，偏好的采样位点由黑色虚线之间的数字指示（E. acervulina黄色/1, E. brunetti粉红色/2 E. maxima蓝色/3， E. mitis橙色/4, E. necatrix红色/5， E. praecox：绿色/6 和 E. tenella：灰色/7 请点击此处以查看此图的放大版本。

三个鸡样本的DNA分析电泳凝胶结果，显示条带模式。
图2. 通过LAMP方法对三只商品肉鸡进行艾美耳球虫感染的诊断。 LAMP反应结果通过以下两种方式检测：（A）羟基萘酚蓝显色，天空蓝色为阳性反应，紫红色至粉红色为阴性反应；（B）琼脂糖凝胶电泳。所取肠道部位如表1中各寄生虫种类所示。A = E. acervulina，B = E. brunetti，Ma = E. maxima，Mi = E. mitis，N = E. necatrix，P = E. praecox，T = E. tenella。第1泳道为GeneRuler 1Kb DNA Marker。请点击此处查看该图的高清版本。

蛋白质电泳结果，七个样品，标记为鸡1-3、A-T，位于离心管中。
图3. 利用三个不同商业肉鸡的混合样品进行环介导等温扩增（LAMP）诊断球虫感染。 使用羟基萘酚蓝显色的LAMP反应结果，天蓝色反应为阳性，紫至粉红色反应为阴性。A = E. acervulina，B = E. brunetti，Ma = E. maxima，Mi = E. mitis，N = E. necatrix，P = E. praecox，T = E. tenella。请点击此处查看该图的放大版本。

样品位点Eimeria 种类检测（最可能）
十二指肠 (D)E. acervulina, E. praecox
空肠/回肠* (J/I)E. maxima, E. necatrix
盲肠 (C)E. necatrix, E. tenella
末端回肠 (TI)E. brunetti, E. mitis
混合样品 (P)E. acervulina, E. brunetti, E. maxima, E. mitis, E. necatrix, E. praecox, E. tenella

表1. 针对不同肠道区域选择候选艾美耳球虫物种的检测方法。 如图1所示，每种艾美耳球虫（Eimeria）物种的采样区域各不相同。混合样本指从四个特定部位采集的材料混合后用于DNA制备。

引物*储存浓度 (µM)体积 (µl)
水-60
内引物 正向 (FIP)10040
内引物 反向 (BIP)10040
外引物 正向 (F3)10010
外引物 反向 (B3)10010
环引物 正向 (LF)10020
环引物 反向 (LB)10020
总计200

表2. LAMP引物预混液的配制。 配制LAMP引物预混液所需的组分及比例。所示体积适用于100次LAMP反应。*引物名称见材料部分及Barkway et al (2011)18。

储存液浓度n反应终浓度n每反应体积(µl)
去离子水--10.1
ThermoPol 缓冲液10 x1 x2.5
MgSO4100 mM2 mM0.5
引物混合物*表 22.5
dNTPs25 mM400 uM0.4
甜菜碱5 M1 M5
羟基萘酚蓝3 mM120 µM1
Bst DNA 聚合酶8,000 U/ml8 U1
总计23

表3. LAMP反应预混液的配制。 *特异性针对Eimeria物种。

讨论

这 艾美球虫属 本文所述的物种特异性LAMP检测方法为球虫及球虫病的有效防控提供了一套新的诊断工具。艾美耳球虫感染可能导致严重的经济损失，同时严重影响禽类福利，并增加人畜共患病原体定植的易感性。21监测部分或全部禽群发生某些情况的机会 艾美球虫属 物种可作为球虫病防控效果下降的早期预警指标。LAMP技术的关键优势包括：由于需要针对六个不同的DNA序列区域，因而具有高度的靶标特异性；同时，通过引入环引物，进一步提高了检测的灵敏度。13，尽管LAMP的定性而非定量特性可能被视为一种局限性。目前尚无法区分低水平寄生虫逃逸常规化学预防或活疫苗复制与不受控制的艾美耳球虫复制。然而，该方案操作简便且结果明确，相较于现有依赖专业病理学和形态学判断、常具主观性的方法，已有显著改进6,7每次检测的成本约为～£每份样品成本为0.75，且不包含人工和设备设置费用。因此，LAMP检测比其他分子诊断方法（如PCR）更具成本效益，因其仅需等温孵育，无需专用设备。

多年来，由于难以获得作为模板的 Eimeria 基因组 DNA，分子现场诊断技术的开发与应用一直受到限制。卵囊是艾美耳虫生命周期中最易获取的阶段，但常规的 DNA 提取需要实验室设备22。其他更不稳定的肠道生命周期阶段在 DNA 制备前需经过纯化，以防止 PCR 抑制，避免导致检测灵敏度下降23,24。如今，仅需使用微型离心机和水浴锅，并结合Chelex树脂吸附抑制物，即可提取适用于环介导等温扩增（LAMP）的艾美耳虫DNA，且其质量达到要求，这促进了分子生物学在艾美耳虫诊断中的更广泛应用。值得注意的是，已有报道指出，在寄生虫感染开始后20天、即最后可检测到卵囊排出后的第11天，仍可在肠道组织中检测到可通过定量PCR测量的 Eimeria DNA，这提示LAMP技术可能不仅可用于检测正在进行的感染，还可用于检测已结束的寄生虫暴露，即使此时可见的病变可能已经消退25。

LAMP Eimeria 检测技术成本相对较低且技术要求不高，可在其他更成熟的方法不可用或不适用的发展中国家推广其应用。为确保其适用性，每种检测方法必须能够检出在各地区可能流行的全部毒株。尽管目前对Eimeria物种间普遍存在的遗传多样性的了解仍有限26，但采用此前已在非洲、亚洲、欧洲和南美洲毒株的定量PCR中验证有效的靶序列，已在一定程度上证明了这些序列的保守性，支持了此类LAMP检测方法在全球范围内的适用性10。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究的部分工作由皇家兽医学院通过学生研究项目基金，以及生物技术和生物科学研究理事会与国际发展部（资助编号 BB/H009337/2）提供支持。本稿件已被皇家兽医学院分配参考编号 PPB_00795。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RNAlaterAmbionAM7024
乙醇VWR Chemicals20821.321注意，高度易燃
100 × Tris-EDTA (TE) 缓冲液浓缩液Sigma-AldrichT9285
Chelex 100 树脂Bio-Rad142-1253
分子级水Invitrogen10977035
E. acervulina F3Sigma-AldrichVC00021*CCTAACATTTCGCTTCACGGAC
E. acervulina B3Sigma-AldrichVC00021*ATGAGCAAGTGGAACACCTTG
E. acervulina FIPSigma-AldrichVC00021*AGAGCACAGTGGCAGTGC-AGCAGACAGCATGGCTTACCT
E. acervulina BIPSigma-AldrichVC00021*GAAGACCCTCTGAAGAACGGA-CCTTCTCACCGCTTACCGG
E. acervulina LBSigma-AldrichVC00021*TAAGGTTACACCCGTGGAGG
E. acervulina LFSigma-AldrichVC00021*GCCATGCACAAAGCGACTT
E. brunetti F3Sigma-AldrichVC00021*GGCCATCAAGTTCCATGAGC
E. brunetti B3Sigma-AldrichVC00021*TCAACCTCCTGAGTGTGGTT
E. brunetti FIPSigma-AldrichVC00021*GAAAATGCCTTCGTAGCTGCT-GCTGGGTACGGAGCGTCTT
E. brunetti BIPSigma-AldrichVC00021*TACTTCCTAGGATCCATCCTCGC-AGTTTCGCTGCCGCCTC
E. brunetti LBSigma-AldrichVC00021*GAAACGCTCGAACATGGC
E. brunetti LFSigma-AldrichVC00021*CTTCTCCACAGACCCAGAGGT
E. maxima F3Sigma-AldrichVC00021*ACTACGGAAAAGTGCGTAGCT
E. maxima B3Sigma-AldrichVC00021*CCTTCCTCCCTTCTGAAAACTG
E. maxima FIPSigma-AldrichVC00021*GAGTCACTGCTGATGTACCAAA
AG-GAACTATGCCGCTTTCCCCTG
E. maxima BIPSigma-AldrichVC00021*AGAATGCGGATTTGTTAGCAGC-AGCAAGTCCAAGGTGTGTGTA
E. maxima LBSigma-AldrichVC00021*CAAGCCTACGCGGACATC
E. maxima LFSigma-AldrichVC00021*TTATGCAGCTGGGTCAACG
E. mitis F3Sigma-AldrichVC00021*ACGATAGCCAAGACACGTAAGG
E. mitis B3Sigma-AldrichVC00021*CCCCGTGATAAGAGTAGGAACA
E. mitis FIPSigma-AldrichVC00021*CGCGGGTCGTGAGATTTAAATT
AT-GGAAGATCAGGACGGGCACT
E. mitis BIPSigma-AldrichVC00021*GTTTCAGTTGATGAACAAGCGA
GA-TGCGCCTCTAGAATCAAGACG
E. mitis LBSigma-AldrichVC00021*TCCATGCATCCCCTTGTT
E. mitis LFSigma-AldrichVC00021*CGTGGGCACAGATTGATTC
E. necatrix F3Sigma-AldrichVC00021*TGGCTTTCCCGCGTACC
E. necatrix B3Sigma-AldrichVC00021*CGGCCCAACACAAAGACTG
E. necatrix FIPSigma-AldrichVC00021*CGCTTGAGTTTTAAGCTATGCA
CA-GACCCAAGCAGCTCACCAA
E. necatrix BIPSigma-AldrichVC00021*CGCCATGCCATTCAATGAACG-*GAGGCATACCGGCGTTGTC
E. necatrix LBSigma-AldrichVC00021*GTCTGTAACTTGGGACGTTGT
E. necatrix LFSigma-AldrichVC00021*GAACAGCCGGAGCCTCTC
E. praecox F3Sigma-AldrichVC00021*GCCCTTGTATGTTGCTGTTTCT
E. praecox B3Sigma-AldrichVC00021*GCGCACGAATCTGAATCACAC
E. praecox FIPSigma-AldrichVC00021*ATCTCCTCAAAGACTTTCGCGT
A-GCGCTTGGCTATATCCATAGG
E. praecox BIPSigma-AldrichVC00021*GCTCTCGTGGCATACTTGC-GCCAGGAGCCACTGATTGT
E. praecox LBSigma-AldrichVC00021*GAATAGCATTGCCAGGTGG
E. praecox LFSigma-AldrichVC00021*GTCCACTGTCATTAATATTGC
TGC
E. tenella F3Sigma-AldrichVC00021*GCTTGTGAAGGTCAGCGTG
E. tenella B3Sigma-AldrichVC00021*GCTGAGTCCATACGTACTTCCT
E. tenella FIPSigma-AldrichVC00021*GCCACTGCTATGGAAAGTCAC
AC-CATAACTGGCATGCAGGGGT
E. tenella BIPSigma-AldrichVC00021*GTTTGGCCCGAAAGTTGTGAA
GA-CGTCAGAAATTGCTGCCCAAT
E. tenella LBSigma-AldrichVC00021*CGCATGTGCAGTTGAAGACA
E. tenella LFSigma-AldrichVC00021*CCAAATGTATCTGCTAGTTATA
TTAACAAG
10 × ThermoPol 反应缓冲液New England BiolabsB9004S
MgSO4Sigma-AldrichM7506
dNTPsPromegaU1330
甜菜碱溶液 (5 M)Sigma-AldrichB0300
Bst 聚合酶New England BiolabsM0275S
羟基萘酚蓝Sigma-Aldrich33936溶于分子级水中。
UltraPure 琼脂糖Invitrogen16500-500
10 × Tris/硼酸/EDTA (TBE) 缓冲液InvitrogenAM9863
蓝色/橙色 DNA 上样染料 (×6)PromegaG1881
GeneRuler 1 Kb DNA 标准品Thermo ScientificSM0313
SafeView 核酸染料NBS BiologicalsNBS-SV

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环介导等温扩增（LAMP）检测法用于特异性检测感染鸡的Eimeria物种
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