增加肺动脉搏动性血流可改善仔猪低氧性肺动脉高压

摘要

肺动脉高压与肺动脉脉动性、收缩性和弹性的显著降低相关，这会导致肺动脉压力和肺血管阻力升高。本研究利用低氧幼猪模型证明，使用一种新开发的脉动导管改善肺动脉可塑性，可有效改善低氧性肺动脉高压。

摘要

肺动脉高压（PAH）是一种影响肺小动脉的疾病。这些动脉发生变形，导致右心室衰竭。目前的治疗方法有限。从生理学角度看，脉动性血流对血管系统有害。作为对持续脉动应力的响应，血管会释放一氧化氮（NO），以诱导血管舒张，实现自我保护。基于这一观察，本研究建立了一种实验方案，用于评估人工肺部脉动血流是否能够通过依赖一氧化氮的机制，降低肺动脉压力。一组幼猪暴露于慢性低氧环境持续3周，并与对照组幼猪进行比较。每周对幼猪进行一次超声心动图检查，以评估肺动脉高压的严重程度。在低氧暴露结束后，对幼猪实施使用脉动导管的脉动干预方案。在麻醉并完成手术准备后，在放射透视控制下，分离幼猪的颈静脉，并将导管经右心房、右心室插入肺动脉。在脉动干预前（T0）、干预后即刻（T1）以及干预后30分钟（T2）测量肺动脉压（PAP）。结果表明，该脉动干预方案是一种安全且有效的方法，可通过依赖一氧化氮的机制显著降低平均肺动脉压。这些数据为肺动脉高压的临床管理开辟了新的途径。

引言

肺动脉高压是一种影响肺血管系统的危及生命的疾病。该领域普遍认为，血管收缩因子（内皮素、5-羟色胺）增加与血管舒张因子（一氧化氮、前列环素）减少之间的失衡，促进了肺动脉高压的发生发展。随着时间推移，这种促收缩表型会演变为复杂的促增殖和抗凋亡表型，从而导致血管病变的形成¹。

长期暴露于血管收缩剂会导致肺动脉平滑肌细胞内钙离子浓度（[Ca²⁺]_i）显著且持续升高，从而激活多种钙调节的转录因子（如NFAT^2-4），促进肺动脉平滑肌细胞（PASMC）增殖并抵抗凋亡表型⁵。该表型可导致肺血管病变，增加肺动脉压力和肺血管阻力，最终引发致命性的右心衰竭⁶。

目前尚无能够逆转肺动脉高压（PAH）的治疗方法，尽管已有多种治疗手段可改善患者的生活质量⁷。在这些治疗方法中，吸入一氧化氮（NO）治疗的有效性已得到证实，但由于其半衰期较短，临床应用困难。因此，临床上更倾向于使用更稳定、持久的治疗方式，例如前列环素类似物或内皮素受体拮抗剂⁷。为了开发更有效的治疗方法，深入并拓展对PAH病理生理学的认识至关重要。

脉动性是已知可激活剪切应力诱导血管舒张的刺激因素，能够保护非弹性远端动脉免受高压血流损伤^8,9。在主动脉-肺动脉手术分流继发肺动脉高压（PAH）的模型中，Nour et al. 证明了肺内剪切应力介导的内皮功能增强¹⁰。多项研究表明，一氧化氮（NO）、前列环素和内皮素-1（ET-1）的表达受到脉动血流变化的密切调控。事实上，脉动血流适度增加可提高内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性和前列环素水平，而这两者在肺动脉高压中均降低。脉动血流的调节可能参与了肺动脉高压的发病机制，而人工增加脉动血流是一种有吸引力且新颖的方法，可促进肺循环中NO和前列环素的生成。

本研究旨在评估使用新开发的脉动式导管进行10 分钟脉动血流灌注，在低氧诱导的肺动脉高压（PH）幼猪模型中对血流动力学测量指标的影响。研究假设增加肺动脉的脉动性可诱导肺动脉血管舒张，从而降低肺动脉压力。

右心导管检查（RHC）是诊断和随访肺动脉高压（PAH）患者的关键临床干预手段。事实上，这是诊断PAH最可靠的方法，可使医生评估血管反应性^11,12以及疾病进展。实际上，每位PAH患者都会接受多次RHC检查。本研究在大型动物中开展，旨在证明在常规RHC操作过程中，脉动导管在评估和治疗PAH方面的有效性和安全性。由于脉动导管已可获得，且RHC在PAH患者中已常规开展，本研究提供了快速开展临床试验所需的全部信息。

方案

注意：本研究已获得伦理委员会编号 CEEA34.PB.103.12 的批准。

1. 猪仔作为动物模型的应用

1. 将动物分为两组（每组 n = 6），在性别、年龄（15 ± 3 个月）和体重（30 ± 10 kg）上相匹配（对照组和慢性低氧（CH）组）。将 CH 组置于低气压舱（0.4 atm）中饲养 3 周，对照组置于正常常压（1 atm）条件下饲养。
2. 使用一个由聚甲基丙烯酸甲酯（Plexiglas）制成的低压舱，其底面积为2平方米，高度为1.6米，如图所示。 图1.
3. 持续监测并维持温度为 18 °C、压力为 0.4 atm。通过真空泵确保充分通风，使空气更新速率达到 8 m³ 每小时
4. 将两只动物放入相应窝垫的舱室内。每48小时，将舱内压力恢复至常压条件半小时，在此期间于密闭舱室中对两只动物进行清洁，以防止其逃逸。该诱导肺动脉高压的方法已得到广泛验证。 ¹³.
5. 动物麻醉
   1. 用硫喷妥钠（10 mg/kg）静脉注射诱导仔猪麻醉，并通过持续吸入异氟烷（1.5%～3.5%）维持麻醉状态。向仔猪眼部滴加两滴卡波姆凝胶，以防止角膜干燥。
   2. 将动物置于左侧卧位，前肢屈曲并固定，以暴露胸部。先用肥皂和水清洁皮肤，再使用电动剃须刀剃除可能阻碍超声波穿透胸部的毛发。
6. 超声心动图
7. 通过超声心动图对肺动脉高压（PAH）的进展进行纵向、无创监测。使用3 MHz探头每周进行一次超声检查。通过将3个电极分别放置于右前爪、左前爪及胸部右侧来记录心电图。
8. 使用多普勒探头在三个不同切面（长轴、短轴和心尖）记录二维和M型成像数据。右手持探头，置于左侧第4与第5肋间，缓慢上下移动并左右旋转，直至获得不同心脏结构的清晰图像。即 室间隔）。声学窗口因动物而异，具体取决于心脏在胸腔内的位置。
9. 同时记录每次事件的ECG，持续至少10个心动周期，以便进行离线分析。舒张末期定义为心动周期中与ECG上Q波起始点相对应的时刻。收缩末期与T波起始点相对应。
10. 通过心尖切面多普勒超声测量二尖瓣和三尖瓣血流。将多普勒探头置于胸骨柄末端，取样区域位于瓣膜上方，以记录通过瓣膜的血流。
11. 通过多普勒血流测定法记录心动周期中的血流速度，以获取经二尖瓣和三尖瓣以及主动脉瓣和肺动脉瓣的血流速度-时间积分。使用超声仪的视频图形阵列，以每秒25帧的帧率存储图像，以获得超声仪提供的静态图像或序列图像。
12. 根据国际建议，使用测量仪器以及超声心动图设备内置软件所提出的表面积轮廓，测量心脏心腔的尺寸和表面积 ¹⁴.
13. 通过短轴切面的TM（时间-运动）记录，测量右心室在舒张期和收缩期的游离壁厚度 ¹⁴.
14. 在短轴切面中，于肺动脉瓣尖处测量肺动脉主干根部直径 ¹⁴.
15. 在心电图 Q 波起始处的舒张期和 T 波顶点处的收缩期，于纵向切面的 M 型运动中测量左心室室间隔和后壁的厚度。 ¹⁴.
16. 测量左心室舒张末期内径（LVEDD）和左心室收缩末期内径（LVESD）。采用公式 FS (%) = (LVEDD - LVESD) / LVEDD 计算缩短分数（FS）。测量主动脉直径以及右心房和左心房的表面积。
17. 根据二尖瓣和三尖瓣血流的流速-时间积分，测量以下指标：E波和A波的最大振幅、E波减速时间半值、血流持续时间、流速-时间指数 ¹⁴.
18. 根据肺动脉的多普勒测量结果，测量以下参数：最大流速、上升半时间、血流持续时间及其积分 ¹⁴.
19. 使用辛普森法评估左心室容积 ¹⁵ 方法
20. 将每只仔猪的数据存储在数据库中，以便后续对整个群体进行统计分析。

2. 右心导管检查

1. 动物准备
   1. 在放置脉动导管之前，将猪置于低压舱中3周，以诱导肺动脉高压。
   2. 术前禁食24小时（固体食物禁食24小时，水禁食8至12小时）。
   3. 右心导管检查（RHC）前24小时，由经验丰富的兽医进行麻醉前临床检查，评估黏膜颜色、毛细血管再充盈时间、使用听诊器检查肺部和心脏的整体功能，以及使用直肠温度计测量体温。
   4. 在麻醉诱导前15至30分钟 ，肌肉注射咪达唑仑（0.5 mg/kg）和盐酸吗啡（0.1 mg/kg）。在诱导期间每4至6小时重复注射一次盐酸吗啡（0.05至0.5 mg/kg，肌肉注射）。
   5. 通过静脉注射硫喷妥钠（10 mg/kg），先以5 mg/kg剂量进行初始推注，随后分次部分注射直至起效。之后通过面罩手动通气，直至完成气管插管。
   6. 仔猪插管
      1. 用普莫卡因凝胶润滑导管。将金属导丝插入导管内以增加其硬度，便于插管操作。
      2. 轻触眼睑以确认深度麻醉。使用喉镜抬高舌头，直视声门进行插管，避免损伤声带。充盈导管气囊以防止反流相关问题。
   7. 控制呼吸频率为每分钟10–12次；潮气量为7–10 ml/kg，通气压力为25至30 cm H₂O，吸气相持续2秒，呼气末正压为5 cm H₂O。
   8. 使用异氟烷在100%氧气中进行麻醉（诱导浓度3–5%，氧流量2–3 L/min；维持浓度1.5–2.5%，氧流量1 L/min）。参照步骤1.5.1，在角膜上涂抹卡波普凝胶。
   9. 通过皮下输注方式，将肝素化导管插入尾侧耳动脉（5 ml含5,000 IU/ml肝素的0.9%生理盐水），使用绿色套管并以缝线固定。
   10. 输注乳酸林格液（10–20 ml/kg/hr）。
   11. 将动物置于略微倾斜的检查台上，头部稍向下倾斜，以促进唾液引流。
2. 监测
   1. 每5分钟检查并记录个体麻醉病例报告中的以下指标：黏膜颜色和毛细血管再充盈时间、下颌肌肉张力和眼球位置、瞳孔缩小/散大、眼睑反射。
   2. 持续监测心率和呼吸频率、脉搏血氧饱和度、体温和心电图。将动脉导入器插入股动脉，再插入一根口径较大的10 cm长导管至股动脉，用于监测体循环血压。
3. 脉动导管的设置
   注：该医疗器械由两根并列焊接的导管组成。第一根导管远端连接一个标准球囊，直径为20 mm，最大容积为5 ml。第二根导管用于插入导丝，以辅助导管在肺动脉内的定位。该装置全长750 mm，内径为0.035，外径为12 Fr。
   1. 实验中使用小型Harvard 683动物呼吸机进行脉动，该呼吸机在球囊放气时施加主动负压，在充气时施加正压，每次脉动体积为2.5 ml。使用氦气作为球囊泵的驱动气体，以防止气体栓塞。
   2. 持续记录体表心电图，以监测实验过程中可能出现的心律失常。在左侧股动脉连接传感器装置至20 G导管，并接入血流动力学监测系统。
4. 右心导管检查
   1. 清洗并剃除动物颈部毛发。使用纱布蘸取皮肤消毒液（聚维酮碘 scrub）清洁皮肤。为界定手术区域，在右肩与胸骨柄之间的右侧颈静脉周围铺设无菌巾。
   2. 使用无菌剪刀在右肩与胸骨柄中点处做一条4 cm长的纵向切口。
   3. 用镊子小心分离皮肤和肌肉层，然后轻柔剥离静脉周围约5 cm长度的结缔组织。夹闭远端以防止出血。在近端放置一根结扎线，以便在静脉半切后控制血管开口。
   4. 使用特制的小型锋利凿刀横向将静脉切开一半。确保切口边缘整齐。使用薄泡沫垫起切口一侧边缘，轻柔地将导管推入静脉近端。用结扎线控制出血。
   5. 将导管插入颈静脉，并依次通过上腔静脉、右心房、右心室，最终进入肺动脉。
   6. 在每个心腔及肺动脉内，记录10个稳定心动周期的压力（T0）。每隔1分钟测量心输出量三次。
   7. 在X线透视引导下将球囊导管定位至肺动脉。用1 cm³氦气对球囊进行充气和放气（脉动），持续脉动10分钟。在每个心腔及肺动脉内记录10个稳定心动周期的压力，并在10分钟后（T1）测量心输出量。
   8. 在脉动干预方案结束后30分钟再次测量心输出量（T2）。

3. 一氧化氮检测

1. 将道格拉斯袋连接至呼出气体出口管，直至其完全充满。然后将其放置在NO呼吸分析仪的进气管上。
2. 通过缓慢且持续地挤压有弹性的道格拉斯袋，将呼出的气体压入分析仪中。利用分析仪的流量计监测袋内气体流出量，以保持恒定的气流速度。

4. 组织学测量

1. 在麻醉状态下，将 30 ml 的 Dolethal（安乐死用注射液）注入心脏内留置的搏动性导管中。
2. 安乐死后立即用锯子纵向锯开胸骨，轻微移动心脏并固定右肺。然后使用解剖剪刀从肺中叶切取两块 2 或 3 cm³ 的组织样本。
3. 将其中一个样本在液氮中速冻后于 -80 °C 保存；将另一个样本用 3.7% 多聚甲醛固定 24 小时，随后包埋于石蜡中，用于后续组织学分析。
4. 组织学检测方法参照先前描述¹⁶。肺动脉壁厚度测量方法如下：每只幼猪检测 10 条动脉，每条动脉测量 2 次，每组共 6 只幼猪。
5. 进行统计学分析。数据以均值 ± 标准误（SEM）表示的倍数变化表示。
   1. 比较两组均值时采用非配对 Student t 检验；比较多组均值时采用单因素方差分析（one-way ANOVA），随后进行 Dunn 检验。当 p <0.05 时认为差异具有统计学显著性（*）。

结果

增加肺动脉脉动血流可改善仔猪缺氧性肺动脉高压

在将动物暴露于脉动血流增加之前，采用无创超声检查确认仔猪是否已形成肺动脉高压。如图所示 图2，三周的慢性缺氧在仔猪中诱导了肺动脉高压的发生，表现为肺动脉加速时间显著缩短（多普勒法）以及右心室肥厚增加（M型超声心动图）。在右心导管检查（RHC）过程中，对右心室收缩压（RVSP）和平均肺动脉压的有创测量结果均证实，与对照组仔猪相比，慢性缺氧仔猪存在肺动脉高压（数值为T0时）（图3）。右心室舒张压在对照组为-3 ± 1 mmHg，在肺动脉高压组为-2 ± 1 mmHg；两组的房压均为-4 ± 2 mmHg。体循环压力为106 ± 13 与 对照组为 95 ± 18 mmHg 与 PAH 组。肺动脉高压还通过组织学切片上血管重塑的定量分析得到证实。为了评估脉动血流对肺动脉高压可能的治疗作用，使用脉动导管产生人工脉动肺血流，持续 10 min。如图所示 图3 10分钟的脉动血流增加导致右心室收缩压（RVSP）和...

讨论

首次发现，肺部脉动血流的变化与慢性缺氧暴露继发的肺动脉高压（PAH）的发生存在因果关系。这种转化医学方法表明，使用专门设计的导管人为增加肺部脉动血流可改善肺动脉高压，其机制可能是通过增加一氧化氮（NO）的生成实现的。

这些发现不仅具有原创性，而且具有重要的治疗意义，表明在肺循环中可以通过机械方式安全地刺激内源性一氧化氮（NO）的产生，同时不影响全身功能。该研究设计符合肺动脉高压领域最新的临床前研究建议，该建议最近提出在将新方法应用于临床之前，应先在大型动物身上进行测试。这些发现的转化潜力非常高。

然而，肺动脉高压（PAH）的病理生理机制并非单一。PAH 的分类将其分为五个不同组别。第三组代表由慢性缺氧引起的中膜肥厚。尽管该模型可归入此组，但并不能完全模拟人类的 PAH。人类由慢性缺氧继发的 PAH 主要与慢性支气管炎相关，其支气管和肺实质的病变可导致外周肺循环至体循环的分流。这些分流通过与该模型不同的机制引起低氧血症。因此，该模型更接近于高海拔生活状态，而非肺部疾病。然而，该模型的心脏血流动力学与人类相近：心率相同、心输出量相...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
麻醉药物
硫喷妥钠，THIOPENTAL SODIUM	Abbott, 法国	0000071-73-8	粉末 3 place Gustave Eiffe 94518 RUNGIS CEDEX.
异氟烷，FORANE	Abbott, 法国	05260-05	玻璃瓶装 250 ml 3 place Gustave Eiffe 94518 RUNGIS CEDEX.
咪达唑仑，Hypnovel	Accord Healthcare	Vidal	注射用安瓿 1mg/ml 45 Rue du Faubourg de Roubaix 59000 里尔 法国
普莫卡因，TRONOTHANE 1%	Laboratoires LISAPHARM	Vidal	局部应用凝胶 T/30g 3, rue Scheffer. 75016 巴黎.
盐酸吗啡 Lavoisier	CMD Lavoisier Laboratoires CHAIX et DU MARAIS	Vidal	注射用安瓿  7, rue Labie -75017 巴黎 - 法国
丙烯酸酯共聚物-Carbopol® Aqua SF-1 聚合物	Lubrizol		局部应用凝胶 Elysées La Défense 19 le Parvis 92073 巴黎 la défense
材料
哈佛呼吸机 683	Harvard apparatus	Harvard apparatus	DRIM 75 rue des Anglais - 78700 Conflans Ste Honorine
配备 3.5 MHz 探头的 Voluson E8 超声仪	通用电气	GEHealthcare	DRIM 75 rue des Anglais - 78700 Conflans Ste Honorine
Pulsatil 导管	Cardio inovating system		Cardio innovative systems, 33 rue Vivienne, 巴黎, 法国 75002
一氧化氮呼吸分析仪	Respur	Respur	26 rue Felix Rouget 95490 Vaureal 法国