自噬分析 Penicillium chrysogenum 通过使用饥饿垫结合荧光显微镜技术

摘要

一种研究自噬的便捷而强大的方法 Penicillium chrysogenum 通过使用饥饿垫（载玻片中央凹槽内含有琼脂糖与自来水混合物）的方法在此介绍。

摘要

细胞质量控制系统的研究已成为当前极具活力且重要的研究领域。研究表明，细胞具备多种防御机制，可抵御对生物大分子（如核酸、脂质和蛋白质）造成的损伤。除了细胞器动态（融合/分裂/运动/遗传）和严格调控的蛋白酶活性外，通过自噬（细胞“自我消化”）降解多余、受损或功能异常的细胞器也受到科学界的广泛关注。自噬的调控机制十分复杂，依赖于遗传和环境因素，其中许多因素至今尚未阐明。本文介绍一种新方法，可方便地在丝状真菌Penicillium chrysogenum中研究自噬过程。该方法基于将真菌培养在所谓的“饥饿垫”上，以可重复的方式诱导自噬。样品可直接通过显微镜检测，并用于评估自噬的诱导程度与进程。本文所述方案不仅限于P. chrysogenum，也可轻松适用于其他丝状真菌。

引言

丝状真菌是研究发育过程的优良模式系统。它们具有多种实验优势，例如培养成本低、后代数量多以及遗传操作便利。最后一点对于构建转化子尤为重要，可用来研究迄今尚未表征的基因在各种细胞机制中的重要性。丝状真菌在阐明多种细胞质量控制通路的组分和机制方面发挥了关键作用，例如蛋白酶活性在异常蛋白质降解中的作用、线粒体动态变化在维持线粒体完整性中的作用，以及自噬在清除多余和/或功能障碍的细胞组分以及在饥饿条件下维持细胞活力中的作用^1,2,3。

目前有多种实验技术可用于研究丝状真菌中的自噬作用²：(i) 在蛋白酶被抑制的条件下，通过透射电子显微镜观察液泡内是否含有致密的自噬小体⁴；(ii) 通过荧光显微镜监测GFP-Atg8焦点以可视化自噬体^5,6；以及(iii) 使用荧光染料单丹磺酰尸胺检测酸化的自噬体结构⁷。

此处介绍一种新型的培养方法 Penicillium chrysogenum 用于自噬研究的方法被提出。主要组成部分是“饥饿垫”，其仅由1%琼脂糖溶解于无菌自来水中构成。可添加其他化合物（例如， 胁迫剂、清除剂、自噬调节剂）可添加至垫片中，前提是这些物质不产生自发荧光。该垫片置于含有浅层中央凹腔的显微镜载玻片中。可通过孢子悬浮液或小型菌丝片段对垫片进行接种。若目标菌株产孢效率较低，建议采用后者。例如， Δatg1 菌株 ⁸将载玻片置于湿盒中（可用空的移液枪头盒简易制作）以防止样品干燥，并在室温下孵育。 P. chrysogenum 在这些条件下能够生长数天。通过观察液泡增大可从显微镜下检测自噬现象，液泡增大是真菌自噬的阳性标志。本研究中，一种 P. chrysogenum 使用一种菌株（Wisconsin 54-1255），其表达的绿色荧光蛋白通过C末端的‘SKL’序列靶向过氧化物酶体 ⁹因此，可以监测过氧化物酶体的降解过程。也可以对细胞的其他区室进行标记（例如， 线粒体）通过使用适当的定位信号来分析其降解过程。尽管来自 P. chrysogenum Ws54-1255（GFP-SKL）在此展示，该“饥饿垫”方法也完全可用于其他丝状真菌例如， Neurospora crassa, Sordaria macrospora，曲霉属物种， 等等。).

方案

1. 青霉菌（P. chrysogenum）饥饿实验前的准备

1. 若目标 P. chrysogenum 菌株保存在大米培养基（“绿色大米”）上，取2-3粒覆盖有产孢菌丝的大米放入1.5 ml 微量离心管中，加入500 µl YGG培养基（10 g/l KCl，20 g/l 葡萄糖，10 g/l 酵母氮源基础，5 g/l K₂HPO₄，20 g/l 酵母提取物）。
   1. 涡旋振荡管子30秒，使孢子有效从大米上脱落。
   2. 在室温下（例如，20–25 °C）孵育1天。
   3. 用无菌自来水将该孢子悬液稀释至1/50，充分混匀。
2. 若目标 P. chrysogenum 菌株保存在琼脂平板上（例如，YGG琼脂平板），使用无菌牙签或移液器吸头取少量菌丝碎片，转移至含有400 µl无菌自来水和约100 mg玻璃珠的1.5 ml微量离心管中。
   1. 涡旋振荡管子2分钟，使菌丝充分破碎。立即使用管内混合物。

2. 在饥饿垫上培养P. chrysogenum的预备步骤

1. 打开加热板并将温度设置为约 60 °C。
2. 将2 g琼脂糖溶于100 ml自来水，放入微波炉中加热溶解。注意加热后溶液必须完全澄清；若未澄清，需再次加热直至琼脂糖完全溶解。将琼脂糖溶液冷却至约60 °C后使用。
3. 将1.5 ml微量离心管（2–4个，根据样本数量而定）各加入400 µl无菌自来水（不添加其他化合物）或400-x µl（在步骤2.5中加入x µl化合物溶液），然后置于加热板上至少1分钟，使管内液体变暖。
4. 将带有中央凹槽的载玻片置于加热板上，至少加热 1 min。
5. 向1.5 ml离心管中的溶液加入400 µl 2%琼脂糖，短暂涡旋混匀。此步骤之后，可根据需要添加其他化合物（即， 1 µM 雷帕霉素）。每次向管中加入新物质后，需短暂涡旋混匀。将离心管放回加热台，以防止过早凝固。
   注意：微量离心管中的总体积应为 800 µl。

3. 制备含饥饿垫的显微镜载玻片

1. 用移液器将140 µl琼脂糖溶液加入载玻片的凹槽中（载玻片仍置于加热板上）。尽量避免产生气泡。
2. 立即在琼脂糖溶液上放置盖玻片。
   注意：这将形成一个平整的表面。
3. 将载玻片放置在实验台面上约4分钟，使琼脂糖垫凝固。
4. 用拇指或食指轻轻滑动，小心地将盖玻片从琼脂糖垫上移除（佩戴手套以避免污染！）。
5. 将带有琼脂糖垫的载玻片放入湿盒中，以防止干燥。建议：使用一个空的枪头盒，盒内仍保留用于固定移液器枪头的插架。向盒内加入无菌水，使底部被覆盖。将载玻片放置在插架上，并盖上盒盖。

4. 用P. chrysogenum接种饥饿培养垫并进行培养

1. 若培养物生长在大米上，取5 µl 1/50稀释的孢子液；若培养物生长在琼脂平板上，则取5 µl未稀释的含有菌丝片段的溶液，将其滴加到饥饿培养垫的中央。
2. 盖上湿润培养盒，并用塑料袋包裹（以进一步防止饥饿培养垫干燥）。操作时需小心，避免过度移动盒子，否则会扰动接种液滴。
3. 将包裹好的盒子在室温下静置至少20小时，然后进行样品分析。

5. 样品的显微分析

1. 孵育 20 小时后，样品即可进行显微镜分析；将显微镜载玻片置于干燥的纸巾上（底部容易变湿）。
2. 用移液器吸取少量水（约 50 µl）滴加到饥饿培养垫上。将盖玻片盖在培养垫上，并挤出多余的水分。用纸巾吸除多余的水。
3. 将显微镜载玻片放置在荧光显微镜的观察台上。为全面观察菌丝体生长情况，使用 20X 物镜；为研究 GFP 在菌丝中的定位，使用 63X 或 100X 物镜。为防止样品逐渐干燥，每次观察时间不应超过 15 分钟，之后应立即将样品放回湿室中。
4. 定期重复步骤 5.3（例如，在培养 40 小时和 60 小时后）。
   注意：样品可重新放回湿室中。无需取下盖玻片，因其对菌丝体生长无影响。

结果

为了验证上述方案的实用性，分析了 P. chrysogenum 菌株 Ws54-1255 (GFP-SKL) 中的过氧化物酶体降解过程。在该菌株中，GFP-SKL 通常会被导入过氧化物酶体⁹。当通过荧光显微镜观察样品时，会呈现出多个球形结构。如果发生自噬，液泡会增大。GFP-SKL 通过自噬（即过氧化物酶体自噬，pexophagy）被包裹进入液泡中。由于 GFP 对液泡蛋白酶的降解具有抗性，因此可标记这些细胞器¹⁰。因此，在该菌株中观察自噬（过氧化物酶体自噬）的两个参数——液泡增大和 GFP-SKL 定位于液泡——可通过荧光显微镜方便地进行监测。

在培养20小时时，从未在液泡中观察到GFP信号（图1），且液泡未出现膨大现象。然而，在培养40小时后，部分菌丝中开始出现GFP标记的液泡，表明自噬（过氧化物酶体自噬，pexophagy）已被激活（图1）。在培养60小时后，GFP标记的液泡数量进一步增加。作为阴性对照，使用了产黄青霉（P. chrysog...

讨论

本文所介绍的方法可方便、可重复地研究P. chrysogenum中的自噬作用。例如，该方法可用于筛选各种化合物是否能够调节该真菌自噬反应的效果。雷帕霉素的实验结果表明，抑制TOR信号通路可显著诱导P. chrysogenum中的自噬作用，这一现象在其他生物中也已有报道¹¹。

可以利用在饥饿垫上生长的菌丝，用于更精密显微镜的分析例如，共聚焦激光扫描显微镜）。样品置于物镜下方或物镜上方（倒置显微镜）均无影响。可利用靶向特定区室的各种荧光蛋白来监测自噬过程中不同细胞器的命运（例如， 线粒体> 线粒体自噬；内质网> 内质网自噬， 等等综上所述，本文所述技术扩展了用于显微研究真菌的方法范围。 ¹².

该实验方案通常简单明了且易于操作。然而，必须特别注意饥饿平板绝不能干燥，否则将导致人为假象及细胞死亡。因此强烈建议：（i）在加热板上制备仍处于液态的琼脂糖溶液后，应立即将载玻片从加热板上取下（...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带中央腔的显微镜载玻片	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	H884.1	清洁后可多次使用。
玻璃珠	Carl Roth GmbH, Karlsruhe, Germany	A553.1	直径：0.25 - 0.50 mm