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方法文章

利用穿透式微电极阵列在展开的海马体标本中研究神经活动传播

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DOI：

10.3791/52601

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2015年3月27日

 ,  ,  , 
1Neural Engineering Center, Department of Biomedical Engineering, Case Western Reserve University

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

我们已经开发出一种 体外 保留海马神经元CA1-CA3排列的展开海马组织。结合穿透式微电极阵列，可同时在纵向和横向方向上监测神经活动。与海马脑片制备方法相比，该技术的优势在于能够同步记录整个海马内的信号传导。

摘要

本方案描述了一种制备新型 体外 结合微加工阵列的扁平海马体制备技术用于绘制海马体内的神经活动。横向海马体切片制备是研究海马体电生理学最常用的组织制备方法。此外，还开发了纵向海马体切片以研究海马体内的纵向连接。完整的小鼠海马体也可被维持 体外 因为其厚度允许足够的氧气扩散。然而，这三种制备方法均无法直接观察神经信号的传播，因为部分组织缺失或折叠。展开的完整海马体以扁平构型保留了横向和纵向的神经连接，可直接接触组织，从而全面分析海马体内信号传播的范围 体外为了有效监测细胞层的神经活动，研究人员制备并应用了一种定制的穿透式微电极阵列（PMEA）于展开的海马体上。该PMEA包含64个电极，高度为200 µm，能够记录小鼠海马体深部的神经活动。展开的海马体制备方法与PMEA的独特结合，提供了一种新的 体外 一种用于研究海马体二维CA1-CA3区域中神经活动传播速度与方向的工具，具有高信噪比。

引言

理解神经传导或神经信号的传播对于确定大脑在正常功能和病理状态下神经通讯机制至关重要1-3。海马是大脑中被研究最为广泛的结构之一，因其在记忆、空间追踪等多种脑功能中发挥着基本作用，同时也参与多种显著影响行为的病理改变1,6。尽管海马具有复杂的组织结构，但其结构的各个组成部分在脑片制备中可被清晰识别并易于接近4-6。在海马的横断方向上，神经活动已知通过三突触通路传播，该通路包括齿状回（DG）、CA3、CA1和下托4,5。人们认为，突触传递和轴突传导在此横断回路的通讯中起主要作用4,6。然而，神经信号的传播同时发生在横断和纵向上4,6。这意味着仅使用脑片制备难以全面研究海马，因为此类制备限制了对特定传播方向的观察4。纵向脑片的开发旨在研究沿纵轴的轴突通路5。研究人员分别观察到主要沿横断轴和纵轴出现的行为特异性伽马波和θ振荡6。 这些行为以往被独立研究，但要理解这些行为，同时获取两个方向的信息至关重要。即使有了完整海马制备技术的发展，由于海马自身的折叠结构，仍难以在整个组织中监测信号传播过程4。展开的海马制备则以二维平面细胞层的形式暴露了密集排列的神经元，从而提供了研究便利7,8。

通过展开齿状回（DG）（图1），海马体呈现出扁平化的矩形结构，其中横行和纵行的神经连接保持完整，锥体细胞层以二维片层形式排列，包含CA3和CA1区域，从而获得一块平坦的神经组织，可用于研究神经信号的传播（图2）8。随后可使用单根玻璃微电极、微电极阵列、刺激电极以及电压敏感性染料（VSD）来监测神经活动3,7,8。此外，还可利用转基因小鼠表达的基因编码电压指示剂来追踪神经信号的传播模式9。

展开的海马网络呈扁平构型，非常适合光学方法记录，也适用于微电极阵列。大多数 commercially available 阵列采用扁平或低轮廓电极制造，可记录组织切片和培养神经元中的神经活动10-12。然而，当信号来自完整组织时，由于神经元的胞体位于组织更深层，信噪比（SNR）会降低。因此需要高长径比的微电极阵列以提高信噪比。

为此，我们实验室开发了一种穿透式微电极阵列（PMEA），可通过将64根直径为20 µm、高度为200 µm的微针插入展开的海马组织中，直接探测组织内部活动7,13。与电压敏感染料成像相比，该微电极阵列具有更高的信噪比，且在实验过程中信噪比保持稳定7,13。展开的海马组织制备技术与PMEA的结合，为研究神经信号在二维平面上的传播提供了一种新方法。利用该技术开展的实验已取得重要成果，揭示了海马中神经信号传播的机制，表明神经活动可在无突触或电突触参与的情况下独立传播7。

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方案

注意：动物实验方案已通过大学机构动物护理和使用委员会的审查和批准。本研究使用出生后10至20天（P10至P20）的CD1小鼠，性别不限。

1. 手术与实验记录用溶液

  1. 配制正常人工脑脊液（aCSF）缓冲液，其成分（mM）为：NaCl 124、KCl 3.75、KH2PO4 1.25、MgSO4 2、NaHCO3 26、Dextrose 10 和 CaCl2 2。该正常 aCSF 用于组织解剖后的恢复，以及实验开始前灌流系统的清洗。
  2. 配制在海马体解剖过程中使用的小分子 aCSF，其成分（mM）为：Sucrose 220、KCl 2.95、NaH2PO4 1.3、MgSO4 2、NaHCO3 26、Dextrose 10 和 CaCl2 2。为了在完整的海马组织制备物中诱导癫痫样活动，需将 4-氨基吡啶（4-AP）以 100 µM 的浓度加入正常 aCSF 中。

2. 完整海马制备的手术步骤

  1. 将异氟烷（1 ml）滴入干燥器玻璃罐底部的腔室中（见“特定材料与设备”中的编号1），并用普通纸巾覆盖底板表面，以防止动物接触液体。随后将CD1小鼠放入罐中并盖上盖子。将动物置于密闭罐中约1至2分钟，当呼吸频率约为每秒一次时，将小鼠从罐中取出。
  2. 将小鼠置于手术台上，使用合适的剪刀进行断头。断头后立即把头部浸入冰浴（3–4 °C）、充氧的蔗糖人工脑脊液（aCSF）中约30秒。
  3. 使用精细剪刀（见“特定材料与设备”中的编号5）去除颅骨顶部的皮肤，并沿头部中线以及靠近颞叶两端处剪开颅骨。用镊子（见“特定材料与设备”中的编号6）将切开的颅骨向头部两侧剥离，以暴露脑组织。
  4. 将微型实验铲（见“特定材料与设备”中的编号8）插入大脑顶叶与颅骨之间的缝隙，小心地将脑组织从颅底剥离，然后将其放置在预先准备好的、覆盖有湿润滤纸（见“特定材料与设备”中的编号2）的冰浴（3–4 °C）手术台上。用冰冻的刀片切除小脑，并沿脑中线切割以分离两个半球。随后将分离的两个半球放入盛有冰浴蔗糖aCSF并持续通入95% O2/5% CO2混合气体的烧杯中。
  5. 取其中一个脑半球，放置在冰浴滤纸台上。在脑组织周围放置普通纸巾或滤纸以吸除多余液体。使用两根火焰抛光的玻璃移液管工具（见“材料与设备”中的编号10）将大脑皮层与脑中央其他部分分离。
  6. 当海马体从皮层内部暴露并置于冰浴台面后，在组织上滴加2至3滴冰浴蔗糖aCSF，然后吸除海马体周围的多余液体。切断海马体两端与皮层的连接。随后使用火焰抛光的玻璃工具将海马体从脑组织中解剖出来，并去除残留的脑组织。
  7. 将完整的海马体放置，使其alveus面朝上、海马沟（hippocampal sulcus）朝下。再次快速滴加2至3滴冰浴蔗糖aCSF于组织上，并用纸巾吸除组织周围的多余液体。使用火焰抛光的玻璃工具将整个海马体翻转，以暴露海马沟（图1B、C）。
  8. 在普通光学显微镜下，将自制玻璃针（见“特定材料与设备”中的编号11）插入海马沟一端，沿沟的方向切断从齿状回（DG）至下托（subiculum）或CA1区的纤维连接（图1C）。如有必要，使用冰浴刀片修剪海马体的 septal 和 temporal 两端。将自制金属丝环（见“特定材料与设备”中的编号12）插入切开的海马沟中，在用火焰抛光玻璃工具固定海马体下托/CA1端的同时，将齿状回从组织中拉出（图1D）。
  9. 完成上述展开操作后，再向组织上滴加2至3滴冰浴蔗糖aCSF，并吸除组织周围的多余液体。随后用冰浴刀片修剪展开后海马体的边缘（图1E），并用铲子将制备好的组织转移至盛有正常aCSF、持续通入95% O2/5% CO2、室温（约25 °C）环境下的恢复室中。将展开的海马体组织在记录前静置恢复约1小时。
  10. 取另一个脑半球，重复步骤2.5至2.9。通常完成单个海马体展开操作需1至2分钟，过程中应持续滴加冰浴蔗糖aCSF，以保持组织的氧合与水合状态。

3. 实验系统设置

  1. 将定制加工的 PMEA 粘接到针栅阵列（PGA）封装上，并使用微细引线键合技术将单个微电极的每个焊盘与封装上的针脚焊盘相连（图 3B）。然后，将封装插入自制电路板上的插座中13。
  2. 在自制电路板上13，将每个微电极分别连接至带通截止频率为 1 Hz 至 4 KHz 的滤波器，以及增益为 100 的放大器。通过模数转换系统对电路板输出的模拟信号进行数字化，并在计算机上采集和存储数据。
  3. 在阵列周围粘接一个带有进液和出液管路的定制塑料记录室，用于溶液流动（图 4A）。使用至少两个瓶子在系统中保存不同溶液，并通过一个三通阀连接并控制各瓶的输出管路。将三通阀的输出端连接至带有静脉输液滴注室的管路系统，引导溶液流入记录室。
  4. 在三通阀与记录室入口之间的管路中加入电加热器，以在溶液进入记录室前将其加热至设定温度（35 °C）。将记录室的出口连接至真空管，使溶液流入与真空管相连的收集瓶中。本研究中所有实验均不得重复使用任何溶液。

4. 将展开的海马体放置于 PMEA 上以记录神经活动

  1. 准备实验装置时，将一个瓶子装入正常 aCSF，另一个瓶子装入含 4-AP 的 aCSF。从每次实验开始时，即对两个瓶子持续通入 95% O2/5% CO2 混合气体。使用三通阀连接器控制实验过程中选择的灌注液。在记录室出口连接真空管，将废液抽入废液容器中。在溶液进入记录室之前对其进行加热，并维持溶液在受控温度（35 °C）。
  2. 当记录室的进液口和出液口关闭后，使用自制的玻璃移液管将展开的海马体转移并放置于记录室内。在显微镜下，当组织漂浮在溶液中时，使用普通的小号画笔小心调整展开海马体的位置。将海马体的alveus面朝下放置，CA3区朝远离研究者方向，CA1区朝向研究者。
  3. 使用真空移液器从记录室边缘小心吸除室内溶液，降低液面直至记录室干燥，使组织自然沉降到电极阵列上。随后，小心地将自制的组织固定锚（图4）（详见“特定材料与设备”中的编号14）放置在组织上方，以固定展开的海马体。向记录室中滴加数滴溶液以重新充满腔室，然后逐渐打开进液口和出液口，调节流速至静脉输液室中约每秒两滴的水平。
  4. 先用正常 aCSF 在记录室中孵育组织约 1 分钟，使其恢复，随后切换为含 4-AP 的 aCSF 溶液，并适当调节流速。在含 4-AP 的 aCSF 中继续孵育组织约 5 至 10 分钟，待出现自发性电活动后，研究者即可启动软件开始记录信号。

5. 实验结束后从PMEA上移除组织

  1. 通过显微操作器控制组织锚定装置，逐渐将组织从记录室中提起。关闭进液口和出液口，以停止记录室内的液体流动。记录室应充满溶液；若未充满，则添加数滴溶液以填满记录室。
  2. 使用小号画笔轻轻挑起组织的每个角落。如果组织未在溶液中漂浮，则使用真空管小心吸干记录室中的液体，同时保持组织仍位于阵列上。然后缓慢打开进液口，逐渐重新注满记录室，当记录室充满后关闭进液口以停止液体流动。再次使用小号画笔轻轻挑起组织的每个角落。
  3. 重复步骤5.2，直至组织完全从阵列上脱离并在溶液中自由漂浮。一旦组织开始漂浮，即使用真空管将其吸除。打开进液口的液体流动，并打开出液口的真空装置。用蒸馏水冲洗系统，然后将其干燥。

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结果

图中所示数据是在海马组织展开制备标本中记录的，记录时在室温（25 °C）下向孵育液中加入4-AP（100 µM）aCSF。通常情况下，神经活动在5分钟内开始，但在一些较老年动物的海马组织中可能需要更长时间。使用PMEA观察到的4-AP诱导的神经元放电与先前报道的结果一致14,15。由于电极高度为200 µm，电极尖端位于细胞层正下方（图3C），而细胞层通常位于海马裂（alveus）上方250至300 µm处（图2），因此在样本实验的64个通道中，有57个通道的记录信号主要表现为正向偏转。然而，若记录电极尖端足够接近细胞层，则部分正向信号也可能同时出现小的负向偏转（图5B）。当电极尖端恰好位于细胞层水平时，记录到的信号将表现为非常尖锐的负向尖峰，并伴有正向偏移，或仅表现为负向尖峰（图5C）16。在本示例数据中，57个有效记录中有5个通道出现负向尖峰。在获取全部64个通道的数据后，采用单个归一化方法（图6B）沿记录的时间轴将神经信...

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讨论

通过结合穿透式微电极阵列制备展开的海马体标本，可同时保留海马体的纵向与横向轴向结构，为研究海马体内的解剖连接或神经信号传播提供了强有力的工具7。该展开方法同样适用于成年小鼠海马体的研究。近期利用此标本的研究表明，由4-AP诱导的癫痫样活动可在整个展开的海马体区域以对角线波前的形式传播（图6）7,8。这些研究证明，当需要在平坦的海马神经网络中研究神经信号传播时，完整的展开海马体标本相较于横切或纵切脑片具有显著优势（图6）。

穿透式微电极相较于现有的微电极阵列（MEA）具有显著优势，后者由多个位于平坦表面的电极接触点组成11,12,17。由于细胞层位于表面以下约250至300 µm处，平坦表面电极的MEA在用于未展开的海马体时存在使用困难（图2）。本文所述的穿透式微电极阵列（PMEA）设计了64个穿透式电极，电极高度为200 µm，可深入组织内部，适用于研究神经信号传播7,13。此外，PMEA也可应...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国立卫生研究院（国家神经疾病与卒中研究所）资助（项目编号：1R01NS060757-01），并得到多米尼克·M·杜兰德（Dominique M. Durand）所获E.L.林德斯特捐赠讲席的支持。我们感谢安德鲁·M·罗林斯（Andrew M. Rollins）博士实验室在OCT成像方面提供的帮助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
干燥器罐LABRECYCLERS Inc.5410在用于动物麻醉的罐子底部放置普通纸巾。 
用于展开海马体的刀片和定制手术平台N/AN/A将培养皿倒置（置于中央）放入冰中，并在培养皿上放置一张湿润的滤纸。 
定制组织回收室N/AN/A塑料管底部用塑料网固定，并在aCSF中用95% O2 / 5% CO2混合气体持续通气。
直式操作 剪刀Fisher ScientificS17336B                                            Medco 仪器编号：81995 该剪刀用于   将小鼠断头处死。
Integra Miltex Goldman-Fox 剪刀Fisher Scientific12-460-517                        MILTEX INC                           编号：5-SC-320该剪刀用于剪开小鼠的颅骨。 
Miltex
子宫切除钳		Claflin 医疗设备CESS-722033-00001该镊子用于剥离切开的颅骨以暴露脑组织
微型刮勺Cardinal Health该微型刮铲用于将半球的整个脑组织转移至记录室。 
Frey Scientific 不锈钢半微量刮勺Cardinal Health此半微型刮勺用于将展开的海马体转移至恢复室内的葡萄糖aCSF中。
小号画笔Lowe'stem #： 105657                  型号： 90219正常油漆刷套装中尺寸最小的一支
火焰抛光玻璃辅助工具N/AN/A该工具由普通巴斯德玻璃吸管制成，并经过火焰抛光。
定制玻璃针N/AN/A该工具由普通巴斯德玻璃吸管制成，并经过火焰抛光。
定制玻璃工具，带金属丝环N/AN/A该工具由常规的巴斯德玻璃吸管和重塑的金属丝环制成，并经过火焰抛光。
定制玻璃溶液滴管N/AN/A该工具  由普通巴斯德玻璃移液管制成，将其尖端剪断，并在剪断端连接橡胶头。
定制组织固定锚N/AN/A尼龙纤维网被粘附在绝缘铜丝环上。组织固定锚由显微操作器固定。 
定制微电极阵列N/AN/A有关该阵列的更多细节，请参见  Kibler 等，2011 
为阵列定制的滤波器和放大器电路N/AN/A有关该阵列的更多细节，请参见  Kibler 等，2011 
数据采集处理器 3400aMicrostar LaboratoriesN/A这是一个带有模数转换器的完整数据采集系统。

参考文献

  1. Richardson, K. A., Schiff, S. J., Gluckman, B. J. Control of traveling waves in the Mammalian cortex. Phys Rev Lett. 94 (2), 028103-028112 (2005).
  2. Luhmann, H. J., Dzhala, V. I., Ben-Ari, Y. Generation and propagation of 4-AP-induced epileptiform activity in neonatal intact limbic structures in vitro. Eur J Neurosci. 12 (8), 2757-2768 (2000).
  3. Grinvald, A., Manker, A., Segal, M. Visualization of the spread of electrical activity in rat hippocampal slices by voltage-sensitive optical probes. J Physiol. 333, 269-291 (1982).
  4. Gloveli, T., et al. Orthogonal arrangement of rhythm-generating microcircuits in the hippocampus. Proc Natl Acad Sci USA. 102 (37), 13295-13300 (2005).
  5. Amaral, D. G., Witter, M. P. The three-dimensional organization of the hippocampal formation: a review of anatomical data. Neuroscience. 31 (3), 571-591 (1989).
  6. Albani, S. H., McHail, D. G., Dumas, T. C. Developmental studies of the hippocampus and hippocampal-dependent behaviors: insights from interdisciplinary studies and tips for new investigators. Neurosci Biobehav Rev. 43, 183-190 (2014).
  7. Zhang, M., et al. Propagation of Epileptiform Activity Can Be Independent of Synaptic Transmission, Gap Junctions, or Diffusion and Is Consistent with Electrical Field Transmission. J Neurosci. 34 (4), 1409-1419 (2014).
  8. Kibler, A. B., Durand, D. M. Orthogonal wave propagation of epileptiform activity in the planar mouse hippocampus in vitro. Epilepsia. 52 (9), 1590-1600 (2011).
  9. Wang, D., McMahon, S., Zhang, Z., Jackson, M. B. Hybrid voltage sensor imaging of electrical activity from neurons in hippocampal slices from transgenic mice. J Neurophysiol. 108 (11), 3147-3160 (2012).
  10. Wingenfeld, K., Wolf, O. T. Stress , memory, the hippocampus. Front Neurol Neurosci. 34, 109-121 (2014).
  11. Liu, J. S., et al. Spatiotemporal dynamics of high-K+-induced epileptiform discharges in hippocampal slice and the effects of valproate. Neurosci Bull. 29 (1), 28-36 (2013).
  12. Oka, H., Shimono, K., Ogawa, R., Sugihara, H., Taketani, M. A new planar multielectrode array for extracellular recording: application to hippocampal acute slice. J Neurosci Methods. 93, 61-68 (1999).
  13. Kibler, A. B., Jamieson, B. G., Durand, D. M. A high aspect ratio microelectrode array for mapping neural activity in vitro. J Neurosci Methods. 204 (2), 296-305 (2012).
  14. Schechter, L. E. The potassium channel blockers 4-aminopyridine and tetraethylammonium increase the spontaneous basal release of [3H]5-hydroxytryptamine in rat hippocampal slices. J Pharmacol Exp Ther. 282 (1), 262-270 (1997).
  15. Perreault, P., Avoli, M. 4-aminopyridine-induced epileptiform activity and a GABA-mediated long-lasting depolarization in the rat hippocampus. J Neurosci. 12 (1), 104-115 (1992).
  16. Chesnut, T. J., Swann, J. W. Epileptiform activity induced by 4-aminopyridine in immature hippocampus. Epilepsy Res. 2 (3), 187-195 (1988).
  17. Nam, Y., Wheeler, B. C. In Vitro Microelectrode Array Technology and Neural Recordings. Crit Rev Biomed Eng. 39 (1), 45-62 (2011).
  18. Gonzalez-Sulser, A., et al. Hippocampal neuron firing and local field potentials in the in vitro 4-aminopyridine epilepsy model. J Neurophysiol. 108 (9), 2568-2580 (2012).

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