利用穿透式微电极阵列在展开的海马体标本中研究神经活动传播

摘要

我们已经开发出一种 体外 保留海马神经元CA1-CA3排列的展开海马组织。结合穿透式微电极阵列，可同时在纵向和横向方向上监测神经活动。与海马脑片制备方法相比，该技术的优势在于能够同步记录整个海马内的信号传导。

摘要

本方案描述了一种制备新型 体外 结合微加工阵列的扁平海马体制备技术用于绘制海马体内的神经活动。横向海马体切片制备是研究海马体电生理学最常用的组织制备方法。此外，还开发了纵向海马体切片以研究海马体内的纵向连接。完整的小鼠海马体也可被维持 体外 因为其厚度允许足够的氧气扩散。然而，这三种制备方法均无法直接观察神经信号的传播，因为部分组织缺失或折叠。展开的完整海马体以扁平构型保留了横向和纵向的神经连接，可直接接触组织，从而全面分析海马体内信号传播的范围 体外为了有效监测细胞层的神经活动，研究人员制备并应用了一种定制的穿透式微电极阵列（PMEA）于展开的海马体上。该PMEA包含64个电极，高度为200 µm，能够记录小鼠海马体深部的神经活动。展开的海马体制备方法与PMEA的独特结合，提供了一种新的 体外 一种用于研究海马体二维CA1-CA3区域中神经活动传播速度与方向的工具，具有高信噪比。

引言

理解神经传导或神经信号的传播对于确定大脑在正常功能和病理状态下神经通讯机制至关重要^1-3。海马是大脑中被研究最为广泛的结构之一，因其在记忆、空间追踪等多种脑功能中发挥着基本作用，同时也参与多种显著影响行为的病理改变^1,6。尽管海马具有复杂的组织结构，但其结构的各个组成部分在脑片制备中可被清晰识别并易于接近^4-6。在海马的横断方向上，神经活动已知通过三突触通路传播，该通路包括齿状回（DG）、CA3、CA1和下托^4,5。人们认为，突触传递和轴突传导在此横断回路的通讯中起主要作用^4,6。然而，神经信号的传播同时发生在横断和纵向上^4,6。这意味着仅使用脑片制备难以全面研究海马，因为此类制备限制了对特定传播方向的观察⁴。纵向脑片的开发旨在研究沿纵轴的轴突通路⁵。研究人员分别观察到主要沿横断轴和纵轴出现的行为特异性伽马波和θ振荡⁶。 这些行为以往被独立研究，但要理解这些行为，同时获取两个方向的信息至关重要。即使有了完整海马制备技术的发展，由于海马自身的折叠结构，仍难以在整个组织中监测信号传播过程⁴。展开的海马制备则以二维平面细胞层的形式暴露了密集排列的神经元，从而提供了研究便利^7,8。

通过展开齿状回（DG）（图1

方案

注意：动物实验方案已通过大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本研究使用出生后10至20天（P10至P20）的CD1小鼠，性别不限。

1. 手术与实验记录用溶液

1. 配制正常人工脑脊液（aCSF）缓冲液，其成分（mM）为：NaCl 124、KCl 3.75、KH₂PO4 1.25、MgSO₄ 2、NaHCO₃ 26、Dextrose 10 和 CaCl₂ 2。该正常 aCSF 用于组织解剖后的恢复，以及实验开始前灌流系统的清洗。
2. 配制在海马体解剖过程中使用的小分子 aCSF，其成分（mM）为：Sucrose 220、KCl 2.95、NaH₂PO4 1.3、MgSO₄ 2、NaHCO₃ 26、Dextrose 10 和 CaCl₂ 2。为了在完整的海马组织制备物中诱导癫痫样活动，需将 4-氨基吡啶（4-AP）以 100 µM 的浓度加入正常 aCSF 中。

2. 完整海马制备的手术步骤

1. 将异氟烷（1 ml）滴入干燥器玻璃罐底部的腔室中（见“特定材料与设备”中的编号1），并用普通纸巾覆盖底板表面，以防止动物接触液体。随后将CD1小鼠放入罐中并盖上盖子。将动物置于密闭罐中....

结果

图中所示数据是在海马组织展开制备标本中记录的，记录时在室温（25 °C）下向孵育液中加入4-AP（100 µM）aCSF。通常情况下，神经活动在5分钟内开始，但在一些较老年动物的海马组织中可能需要更长时间。使用PMEA观察到的4-AP诱导的神经元放电与先前报道的结果一致^14,15。由于电极高度为200 µm，电极尖端位于细胞层正下方（图3C），而细胞层通常位于海马裂（alveus）上方250至300 µm处（图2），因此在样本实验的64个通道中，有57个通道的记录信号主要表现为正向偏转。然而，若记录电极尖端足够接近细胞层，则部分正向信号也可能同时出现小的负向偏转（图5B）。当电极尖端恰好位于细胞层水平时，记录到的信号将表现为非常尖锐的负向尖峰，并伴有正向偏移，或仅表现为负向尖峰（图5C）¹⁶。在本示例数据中，57个有效记录中有5个通道出现负向尖峰。在获取全部64个通道的数据后，采用单个归一化方法（图6B）沿记录的时间轴将神经信.......

讨论

通过结合穿透式微电极阵列制备展开的海马体标本，可同时保留海马体的纵向与横向轴向结构，为研究海马体内的解剖连接或神经信号传播提供了强有力的工具⁷。该展开方法同样适用于成年小鼠海马体的研究。近期利用此标本的研究表明，由4-AP诱导的癫痫样活动可在整个展开的海马体区域以对角线波前的形式传播（图6）^7,8。这些研究证明，当需要在平坦的海马神经网络中研究神经信号传播时，完整的展开海马体标本相较于横切或纵切脑片具有显著优势（图6）。

穿透式微电极相较于现有的微电极阵列（MEA）具有显著优势，后者由多个位于平坦表面的电极接触点组成^11,12,17。由于细胞层位于表面以下约250至300 µm处，平坦表面电极的MEA在用于未展开的海马体时存在使用困难（图2）。本文所述的穿透式微电极阵列（PMEA）设计了64个穿透式电极，电极高度为200 µm，可深入组织内部，适用于研究神经信号传播^7,13。此外，PMEA也可应.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
干燥器罐	LABRECYCLERS Inc.	5410	在用于动物麻醉的罐子底部放置普通纸巾。
用于展开海马体的刀片和定制手术平台	N/A	N/A	将培养皿倒置（置于中央）放入冰中，并在培养皿上放置一张湿润的滤纸。
定制组织回收室	N/A	N/A	塑料管底部用塑料网固定，并在aCSF中用95% O2 / 5% CO2混合气体持续通气。
直式操作 剪刀	Fisher Scientific	S17336B                                            Medco 仪器编号：81995	该剪刀用于   将小鼠断头处死。
Integra Miltex Goldman-Fox 剪刀	Fisher Scientific	12-460-517                        MILTEX INC                           编号：5-SC-320	该剪刀用于剪开小鼠的颅骨。
Miltex 子宫切除钳	Claflin 医疗设备	CESS-722033-00001	该镊子用于剥离切开的颅骨以暴露脑组织
微型刮勺	Cardinal Health		该微型刮铲用于将半球的整个脑组织转移至记录室。
Frey Scientific 不锈钢半微量刮勺	Cardinal Health		此半微型刮勺用于将展开的海马体转移至恢复室内的葡萄糖aCSF中。
小号画笔	Lowe's	tem #： 105657                  型号： 90219	正常油漆刷套装中尺寸最小的一支
火焰抛光玻璃辅助工具	N/A	N/A	该工具由普通巴斯德玻璃吸管制成，并经过火焰抛光。
定制玻璃针	N/A	N/A	该工具由普通巴斯德玻璃吸管制成，并经过火焰抛光。
定制玻璃工具，带金属丝环	N/A	N/A	该工具由常规的巴斯德玻璃吸管和重塑的金属丝环制成，并经过火焰抛光。
定制玻璃溶液滴管	N/A	N/A	该工具  由普通巴斯德玻璃移液管制成，将其尖端剪断，并在剪断端连接橡胶头。
定制组织固定锚	N/A	N/A	尼龙纤维网被粘附在绝缘铜丝环上。组织固定锚由显微操作器固定。
定制微电极阵列	N/A	N/A	有关该阵列的更多细节，请参见  Kibler 等，2011
为阵列定制的滤波器和放大器电路	N/A	N/A	有关该阵列的更多细节，请参见  Kibler 等，2011
数据采集处理器 3400a	Microstar Laboratories	N/A	这是一个带有模数转换器的完整数据采集系统。