基于超声的冠状动脉血流与冠状动脉血流储备评估：小鼠压力超负荷模型的应用

摘要

冠状动脉血流储备（CFR）可用于评估心肌氧耗量及心血管风险。本研究建立了一种逐步的经胸多普勒超声心动图（TTDE）方法，用于在主动脉缩窄所致实验性压力超负荷条件下，对小鼠冠状动脉血流储备（CFR）变化进行纵向监测。

摘要

经胸多普勒超声心动图（TTDE）是一种在人类中研究冠状动脉血流速度和冠状动脉血流储备（CFR）的临床实用、无创性工具。CFR降低常伴随明显的心肌内和冠状动脉周围纤维化，可作为心功能障碍严重程度的指征。本研究逐步探讨在小鼠主动脉缩窄模型中，冠状动脉血流速度、CFR以及收缩期与舒张期峰值速度比值（S/D）的实时变化。通过采用一种可重复且可靠的数据输出的多普勒经胸成像技术，该方法评估了接受过主动脉缩窄或开胸手术的小鼠在术后两周以上期间间隔支冠状动脉（SCA）血流的变化情况。

成像过程中，通过异氟烷诱导所有小鼠产生充血，异氟烷是一种麻醉剂，与静息血流速度相比可增加冠状动脉血流速度。所有图像均由同一成像操作者采集。使用专有软件并由两位独立观察者确定两个比值：（1）冠状动脉血流储备（CFR），即充血期与基线期血流速度的比值；（2）收缩期（S）与舒张期（D）血流比值。重要的是，冠状动脉血流的变化早于左心室（LV）功能障碍，这由正常的左心室质量和射血分数（FS）所证实。

该方法以冠状动脉评估的当前金标准——组织病理学作为对照进行了基准测试。后者技术显示出冠状动脉明显的病理改变，表现为冠状动脉周围纤维化，且与超声心动图评估的血流变化相关。

该研究强调了使用非侵入性技术监测小鼠心脏冠状动脉循环的价值。该方法可最大限度减少实验动物的重复使用，并证明基于超声的先进指标（如冠状动脉血流储备和收缩期/舒张期比值）可作为多种研究方案中有效的诊断工具，包括药物研究和基因修饰品系的研究。

引言

临床上，主动脉瓣狭窄（AS）已知会逐步增加左心室（LV）的后负荷。为代偿这种持续升高的血流动力学负荷，左心室肥厚（LVH）作为一种适应性反应随之发生^1,2。LVH的发展常伴随冠状动脉微循环的异常。人们认为，微血管功能障碍会导致这些患者出现慢性缺血⁵。除了冠状动脉血流^3,4外，冠状动脉血流储备（CFR）反映了冠状动脉的功能性变化^1,3，其定义为充血状态下最大血流速度与基础状态或静息状态血流速度的比值^4,6,7。在左心室重构过程中，CFR会降低^1-3,5-9，并被用作评估冠状动脉功能障碍严重程度的指标^1,10,17。已知在多种扩张型心肌病¹⁰以及冠状动脉狭窄⁶中，CFR均受损。CFR也是临床不良预后的预测标志物¹²。

在心功能障碍（如缺血或左心室肥厚）的情况下，左心室重构还伴随有广泛的心肌纤维化、冠状微循环改变以及冠状动脉增厚^1,2。由于冠状动脉生理学的这些变化，冠状动脉可能发生重构，这种重构有助于减轻低氧扩散和左心室舒张功能障碍所带来的影响，从而降低心肌缺血的易感性^1,2,13。

转基因小鼠现已成为模拟人类疾病状况（如冠状动脉粥样硬化^5,7,10,12,17）的广泛应用研究工具。特别是小鼠压力超负荷模型已被广泛研究^14,17。主动脉缩窄模型（TAC）已被证实与广泛的心肌纤维化及冠状动脉狭窄相关，后者部分源于冠状动脉中膜增厚，并伴随冠状动脉血流模式的改变^1,11,17,19，这与人类左心室肥厚（LVH）情况下的表现相似。尽管已知长期压力超负荷会在约4至8周内导致失代偿性心力衰竭，但在疾病进展早期以及结扎后不同阶段，这些模型对冠状动脉血流动力学和血流储备的影响尚未被明确阐明。

目前有多种小鼠品系可供研究使用，包括经过充分表征的LDLR-/-或ApoE-/-小鼠^10-12，这些品系推动了用于评估活体小鼠心血管功能和形态的敏感技术的发展^11-15。此类技术包括磁共振成像（MRI）、正电子发射断层扫描（PET）、对比增强CT、高频超声以及电子束断层扫描^2,9,17,19，它们均为侵入性方法（如心脏导管插入术和冠状动脉造影）提供了颇具前景的替代方案¹²。然而，由于小鼠冠状动脉尺寸极小且心率（HR）较高，目前许多可用技术在冠状循环成像方面仍面临技术挑战^4,12。值得注意的是，经胸多普勒超声心动图（TTDE）领域在技术上取得了指数级进展，包括开发出中心频率为15至50 MHz的高频阵列探头，可在8-40 mm的探测深度下实现约30-100 μm的轴向分辨率，并达到每秒超过400帧的成像帧率。因此，基于TTDE的技术已逐渐成为一种潜在的强大工具，可用于成像较大血管²，甚至如冠状动脉等更小的血管^5,12。

另一项关键进展是通过精心控制麻醉剂的使用，使小动物在成像过程中维持稳定的心率和呼吸频率，从而实现了对小动物血管系统的诊断性影像研究¹¹。在与小鼠血管舒张相关的研究中，可控的麻醉维持尤为关键，且在此背景下麻醉的影响仍需进一步探讨^10,11。在人类中，经胸超声心动图（TTDE）-derived 的冠状动脉血流储备（CFR）测量已逐渐成为评估狭窄及非阻塞性心外膜冠状动脉（尤其是左前降支冠状动脉，LAD）的常用工具^5,16。然而，在静息状态下左心室（LV）收缩功能保留的无症状患者或小鼠中，CFR及冠状动脉血流变化的预后意义仍研究较少¹⁶。因此，本研究的目的首先是建立一个清晰的分步操作方案，用于在压力超负荷小鼠模型中利用TTDE评估冠状动脉血流的变化；其次，探讨这些小鼠在压力超负荷刺激下CFR和冠状动脉血流变化的预后意义。我们假设，基于TTDE的CFR和冠状动脉血流评估可能有助于早期发现冠状动脉功能障碍，而这种功能障碍可能早于左心室功能障碍出现。

方案

注意：所有操作均按照美国兽医协会（AVMA）指南以及经机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的方案在小鼠中进行。

1. 研究设计

1. 在研究中使用 8 至 10 周龄的雄性 C57BL/6 小鼠（体重约 25 g）。
2. 将小鼠（n = 11）随机分为两组：实验组进行主动脉缩窄术（n = 8），对照组通过开胸术接受假手术（n = 3）。
3. 使用医用级脱毛膏去除小鼠胸部毛发，为成像做好准备。
4. 在主动脉缩窄术前 24 小时（第 -1 天）进行首次超声检查（见第 2 节），采用经鼻罩吸入 1% 至 2.5% 异氟烷（与 100% O₂ 混合）诱导麻醉。
5. 选择经医学批准的麻醉剂（例如异氟烷），并监测麻醉深度（诱导时 2-3%，维持时 1.0%）。
   注意：适当的麻醉对于维持正常生理心率（约 500 次/分钟）至关重要。
6. 通过观察动物对足底回缩反射的反应消失来确认麻醉深度。麻醉期间使用 Paralube Vet 软膏涂抹眼睛以防止干燥。
7. 在第 0 天进行手术 ^20,21。
8. 进行主动脉缩窄时，将一根锥形 26 G 针置于主动脉弓处，用 7-0 丝线围绕其结扎主动脉。
   注意：有关实验方案的详细信息，包括外科主动脉缩窄操作，已有先前文献描述 ^20,21。
9. 在第 2、6 和 13 天进行术后超声成像（见第 2 节）。
10. 在第 14 天处死小鼠，并取心脏进行组织学评估。通过过量戊巴比妥麻醉后切除心脏等重要器官的方式处死动物。使心脏停搏于舒张期，并用福尔马林固定。采用先前文献所述的心脏取材方法²²。
11. 所有心脏组织均用缓冲的 10% 福尔马林溶液固定。进行三色染色时，先将组织包埋于石蜡中再切片。三色染色的具体步骤可参考已有详细图示的文献 ^14,23。
12. 使用离线软件（见第 3 节）分析数据。

2. 成像方案

1. 室间隔冠状动脉（SCA）的长轴和短轴图像（B模式）
   1. 使用中心频率为40 MHz的MS550D探头，连接至主动端口，并将应用预设设置为“心脏成像”。
   2. 将动物仰卧于加热平台上，并通过鼻罩控制麻醉，利用轨道系统定位探头以获得胸骨旁长轴切面（PSLAX）（图1A）。始终确保动物在预热平台上保持温暖，且体温维持在生理水平。
   3. 顺时针旋转探头（缺口朝向尾侧），使探头角度相对于左侧胸骨旁线向左偏转15°（长轴切面）（图1B）。
   4. 沿探头y轴轻微倾斜，调整探头角度，以在屏幕中央获得SCA的完整纵向视图（图1B）。
   5. 当观察到正确的解剖标志（主动脉瓣和肺动脉）后，使用尽可能高的帧率进行动态图像存储。
   6. 使用“xy”轴微操纵器（图1D），调整探头位置，以获得SCA最清晰的图像。
   7. 将探头顺时针旋转90°（缺口朝向尾侧），使带缺口的一端位于中线左侧（短轴切面）（图1C）。
2. SCA的长轴和短轴图像（彩色多普勒模式）
   1. 获取或动态存储B模式图像后，点击键盘上的彩色多普勒键，开启彩色多普勒声窗（图2）。
      注：这有助于在长轴（图2A）或短轴（图2C）切面中识别冠状动脉（白色箭头指示SCA）。红色为实时显示的颜色，表示血流方向（远离主动脉瓣）。
   2. 确保聚焦深度（图像屏幕右侧黄色箭头所示）位于冠状动脉中心。
   3. 使用动态存储键，以尽可能高的帧率（>100帧/秒）记录数据。
3. SCA的脉冲波多普勒成像（PW模式）
   1. 在彩色多普勒模式下，点击PW键，可在冠状动脉上显示一条黄色指示线（图2，图中显示为红色）。
   2. 将黄色PW线置于视野中冠状动脉的中央，且其方向应与血流方向平行。注意，速度测量结果高度依赖于图像采集角度。
   3. 调整血流角度（PW角度键）和取样容积（SV键），使PW角度键≤60°，且取样容积准确覆盖SCA中心的血流信号。
   4. 使用动态存储功能，分别在1%和2.5%异氟烷条件下，捕获显示冠状动脉血流在收缩期峰值（S）和舒张期（D）速度的波形（图3A和图3B）。

3. 数据计算与分析

1. 选择速度时间积分（VTI）工具，从 图 3A 和 图 3B 所示图像中获取收缩期峰值和舒张期峰值流速。
2. 计算冠状动脉血流储备指数（CFR），即充血状态下（2.5% 异氟烷）舒张期峰值流速与基础状态（1% 异氟烷）舒张期峰值流速的比值。
3. 计算 S/D 比值，即冠状动脉收缩期峰值流速与舒张期峰值流速的比值。分别在基础状态（1% 异氟烷）和充血状态（2.5% 异氟烷）下测定该比值。
4. 对于 FS、FAC、LVM 等标准心脏功能参数，请参考设备制造商提供的手册，使用专有软件进行数据分析，或参考 Cheng 在 JoVE 上发表的论文²。

结果

在研究的11只小鼠中（结扎组 n=8，假手术组 n=3），由一名观察者在多个时间点获得了充分且可重复的图像：基线期（D-1）、D2、D6 和 D13。此外，术后第1天，结扎部位的血流速度为 2225 ± 110.9 mm/s，而假手术组小鼠为 277.5 ± 10.51 mm/s（p < 0.001）。<0.05）。流速的增加证实了压力超负荷模型的成功建立。所有小鼠在基线状态和充血状态下均成功评估了锁骨下动脉（SCA）血流速度（此处也称为冠状动脉血流速度，CF velocity）、冠状动脉血流储备（CFR）以及收缩期/舒张期流速比（S/D比）。如图所示。 图3 假手术小鼠在1%和2.5%异氟烷条件下的冠状动脉血流变化。假手术组显示基础舒张期冠状动脉血流速度约为200 mm/s，充血诱导的冠状动脉血流速度为 > 600 mm/s。所有小鼠（n = 3，p）的舒张期冠状动脉血流速度升高持续至第13天 >0.05）。如图所示 图3E和图3F 在1%和2.5%异氟烷浓度下，结扎小鼠的脑血流（CF）变化分别显示出相似的充血性（2.5%）相对于基础水平（1%）的脑...

讨论

在本项基于超声的研究中，对活体实验小鼠的冠状动脉血流进行了可重复的实时无创评估，并持续数天；此外，该方案展示了检测早期阶段冠状动脉功能障碍的潜力，该功能障碍与心肌灌注不足相关。该方法最终可被用作心血管风险分层和/或评估治疗干预反应的临床工具。

首先，本文详细描述了一种利用高频彩色多普勒超声心动图进行时间序列成像，以观察小型小鼠心脏冠状动脉解剖结构和功能变化的实验方案。通过精心选择一组具有高轴向分辨率的互补性声窗，精确调整采样容积，并严格控制麻醉条件，任何经过超声设备基本培训的操作者均可完成本成像方案中的所有建议步骤，以及后续离线数据分析。该方法可重复地显示左主冠状动脉，并可调节所观察冠状动脉的功能状态。本方案适用于心率和呼吸频率较高的小型动物，如小鼠或大鼠。通过数天或数周内的连续成像，研究者可在特定实验模型中无创、纵向地追踪冠状动脉功能变化，获得可靠的数据。

其次，该研究试图通过评估冠状动脉内生理学的微小且早期的变化（在数分钟内发生），来评价对心脏正常功能至关重要的小血管，同时结合整体心脏生理状态进行分析。例如

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
脱毛膏	Miltex, Inc.	Surgi-Prep	成像前24小时使用
异氟烷	Baxter International Inc.	NDC 10019-773-40	诱导浓度为2-3%，维持浓度为1-1.5%；心率应保持在每分钟500次以上
高频超声设备	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	Vevo 2100
高频机械换能器	FUJIFILM VisualSonics, Inc.	MS250, MS550D, MS400