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基于探针的实时PCR方法用于microRNA的定量检测

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DOI：

10.3791/52586

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2015年4月14日

 ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Islet Biology Group, NHMRC Clinical Trials Centre, Faculty of Medicine, The University of Sydney, 2Biomarkers Laboratory, NHMRC Clinical Trials Centre, Faculty of Medicine, The University of Sydney

本文内容

摘要

循环microRNA最近已成为多种癌症及其他疾病的有前景的新型生物标志物。本文旨在讨论三种不同的基于探针的实时PCR平台和方法，这些平台和方法可用于定量并确定循环microRNA的丰度。

摘要

基于探针的定量PCR（qPCR）是测量转录本丰度的常用方法，因为它是灵敏度最高的检测方法之一，可提供准确且可重复的分析结果。与其他基于染料的化学方法相比，基于探针的化学方法具有最低的背景荧光。目前已有多种采用探针化学法来定量转录本丰度的平台。96孔板qPCR是最常规使用的方法，但在单次运行中最多只能检测96个样本或miRNA。如果需要分析大量样本或miRNA，则该方法耗时且繁琐。高通量的基于探针的平台，例如微流控（例如 TaqMan阵列卡）和纳流控阵列（例如 OpenArray），可在短时间内对大量样本中的多种miRNA丰度进行高效、可重复的检测。本文中，我们展示了利用基于探针的化学方法及三种不同平台（96孔板、微流控和纳流控阵列）从血清或EDTA血浆样本中进行miRNA定量的实验设置与操作流程，这些平台的通量依次提高。

引言

microRNA（miRNA）是一类长度约为22个核苷酸的非编码RNA（ncRNA），在基因表达调控中发挥重要作用1-3。动物中的大多数miRNA通过与mRNA的3’非翻译区（UTR）进行序列特异性的碱基配对，从而实现对基因表达的负向调控2-4。这种调控通常通过抑制mRNA的翻译过程或导致核糖体脱落来实现。循环中的miRNA已被证明在多种疾病（如糖尿病5-7、卵巢癌8、前列腺癌9和乳腺癌10,11、乙型肝炎12以及其他自身免疫性疾病13）的研究和临床领域中具有作为新型生物标志物的潜力。已有研究致力于鉴定不同细胞或组织中丰度较高的miRNA，以及在人血浆和血清样本中更易获取且侵入性更小的循环miRNA9,11-15。

已采用多种平台建立了不同的miRNA定量方法，例如标准96孔板平台4,12,16-18、微流控卡片平台12,18-23以及纳流控阵列平台17,24。定量实时PCR（qPCR）能够利用多种化学体系（染料法或探针法）来测定转录本的相对或绝对数量。基于探针的实时PCR技术具有背景荧光低、灵敏度高的优点，可检测单个转录本拷贝。该方法相对成本较低、操作简便且高度可重复，因此成为定量和分析miRNA表达的首选方法25。基于探针的qPCR方法通常包括两个步骤：逆转录（RT）和qPCR4,26,27。在逆转录过程中，茎环结构的RT引物与成熟或初级miRNA分子杂交，并被逆转录为互补DNA（cDNA）。随后使用miRNA特异性的PCR引物对cDNA产物进行定量26-28。基于探针的qPCR原理依赖于对互补链实时延伸过程的检测，该过程涉及荧光标记探针的水解。这些探针设计为包含一个荧光报告基团和一个淬灭基团，二者间距足够近以允许发生FRET（荧光共振能量转移）。由于淬灭分子与荧光报告基团（发射体）距离极近，其荧光信号被屏蔽。当Taq DNA聚合酶（pol）从上游引物延伸至分支点（探针的5’端）时，Taq聚合酶的外切核酸酶活性会水解探针，导致荧光发射体与淬灭基团发生物理性解离/分离。单个荧光发射体分子的释放被检测器记录，并表现为该孔/反应中荧光信号的逐步增加。荧光信号的增加与生成的PCR产物量成正比，从而实现对扩增靶标的精确定量26,28。

随着对miRNA定量需求的不断增加，中高通量技术已被开发出来，以实现在较短时间内处理大量样本。TaqMan低密度阵列（TLDA）是一种基于探针法qPCR化学原理的中通量创新微流控设计，可提高单块板上分析的miRNA数量。TLDA采用一组预先定义的逆转录引物池来合成cDNA，随后将这些cDNA加入定制的384孔微流控卡片中，通过qPCR技术检测多种miRNA的表达水平22,26,29。卡片的每个孔中均含有冻干的引物和探针，用于扩增特定的miRNA，因此单张TLDA卡片可同时运行多达384个反应26。

纳米流体芯片阵列是一种高通量平台，利用相同的基于探针的化学方法用于检测基因转录本24。该技术采用一种专有的基质，通过疏水-亲水相互作用，便于将33纳升的反应混合物轻松加载至不锈钢载片上包含3072个通孔的阵列中24。本文重点演示如何在血清/血浆中定量miRNA，介绍实验操作的关键因素，以及在数据生成和解读过程中必须考虑的重要事项。同时，本文还将讨论这些方法各自的优点与局限性。

方案

可以使用我们实验室建立的方案30或其他市售试剂盒从血清中分离总RNA。

注意：提供了用于计算每个实验中反应体积的补充交互式电子表格（已包含移液时计入的5%过量体积）。

1. 使用标准96孔板平台进行基于探针的实时定量PCR

  1. miRNA 的 cDNA 合成（逆转录）操作（针对血清/血浆 RNA 样本）
    1. 计算并取出每个 cDNA 合成反应所需的 10 ng RNA。加入无核酸酶水，使 10 ng RNA 的终体积达到 1.67 µl（用于 5 µl 反应体系）。将样本置于冰上保存。
    2. 选择目标 miRNA 并解冻其逆转录（RT）引物。
    3. 解冻 RT 试剂混合液的各组分：RT 缓冲液（10X）、dNTPs（100 mM）、RNase 抑制剂（20 U/µl）。切勿将酶（重组莫洛尼鼠白血病病毒（rMoMuLV）逆转录酶（50 U/µl））置于冰上。应将其保存在 -20 °C 或冷冻块中，直至使用时取出。
    4. 按照 表 1A 所述，在冰上配制 RT 试剂混合液。建议额外多配制至少 5% 的体积，以补偿移液误差。
    5. 向每根 0.2 ml PCR 管或孔板中加入 2.33 µl RT 试剂混合液。
    6. 涡旋混匀 RT 引物管，然后在 10,000 x g 下短暂离心 10 秒。向对应的 PCR 管或 孔板中加入 1 µl 特异性 miRNA RT 引物。向对应的 PCR 管或 孔板孔中加入 1.67 µl 稀释后的 RNA。所有加样操作均需在冰上进行。
    7. 将反应管或孔板在 4 °C 下以 1,950 x g 离心 5 分钟 。
    8. 在热循环仪上设置 miRNA cDNA 合成程序，条件如下：16 °C 反应 30 分钟，42 °C 反应 30 分钟，85 °C 反应 5 分钟 ，然后 4 °C 保存。
    9. 设定反应体积为 10 µl。将反应管或孔板放入热循环仪中，启动 RT 程序。若不立即进行实时 PCR 扩增，则将 cDNA（RT）反应产物保存于 -20 °C。
  2. 基于探针的实时定量 PCR（qPCR）检测成熟 miRNA
    1. 解冻针对相应 RT 产物的选定探针型 qPCR 检测试剂（20X）。
    2. 通过轻轻旋转瓶身混匀专有的实时 PCR 溶液（qPCR 试剂混合液）。
    3. 为每种待分析的 miRNA 配制 qPCR 试剂混合液。配制时，为每种 miRNA 样本取一个无菌的 1.5 ml 微量离心管，并按照 表 1B 所述向各管中加入相应组分。建议额外多配制至少 5% 的体积，以补偿移液误差。
    4. 向光学 96 孔板（或 PCR 管）的每个孔中加入 4.2 µl 对应的 qPCR 试剂混合液。向每个孔中加入 0.8 µl 对应的 cDNA 反应产物（即步骤 1.1 中合成的各 miRNA cDNA）。
    5. 使用合适的光学密封膜封板。将板（或管）在 4 °C 下以 1,950 x g 离心 5 分钟 。
    6. 开启计算机、96 孔板/微流控芯片读取仪，然后启动软件。确保仪器正确连接，并确认使用了正确的反应模块和加热盖（适用于快速 96 孔板）。
    7. 选择实验类型为“快速 96 孔板模块（0.1 ml）”、“标准曲线”、“TaqMan 试剂”和“快速模式”。在实时 PCR 系统上设置 qPCR 程序，循环条件如下：95 °C 预变性 20 秒，进行 50 个循环（95 °C 变性 1 秒，60 °C 退火延伸 30 秒）。
    8. 设定反应体积为 10 µl。将反应管或板放入仪器中，点击“开始运行”。程序运行时间约为 1 小时。

2. 基于探针的微流控阵列芯片（芯片A和B）

注意：基于探针的 miRNA 检测面板包含两块 384 孔微流控芯片（芯片 A 和芯片 B）。每块芯片上含有针对多达 380 种 miRNA 及对照的干燥引物和探针。针对芯片 A 或芯片 B 的 cDNA 产物（无论是否经过预扩增）需分别加载至对应的芯片中进行实时 PCR 检测。

  1. 逆转录（RT）
    1. 本方案适用于总RNA输入量为1-1,000 ng的情况。若输入量在1-350 ng之间，需进行预扩增（pre-amp）步骤；若输入量超过350 ng，则可将cDNA直接上样至阵列卡片，无需预扩增。
      注意：进行血清miRNA谱型分析时，起始总RNA量为100 ng。如需完整的miRNA谱型，每个样本需运行两组预定义的RT引物池（Pool A和Pool B）的逆转录反应。
    2. 将以下试剂在冰上解冻：RT引物（10倍浓度）：Pool A和Pool B、含dTTP的dNTPs（100 mM）、RT缓冲液（10倍浓度）、MgCl2（25 mM）、RNase抑制剂（20 U/µl）。酶（重组莫洛尼鼠白血病病毒（rMoMuLV）逆转录酶（50 U/µl））不得置于冰上，应保存在-20 °C直至使用。
    3. 除酶以外的所有试剂轻轻涡旋混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。
    4. 按照表2A所述，将试剂分别加入两个离心管中：一管用于Pool A，另一管用于Pool B。每管仅包含一组预定义的RT引物池（Pool A或Pool B）。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。
    5. 颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。取100 ng各RNA样本分装至新管中，再加入适量无核酸酶水，使总体积为3 µl。
    6. 向相应管中加入4.5 µl适当的RT试剂混合液，颠倒混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。
    7. 将样本放入热循环仪中，按以下条件启动逆转录程序：40个循环（16 °C 2分钟，42 °C 1分钟，50 °C 1秒），85 °C 5分钟，4 °C保存。使用这些预定义引物池生成的cDNA应储存于-15至-25 °C，或立即使用。
  2. 预扩增
    1. 将预定义的预扩增引物池在冰上解冻。轻轻涡旋引物，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。通过轻弹使TaqMan PreAmp试剂混合液（2倍浓度）充分混匀。
    2. 按照表2B所述，将试剂分别加入两个离心管中：一管用于Pool A，另一管用于Pool B。
      注意：如上所述，Pool A的预扩增引物加入A管，Pool B引物加入B管。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。
    3. 颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。向新管中分装22.5 µl相应的PreAmp试剂混合液。向对应管中加入2.5 µl cDNA样本（由RT步骤制备）。
    4. 颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。将样本放入热循环仪中，启动预扩增循环。循环条件：95 °C 10分钟，55 °C 2分钟，72 °C 2分钟，12个循环（95 °C 15秒，60 °C 4分钟），99.9 °C 10分钟，4 °C保存。
    5. 颠倒预扩增后的cDNA以混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。向预扩增cDNA中加入75 µl 0.1倍TE缓冲液（pH 8.0）（1:4稀释）。颠倒稀释后的预扩增样本以混匀，然后在10,000 × g下短暂离心10秒。稀释后的预扩增cDNA可在-15至-25 °C保存最多一周，或立即使用。
  3. 微流控芯片上样及qPCR操作
    1. 将微流控miRNA芯片置于室温下至少半小时，使其恢复至室温。将稀释后的预扩增cDNA在冰上解冻，通过颠倒混匀后短暂离心。通过旋转混匀qPCR试剂混合液。
    2. 在新管中加入450 µl qPCR试剂混合液和9 µl稀释后的预扩增cDNA。对于A芯片，使用由引物Pool A制备的预扩增产物。加入441 µl无核酸酶水，使最终体积达到900 µl。颠倒混匀后，在10,000 × g下短暂离心10秒。
    3. 待芯片恢复至室温后，从包装中取出，放置于洁净区域，铝箔面朝下。向芯片上的8个加样口各加入100 µl PCR反应混合液。每个储液池有2个加样口（每张芯片共8个储液池）。
      注意：加样口为较大的孔，用于加入反应混合液；通气孔为较小的孔。每张miRNA TLDA芯片包含8个储液池，每个储液池通向48个孔（每列24孔 × 2列），从而将相同的PCR反应混合液加载至芯片全部384个孔中。确保每个样本的Pool A和Pool B分别加载至对应的TLDA芯片。将阵列芯片放入离心机专用的微流控阵列芯片支架桶中。
    4. 微流控阵列芯片需使用合适的离心机（如Heraeus Multifuge 3SR，230V离心机）及专用支架桶（如“TaqMan Array Card”支架）。每个支架桶最多可容纳3张芯片（已加载或空置）。始终确保每个支架桶的3个插槽均被占用，并通过在离心机对侧位置放置相同支架桶（该桶也应包含3张芯片，无论空置或已加载）实现平衡。将芯片放入支架桶时，确保8个储液池朝上，反应孔朝向离心机外壁。
      1. 在室温下以331 × g离心1分钟。第一次离心后，打开离心机，目视确认反应混合液已分配至全部384个孔中。以相同条件再重复离心一次。从支架桶中取出芯片，检查8个储液池中反应混合液的液面是否一致。若储液池中液体体积存在不一致，则该芯片不可继续使用。
    5. 微流控阵列芯片需使用专用封膜仪，其配备精密的压头组件（滑架），用于密封芯片内的流体分布通道，并将反应混合液均匀分配至所有孔中（每孔总反应体积为1 µl）。
    6. 将压头移至起始位置，将已加载的芯片插入封膜仪，铝箔面朝上，并与封膜仪上的压针对齐。以缓慢、稳定且连续的单次动作，将压头推至封膜仪末端。取出已密封的阵列芯片，用剪刀剪除芯片上的储液池部分。
    7. 确保微流控阵列实时PCR系统/仪器中已正确安装相应的模块、加热盖和样本载体。
    8. 开启计算机，然后启动微流控阵列系统，最后打开软件。确保设备正确连接。选择实验类型为阵列芯片、标准曲线、TaqMan试剂和标准模式。导入A芯片或B芯片的设置文件，保存文件。
    9. 将密封后的芯片放入仪器托盘中，使A1孔位于左上角，条形码朝向仪器前方。点击“开始运行”。程序运行时间约为2小时。

3. 基于探针的纳米流体人 miRNA 检测面板

  1. 逆转录（RT）
    1. 本方案适用于总RNA输入量为50–200 ng的样本，其中100 ng对大多数样本而言最为理想。若需获得完整的miRNA表达谱，每个样本应分别进行两组预定义的RT引物池（池A和池B）的逆转录反应。
    2. 将试剂在冰上解冻：预定义的RT引物池（10X）、含dTTP的dNTP混合物（100 mM）、RT缓冲液（10x）、MgCl2（25 mM）、RNase抑制剂（20 U/µl）。酶（重组莫洛尼鼠白血病病毒（rMoMuLV）逆转录酶（50 U/µl））不得置于冰上保存，应储存在-20 °C直至使用。除酶外，其余试剂轻轻涡旋混匀，并在10,000 x g下短暂离心10秒。
    3. 按照表3A所述，将试剂分别加入两个离心管中；一管用于池A，另一管用于池B。每管仅包含一个预定义的RT引物池，即池A或池B中的一种。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。
    4. 用移液器吹打混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。将每种RNA样本各100 ng分装至新管中，并加入无核酸酶水调整总体积至3 µl。向相应管中加入4.5 µl适当的RT试剂混合物。
    5. 轻柔颠倒混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。将样本放入热循环仪并启动RT程序。循环条件：40个循环（16 °C 2分钟，42 °C 1分钟，50 °C 1秒），85 °C 5分钟，4 °C保存。使用这些预定义RT引物池生成的cDNA应储存于-15至-25 °C，或 立即使用。
  2. 预扩增（pre-amp）
    1. 将预定义的预扩增引物池在冰上解冻。轻轻涡旋混匀引物，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。轻柔旋转TaqMan PreAmp试剂混合物（2X）以混匀。
    2. 按照表3B所述，将试剂分别加入两个离心管中；一管用于池A，另一管用于池B。每管仅包含一个预定义的RT引物池（池A或池B）。建议额外准备至少5%的体积以补偿移液误差。
    3. 用移液器吹打混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。将22.5 µl适当的PreAmp试剂混合物分装至新管中。向相应管中加入2.5 µl cDNA样本。轻柔颠倒混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。冰上孵育5分钟。
    4. 将样本放入热循环仪进行预扩增。设定反应体积为25 µl。循环条件：95 °C 10分钟，55 °C 2分钟，72 °C 2分钟，12个循环（95 °C 15秒，60 °C 4分钟），99.9 °C 10分钟，4 °C保存。
    5. 轻柔颠倒预扩增后的cDNA以混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。在新管中，将4 µl预扩增cDNA加入156 µl 0.1x TE缓冲液（pH 8.0）中（1:40稀释）。轻柔颠倒稀释后的预扩增样本以混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。稀释或未稀释的预扩增cDNA可在-15至-25 °C保存最多一周，或 立即使用。
  3. 加载纳米流体芯片并进行qPCR
    1. 使用纳米流体芯片载玻片的序列号，从网站31 下载相应的板文件（.tpf）。该文件包含特定纳米流体芯片载玻片的运行信息。
    2. 将稀释后的预扩增cDNA和TaqMan实时qPCR试剂混合物（如首次使用）在冰上解冻。通过旋转瓶身混匀qPCR试剂混合物。在新管中，将22.5 µl qPCR试剂混合物与22.5 µl稀释后的预扩增cDNA混合。轻轻涡旋混匀，然后在10,000 x g下短暂离心10秒。
    3. 将每种样本各5 µl分装至纳米流体芯片工作流程384孔样本板的8个孔中（2列，4行）。确保每个样本的池A和池B位于相邻的8孔区块内（参见图1 或补充Excel表格中的布局）。
      1. 每块样本板最多可容纳相当于八张芯片的样本量。然而，纳米流体芯片系统单次运行仅能处理4张芯片。若在一块样本板上加载超过四张芯片的样本，请确保其余区域已密封。使用OpenArray样本板密封膜进行密封。
        注：建议预先将密封膜裁剪成所需区域，以便单独密封/揭开，减少蒸发。或者，也可先用完整密封膜封板，之后在加载时逐个区域切开。
    4. 在4 °C、490 x g下离心1分钟。应在1小时内完成纳米流体芯片载玻片的加载。由于密封载玻片的时间有限，请一次仅加载一张载玻片。从冷冻保存中取出纳米流体芯片载玻片，使其恢复至室温（约15分钟）。
    5. 确认纳米流体芯片系统中已安装正确的模块、加热盖和样本载体。打开计算机、实时PCR系统和加载系统。进入相应软件界面，并确认各设备已连接。从包装中取出加载系统的耗材（芯片载玻片盖、塞子和浸没液）。
    6. 轻轻拉动浸没液注射器的活塞以松动。取下帽盖，安装尖端并排出尖端中的空气。将加载系统尖端放入机器内并取下盖子。将样本板放入PCR系统中。
    7. 戴上手套。确保手套贴合紧密，以尽量减少意外触碰或污染载玻片盖的风险。小心打开载玻片包装。缓慢将载玻片滑入手掌中。切勿触碰载玻片顶部。
    8. 将载玻片放入PCR系统中，条形码朝左。移除样本板上拟加载区域的密封膜。使用加载系统软件输入载玻片条形码、载玻片位置、样本位置和尖端配置。
    9. 完成所有相关检查后，按下“加载载玻片”按钮。当PCR系统正在加载载玻片时，取下载玻片盖底部的透明和红色塑料片。加载完成后，须在90秒内小心取下并密封载玻片。
      1. 将载玻片放入板夹中。将载玻片盖盖在载玻片上。夹紧30秒。确保盖子方向正确，使条形码清晰可见。从板夹中取出组装好的载玻片组件。
      2. 将浸没液注射器插入载玻片中，使尖端紧贴盖子。缓慢注入浸没液，确保液体沿盖子表面流动。注满后，用塞子密封载玻片，旋转螺丝直至手柄断裂脱落。
      3. 取下载玻片盖顶部的塑料保护盖，然后小心地将其放入实时PCR系统的载玻片载体中。在降低载玻片时，确保底部有支撑，防止突然掉落，且切勿触碰载玻片顶部。允许触碰载玻片/盒的侧面。启动PCR系统，并在1小时内开始qPCR程序。
    10. 在PCR系统软件中选择“OpenArray”。点击“查找载玻片ID”。此过程需数分钟。若软件无法识别板ID，将提示手动输入。
    11. 点击“确认板中心”。此过程同样需要数分钟。检查红色圆点是否位于中心，并确认载玻片顶部无指纹或污迹。为每张载玻片加载相应的.tpf文件，并指定结果文件名及存储位置。点击“开始运行”。程序运行时间约为2小时 。

结果

基于miRNA探针的qPCR反应推荐体积为20 µl。注意：我们已证实，5 µl反应体积能够产生与20 µl体积相当的结果4,7,30。将反应体积降低至5 µl可在不影响检测灵敏度的前提下，使试剂成本降低75%。如图2所示，20 µl与5 µl反应体积在扩增至39个循环前表现出高度一致性（r2 = 0.92，p = 0.0002）。

微流控芯片阵列提供了一种工具，可在约5小时内（针对A卡和B卡）获取样本中表达的754种miRNA的数据，相较于传统的96孔板PCR，该方法在分析多个样本时效率更高。我们对同一样本（样本A及样本A重复）的miRNA微流控芯片阵列卡片进行了比较。 图3A-B 显示Bland-Altman图（3A）以及相关性图（3B) 针对这些样本检测的全部 754 个 miRNA。两种卡片（卡片 A 和卡片 B）上均在多个不同位置随机设置了 3 种不同的对照 miRNA（U6、RNU44 和 RNU48）。当比较两次运行之间的 U6 循环阈值（Ct）值时，我们未观察到数值之间存在显著差异。表 4）。还需注意的是，所检测样本中 U6 的表达丰度更高（Ct 值更低）。随后，我们比较了两次运行中 Ct 值均介于 0–19.99 之间的所有 miRNA（n = 150），总体 miRNA 表达水平相似，决定系数为 98%（图 3C–D）。在两次运行中 Ct 值均介于 20 至 29.99 的全部 277 个 miRNA 中，有 16 个 miRNA 在原始运行与重复运行之间存在显著差异（图 3E-F). 当两次运行的Ct值均选择在30-40之间时，两次运行间存在显著差异的miRNA数量增加（89个/327个） （图3G）-H)

纳米流体芯片平台可从每个血清/血浆样本中提供754种miRNA的数据，如图4A所示。与所有qPCR实验一样，必须仔细检查这些扩增曲线，以确保结果反映的是真实的扩增信号。每个48个子阵列（图1）均包含针对三种最常用的“看家”非编码RNA（ncRNA）——U6、RNU44和RNU48的检测。图4B展示了一个样本中U6重复检测的典型聚类情况。这些重复检测显示出较低的标准差（SD <0.5），因此可作为结果可靠性的指标。相比之下，图4C展示了另一个样本中U6重复检测的变异性增加（SD >0.5）。这并不否定其余检测的有效性，但确实需要进行更深入的评估。与大多数存在于生物体液中的“看家”miRNA一样，U6的表达水平可能存在变异。值得注意的是，图4C中所示的一个样本，其U6含量比图4B中所示样本低4倍。由于图4C样本中U6的初始水平已比图4B面板中的样本低75%，因此由于转录本的泊松分布特性，在微小反应体积下技术变异性会进一步加剧17。

另一个有用的工具是质量控制（QC）图像，在运行完成后可导出。其中部分图像利用了qPCR试剂混合液中含有的被动染料ROX的荧光信号，以确认每个通孔是否已正确加样（图5）。通孔甚至整个子阵列未能加样，可能由以下原因导致：样本体积不足、蒸发、384孔样本板孔内存在气泡、未完全去除样本板封膜，或Accufill系统及其移液尖端存在缺陷。必须识别所有未加样的通孔，以避免将miRNA错误判读为“不可检测”，而实际上该检测位点并未加载任何反应体系。若遇到此类问题，请确认每个384孔板孔中至少加入5 µl样本/主混合液，样本板在加载前已正确离心，铝箔封膜已完全移除，且已加载的OpenArray芯片须在规定时间内密封并完成后续运行。若加样问题仍然存在，则更可能与特定批次的芯片或相关耗材有关，应联系制造商寻求进一步技术支持。

AccuFill系统加载和OpenArray芯片的384孔板示意图，显示样品布局。
图1：纳米流体芯片工作流程的样品布局：（A）每块384孔样品板最多可容纳8块纳米流体芯片所需的样品。（B）稀释并预扩增的cDNA被加入8个孔中（2列×4行），Pool A和Pool B分别位于相邻的8孔组中。每个圆圈代表一个孔。（C）样品板中的每个孔将被加载至纳米流体芯片的一个子阵列中。每个小方格代表一个子阵列。

线性回归图，显示5-20 µl反应体积在实验结果中的数据相关性。
图2：传统96孔PCR平台的相关性分析： 使用标准96孔板平台进行TaqMan实时qPCR检测时，20 µl与5 µl反应体系在CT值（39个循环）上的相关性。我们在4种不同的人血清和血浆样本中比较了4种不同的微小RNA（miR-375、miR-30c、miR-30d和miR-7）。由于部分数据无法检测到，仅绘制了11个数据点。R2 = 0.92，p = 0.0002。

miRNA analysis; Ct value repeatability graphs, regression analysis, correlation study, statistical chart
图3： 使用微流控阵列芯片进行循环miRNA谱型分析。 使用2张微流控芯片（芯片-A和芯片-B），可生成754种miRNA的表达谱（A-B）。如图所示，我们使用同一样本进行了两次微流控芯片阵列检测，以验证微流控芯片结果的可重复性。总体上观察到miRNA表达水平相似，Ct值介于0-19.99之间。C-D）。仅有少数 miRNA（277 个中有 16 个）的 Ct 值介于 20–29.99 之间，且在重复实验中存在显著差异（E-F）。在327个Ct值较高（30-40）的microRNA中，有89个在两次运行之间表现出显著差异（G-H). 采用配对t检验对数据进行分析。 请点击此处以查看此图的放大版本。

PCR扩增，ΔRn与循环数的线性图谱，显示各循环中荧光信号的变化。
图4：PCR产物扩增曲线的代表性图谱：为一个人类血浆样本中所有miRNA靶标的合并（A）扩增曲线的代表性图示。每个亚阵列中均设置了U6（一种常见的对照非编码RNA）检测。图（B）中的样本显示U6重复间的变异度较低（标准差 SD <0.5），而图（C）则显示U6重复间标准差较高（SD >0.5）。两个样本均为从人类血浆中提取的总RNA。请点击此处查看该图的高清版本。

微阵列分析；DNA杂交结果；网格模式中的荧光检测；科研用途。
图 5：纳米流控芯片的质量控制分析：正确加载的纳米流控芯片（左）与错误加载的纳米流控芯片（右）的质量控制（QC）图像。被动染料ROX（存在于qPCR试剂混合液中）产生荧光，以指示通孔是否正确加载。右侧芯片存在多个未加载qPCR试剂混合液的子阵列/通孔，这些应被识别为假阴性PCR反应。

组分每 5 µl 反应体系的体积 (µl)
RT 缓冲液 (10x)0.5
dNTPs (100 mM)0.05
RNase 抑制剂0.6
无核酸酶水1.39
逆转录酶0.33
总体积2.33

表1A： 使用标准96孔板平台进行TaqMan实时qPCR时，5 µl反转录反应体系中反转录试剂混合液的组分。

组分每 5 µl 反应体系的体积 (µl)每 20 µl 反应体系的体积 (µl)
Fast PCR 预混液 (2x)2.510
TaqMan qPCR 引物探针组合 (20x) *0.251
无核酸酶水1.455.8
总体积：4.216.8

*基于所选测试 miRNA 的检测组分。

表1B：使用标准96孔板平台进行TaqMan实时qPCR时，5 µl或20 µl qPCR反应体系中qPCR试剂混合液的组分。

组分每反应体积µl)
Megaplex RT 引物（10x）0.8
含 dTTp 的 dNTPs（100 mM）0.2
Multiscribe逆转录酶（50 U/µl)1.5
10X RT缓冲液0.8
MgCl₂2 (25 mM)0.9
RNase 抑制剂     (20 U/µl)0.1
无核酸酶水0.2
总计4.5

表 2A： 用于 TLDA miRNA 面板的 5 µl RT 反应体系中 RT 试剂混合液的组分。

组分每反应体积 (µl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x)12.5
Megaplex PreAmp Primers (10x)2.5
无核酸酶水7.5
总计22.5

表 2B： 用于 TLDA miRNA 面板的 25 µl 预扩增反应体系中的 PreAmp 试剂混合组分。

组分每反应体积µl)
Megaplex RT 引物（10x）0.75
含 dTTp 的 dNTPs（100 mM）0.15
多转录酶（50 U/µl)1.5
10X RT缓冲液0.75
MgCl2 (25 mM)0.9
RNase 抑制剂     (20 U/µl)0.09
无核酸酶水0.35
总计4.5

表 3A： 基于探针的纳米流体 miRNA 检测面板中，5 µl 逆转录反应体系的逆转录试剂混合液组分。

组分每反应体积 (µl)
TaqMan PreAmp Mastermix (2x)12.5
Megaplex PreAmp Primers (10x)2.5
无核酸酶水7.5
总计22.5

表3B： 基于探针的纳米流体miRNA检测面板中25 µl预扩增反应体系的PreAmp试剂混合组成。 注意：为三种平台提供的交互式补充Excel电子表格已包含5%的额外添加量，以补偿移液误差。

样本 A样本 A 重复
15.53516.156
15.47115.652
15.62316.063
15.96315.889
14.00613.993
14.50214.623
14.90714.384
13.73214.946

表4： 使用微流控芯片阵列对循环miRNA U6进行表达谱分析。采用两张微流控芯片阵列（A 和 B）。来自样本A的U6内参miRNA的Ct值（总计 = 8）。两次运行之间观察到U6内参miRNA丰度一致。

讨论

为了获得准确且可重复的结果，在基于探针的qPCR实验方案中，关键步骤包括：1）确保每个qPCR反应中加入的逆转录产物（RT产物）体积和浓度相同；2）正确配制qPCR反应所需各组分的比例和体积，并充分混匀；3）向每个qPCR反应中加入正确且一致的体积；4）在尽可能短的时间内完成每个样品和反应混合物的制备与加样，同时始终注意前述各项关键步骤。

微流控阵列芯片需要使用合适的离心机和专用转子桶。每个转子桶最多可容纳3张芯片（已加载或空置）。使用时务必确保转子桶的全部3个卡槽均被占用，并通过在离心机相对位置放置另一个相同的转子桶（该桶也应包含3张芯片，无论为空或满）来保持平衡。将芯片放入转子桶支架时，应确保8个储液池朝上，反应孔面向离心机外壁。在室温下以331 × g离心1分钟。第一次离心后，打开离心机，目视确认反应混合液已通过384个孔均匀分配。在相同条件下重复离心1次。从转子桶中取出芯片，检查8个储液池中的反应混合液体积是否一致。若储液池中残留液体体积存在任何不一致，则该芯片不宜继续使用。

为了使反转录产物（RT-产物）的浓度一致，每个反转录反应中加入相同浓度的RNA起始量。总RNA浓度使用微量分光光度计进行测定。从血浆或血清中提取的RNA，其260/280比值可低至1.3；但这似乎不会影响后续qPCR相关流程或所产生的数据30。同样，本文所检测的RNA样本的260/280比值在1.3–1.7之间，qPCR中未观察到异常影响。

当使用低RNA含量的样本（如来自体液的样本）时，在处理前可能难以对RNA进行准确定量。我们建议在RNA提取以及逆转录阶段均使用合成的外参 spike-in。根据我们的经验， 拟南芥 候选miRNA（ath-miR-159a和ath-miR-172a）优于 秀丽隐杆线虫 miRNA（例如 cel-miR-39 或 cel-miR-54），根据我们的经验，其同源性可能高于那些来自 A. thaliana使用此类特定阶段的外参 spike-in 可以校正不同时期检测的多个样品间 miRNA 数据的归一化。同样建议在 cDNA 合成反应中使用固定的 RNA 加样体积。32,33.

本文所述的三种基于探针的miRNA定量方法所需的总RNA投入量、实验流程和成本各不相同。每种实验流程的设计均针对不同通量需求，具体取决于待分析的miRNA靶标数量和样本数量。随着通量的提高（96反应→384反应→3072反应），单位时间内获得的数据量增加，每反应的成本随之降低。由于所有这些平台均采用TaqMan化学原理，因此所获得数据的质量可预期相似。TaqMan qPCR是一种成熟的方法，用于检测血清/血浆样本中miRNA的丰度9,11,27。尽管此处讨论的三种平台使用相同的化学原理，但反应体系体积的减小会导致转录本检测的动态范围缩小（Farr RJ et al.，未发表数据）。96孔qPCR平台通量较低，但灵敏度高，我们认为是所有基于探针（或染料）的PCR平台中的“金标准”。然而，若需检测数百至数千个样本且涉及多个microRNA时，该平台可能并非最经济或高效的选项。微流控（TLDA）和纳流控（OA）平台属于高通量/高含量平台，旨在更短时间内获取更大规模的数据。尽管在TLDA芯片中观察到批次间差异，但可通过申请同一批次的TLDA芯片来尽量减少该问题。我们发现，当使用同一样本在不同批次的TLDA芯片上进行检测时，TLDA平台（图3）在17%的中–低丰度miRNA中表现出显著变异。因此，我们建议在使用TLDA芯片进行分析时采用相同批次编号的产品。这种变异也可能源于技术性差异，包括潜在的加样和移液误差。然而，我们仍建议订购或申请同一批次的TLDA芯片。在OA平台上未观察到显著的批次间变异。尽管如此，基于TaqMan的实验性qPCR方法仍能简便地测定血浆/血清样本中miRNA的丰度。本文讨论的低、中、高通量方法提供了灵活性，可利用高效、可重复且背景噪声低的化学体系，对多种样本和miRNA进行分析。

披露

本文的出版处理/发表费用由Life Technologies在稿件被接受发表后承担。

致谢

所有作者均感谢澳大利亚国家健康与医学研究委员会临床试验中心（NHMRC CTC）、悉尼大学、澳大利亚青少年糖尿病研究基金会（JDRF）以及澳大利亚Rebecca Cooper基金会提供的基础设施支持。本研究由澳大利亚研究理事会（FT110100254）和澳大利亚JDRF（CRN201314）提供的资助支持。WW和RJF、MVJ完成了全部湿实验工作，ASJ进行了数据分析。WW撰写了初稿。AAH负责研究设计和数据分析。所有作者均阅读并同意提交发表的论文终稿、图表及工作表内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
96 孔板平台
逆转录反应
TaqMan MicroRNA Assays INV SM Applied Biosystems
 		4427975https://www.lifetechnologies.com/au/en/home/life-science/pcr/real-time-pcr/real-time-pcr-assays/mirna-ncrna-taqman-assays/single-tube-mirna-taqman-assays.html?ICID=search-4427975
该试剂盒包含逆转录引物和 PCR 引物。
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒Applied Biosystems
 		4366597 或 4366596https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366597?ICID=search-4366597 或 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4366596?ICID=search-4366596
TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒在所有三种 TaqMan 平台（96 孔板、TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应中均使用相同的试剂。
在 96 孔板平台上进行 qPCR 扩增
2x TaqMan Fast Universal PCR Master Mix，不含 AmpErase UNG Applied Biosystems
 		4367846https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4367846?ICID=search-4367846
2X TaqMan Fast Universal PCR Master Mix 用于两种 TaqMan 平台（96 孔板和 TLDA）的 qPCR 扩增。 
MicroAmp 光学粘性封膜Applied Biosystems4311971https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4311971?ICID=search-product
MicroAmp Fast 光学 96 孔反应板，0.1 ml Applied Biosystems4346907https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4346907?ICID=search-product
微流控平台（TLDA）
逆转录反应
参见上述 96 孔板平台使用的 TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（4366597 或 4366596）。
Megaplex RT 引物，人源 Pool A v2.1Applied Biosystems
 		4399966https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399966?ICID=search-4399966
Megaplex RT 引物，人源 Pool A v2.1 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应。 
Megaplex RT 引物，人源 Pool B v3.0Applied Biosystems
 		4444281https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444281?ICID=search-4444281
Megaplex RT 引物，人源 Pool B v3.0 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应。 
或或
Megaplex 引物池，人源 Pool Set v3.0Applied Biosystems
 		4444750http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444750?ICID=search-4444750
Megaplex 引物池，人源 Pool Set v3.0 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的逆转录反应。 
预扩增反应
TaqMan 预扩增主混合液Applied Biosystems
 		4391128 或 4488593https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4391128?ICID=search-4391128 或 http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4488593
TaqMan 预扩增主混合液用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。 
Megaplex 预扩增引物，人源 Pool B v3.0 Applied Biosystems
 		4444303https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444303?ICID=search-4444303
Megaplex 预扩增引物，人源 Pool B v3.0 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。 
Megaplex 预扩增引物，人源 Pool A v2.1Applied Biosystems
 		4399233https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4399233?ICID=search-4399233
Megaplex 预扩增引物，人源 Pool A v2.1 用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。 
1x TE 缓冲液（100 ml）Invitrogen12090-015https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/12090015?ICID=search-product
1x TE 缓冲液用于两种 TaqMan 平台（TLDA 和 OpenArray）的 qPCR 预扩增反应。 
加载并运行 384 孔微流控（TLDA）芯片
TaqMan Array 人源 microRNA A+B 芯片组 v3.0 Applied Biosystems4444913https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4444913
纳流控平台（OpenArray）
逆转录反应
参见上述 96 孔板平台使用的 TaqMan MicroRNA 逆转录试剂盒（4366597 或 4366596）。
预扩增反应
参见上述 TLDA 预扩增试剂
加载并运行芯片
TaqMan OpenArray 人源 microRNA 面板，QuantStudio 12K Flex（1 个面板）Applied Biosystems
 		4470187https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4470187?ICID=search-4470187
QuantStudio 12K Flex OpenArray 配件试剂盒 Applied Biosystems
 		4469576https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4469576?ICID=search-4469576
OpenArray 384 孔样本板  Applied Biosystems
 		4406947https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4406947?ICID=search-4406947
TaqMan OpenArray 实时 PCR 主混合液Applied Biosystems
 		4462159https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4462159?ICID=search-4462159
OpenArray AccuFill 系统吸头 Applied Biosystems
 		4457246https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/4457246?ICID=search-4457246
其他
无核酸酶水Qiagen129117http://www.qiagen.com/products/catalog/lab-essentials-and-accessories/nuclease-free-water

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microRNA 96 PCR

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