自噬分析 Penicillium chrysogenum 通过使用饥饿垫结合荧光显微镜技术

摘要

一种研究自噬的便捷而强大的方法 Penicillium chrysogenum 通过使用饥饿垫（载玻片中央凹槽内含有琼脂糖与自来水混合物）的方法在此介绍。

摘要

细胞质量控制系统的研究已成为当前极具活力且重要的研究领域。研究表明，细胞具备多种防御机制，可抵御对生物大分子（如核酸、脂质和蛋白质）造成的损伤。除了细胞器动态（融合/分裂/运动/遗传）和严格调控的蛋白酶活性外，通过自噬（细胞“自我消化”）降解多余、受损或功能异常的细胞器也受到科学界的广泛关注。自噬的调控机制十分复杂，依赖于遗传和环境因素，其中许多因素至今尚未阐明。本文介绍一种新方法，可方便地在丝状真菌Penicillium chrysogenum中研究自噬过程。该方法基于将真菌培养在所谓的“饥饿垫”上，以可重复的方式诱导自噬。样品可直接通过显微镜检测，并用于评估自噬的诱导程度与进程。本文所述方案不仅限于P. chrysogenum，也可轻松适用于其他丝状真菌。

引言

丝状真菌是研究发育过程的优良模式系统。它们具有多种实验优势，例如培养成本低、后代数量多以及遗传操作便利。最后一点对于构建转化子尤为重要，可用来研究迄今尚未表征的基因在各种细胞机制中的重要性。丝状真菌在阐明多种细胞质量控制通路的组分和机制方面发挥了关键作用，例如蛋白酶活性在异常蛋白质降解中的作用、线粒体动态变化在维持线粒体完整性中的作用，以及自噬在清除多余和/或功能障碍的细胞组分以及在饥饿条件下维持细胞活力中的作用^1,2,3。

目前有多种实验技术可用于研究丝状真菌中的自噬作用²：(i) 在蛋白酶被抑制的条件下，通过透射电子显微镜观察液泡内是否含有致密的自噬小体⁴；(ii) 通过荧光显微镜监测GFP-Atg8焦点以可视化自噬体^5,6；以及(iii) 使用荧光染料单丹磺酰尸胺检测酸化的自噬体结构⁷。

此处介绍一种新型的培养方法 Penicillium chrysogenum 用于自噬研究的方法被提出。主要组成部分是“饥饿垫”，其仅由1%琼脂糖溶解于无菌自来水中构成。可添加其他化合物（例如， 胁迫剂、清除剂、自噬调节剂）可添加至垫片中，前提是这些物质不产生自发荧光。该垫片置于含有浅层中央凹腔的显微镜载玻片中。可通过孢子悬浮液或小型菌丝片段对垫片进行接种。若目标菌株产孢效率较低，建议采用....

方案

1. 青霉菌（P. chrysogenum）饥饿实验前的准备

1. 若目标 P. chrysogenum 菌株保存在大米培养基（“绿色大米”）上，取2-3粒覆盖有产孢菌丝的大米放入1.5 ml 微量离心管中，加入500 µl YGG培养基（10 g/l KCl，20 g/l 葡萄糖，10 g/l 酵母氮源基础，5 g/l K₂HPO₄，20 g/l 酵母提取物）。
   1. 涡旋振荡管子30秒，使孢子有效从大米上脱落。
   2. 在室温下（例如，20–25 °C）孵育1天。
   3. 用无菌自来水将该孢子悬液稀释至1/50，充分混匀。
2. 若目标 P. chrysogenum 菌株保存在琼脂平板上（例如，YGG琼脂平板），使用无菌牙签或移液器吸头取少量菌丝碎片，转移至含有400 µl无菌自来水和约100 mg玻璃珠的1.5 ml微量离心管中。
   1. 涡旋振荡管子2分钟，使菌丝充分破碎。立即使用管内混合物。

2. 在饥饿垫上培养P. chrysogenum的预备步骤

1. 打开加热板并将温度设置为约 60 °C。
2. 将2 g琼脂糖溶于1....

结果

为了验证上述方案的实用性，分析了 P. chrysogenum 菌株 Ws54-1255 (GFP-SKL) 中的过氧化物酶体降解过程。在该菌株中，GFP-SKL 通常会被导入过氧化物酶体⁹。当通过荧光显微镜观察样品时，会呈现出多个球形结构。如果发生自噬，液泡会增大。GFP-SKL 通过自噬（即过氧化物酶体自噬，pexophagy）被包裹进入液泡中。由于 GFP 对液泡蛋白酶的降解具有抗性，因此可标记这些细胞器¹⁰。因此，在该菌株中观察自噬（过氧化物酶体自噬）的两个参数——液泡增大和 GFP-SKL 定位于液泡——可通过荧光显微镜方便地进行监测。

在培养20小时时，从未在液泡中观察到GFP信号（图1），且液泡未出现膨大现象。然而，在培养40小时后，部分菌丝中开始出现GFP标记的液泡，表明自噬（过氧化物酶体自噬，pexophagy）已被激活（图1）。在培养60小时后，GFP标记的液泡数量进一步增加。作为阴性对照，使用了产黄青霉（P. chrysog.......

讨论

本文所介绍的方法可方便、可重复地研究P. chrysogenum中的自噬作用。例如，该方法可用于筛选各种化合物是否能够调节该真菌自噬反应的效果。雷帕霉素的实验结果表明，抑制TOR信号通路可显著诱导P. chrysogenum中的自噬作用，这一现象在其他生物中也已有报道¹¹。

可以利用在饥饿垫上生长的菌丝，用于更精密显微镜的分析例如，共聚焦激光扫描显微镜）。样品置于物镜下方或物镜上方（倒置显微镜）均无影响。可利用靶向特定区室的各种荧光蛋白来监测自噬过程中不同细胞器的命运（例如， 线粒体> 线粒体自噬；内质网> 内质网自噬， 等等综上所述，本文所述技术扩展了用于显微研究真菌的方法范围。 ¹².

该实验方案通常简单明了且易于操作。然而，必须特别注意饥饿平板绝不能干燥，否则将导致人为假象及细胞死亡。因此强烈建议：（i）在加热板上制备仍处于液态的琼脂糖溶液后，应立即将载玻片从加热板上取下（.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带中央腔的显微镜载玻片	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	清洁后可多次使用。
玻璃珠	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	直径：0.25 - 0.50 mm