生物膜与生境异质性协同发育的表征方法

摘要

生物膜与其周围环境之间存在复杂的相互作用。为了全面研究生物膜与环境之间的相互作用，本文介绍了一系列方法，用于构建有利于生物膜生长的异质化学环境，量化局部流速，以及分析生物膜菌落内部及周围的物质传输过程。

摘要

生物膜是附着在表面的微生物群落，具有复杂的结构并产生显著的空间异质性。生物膜的发育受到周围流体环境和营养条件的强烈调控。生物膜的生长还会通过产生复杂的流场和溶质传输模式，进一步增加局部微环境的异质性。为了研究生物膜中异质性的形成过程及其与局部微生境之间的相互作用，我们在微流控流动池中构建了铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）的单物种生物膜，以及铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）与大肠杆菌（Escherichia coli）的双物种生物膜，并施加营养梯度条件。我们提供了在流动池内建立营养梯度、并在该条件下培养和观察生物膜发育的详细实验方案。此外，还介绍了多种光学方法的操作流程，用于量化生物膜结构中的空间分布模式、生物膜表面的流体分布，以及生物膜群落周围和内部的质量传输情况。这些方法可支持对生物膜与生境异质性协同发育的全面研究。

引言

微生物会附着在表面并形成生物膜——即被胞外聚合物基质包裹的细胞聚集体¹。由于生物膜内部存在显著的空间异质性，这种异质性由溶质在内部传输受限以及细胞代谢活动在空间上的差异共同导致，因此生物膜的行为与单个微生物细胞截然不同^2,3。在生物膜与周围流体的界面处，氧气和营养物质的浓度急剧下降，并在生物膜内部进一步耗尽²。生物膜的呼吸作用和蛋白质合成也可能因局部氧气和营养物质的可利用性不同而出现空间上的差异²。

在水体和土壤环境中，大多数细菌生活在生物膜中。天然生物膜执行重要的生物地球化学过程，包括碳和氮的循环以及金属的还原^4,5。在临床方面，生物膜的形成导致肺部和泌尿系统长期感染⁶。与浮游状态的细菌相比，生物膜中的细胞对抗菌剂具有极高的抗性，因此与生物膜相关的感染极具挑战性⁶。由于生物膜在多种环境中具有重要意义，大量研究致力于理解调控生物膜活性的环境因素，以及生物膜及其周围微环境中的空间异质性。

先前的研究发现，生物膜的发育受到多种环境因素的强烈调控：在不同的流动条件下，生物膜会形成不同的形态结构；氧气和营养物质的可利用性会影响生物膜的形态；流体动力剪切应力则影响浮游细胞向表面的附着以及细胞从生物膜上的脱离^7-9。此外，外部流动条件还影响底物向生物膜内部及其内部的传递过程¹⁰。生物膜的生长也会改变其周围的物理和化学环境。例如，生物膜的生长会导致局部氧气和营养物质的耗竭²；生物膜会从周围环境中富集无机和有机化合物¹¹；生物膜聚集体能够改变流体方向并增加表面摩擦阻力^12,13。由于生物膜与其周围环境之间存在极为复杂的相互作用，因此同时获取生物膜特性与环境条件的信息至关重要，需要采用多学科方法来全面表征生物膜与环境之间的相互关系。

本文介绍一系列整合方法，用于表征在施加营养梯度条件下单物种和双物种生物膜内微生物生长的空间模式，并观察由此引起的局部化学与流体微环境的变化。我们首先描述一种 recently developed 双入口微流控流动池的使用方法，以在明确定义的化学梯度下观察生物膜的生长。随后，我们展示利用该微流控流动池观察两种细菌物种生长的过程， 铜绿假单胞菌 和 大肠杆菌，在多种营养条件下生物膜中的情况。我们展示了如何 原位 通过荧光示踪剂在生物膜菌落中的传播可视化，可用于定量评估生物膜内溶质传输的模式。最后，我们展示了如何在共聚焦显微镜下进行微尺度粒子示踪测速，以获取生长中生物膜周围局部的流场信息。

方案

1. 流通池设置与接种

注意：使用 Song 中描述的双入口微流控流动池 等, 2014¹⁴ 用于培养生物膜。该流动池能够形成明确且平滑的化学梯度。流动池的设计如图所示。 图1 流式池的制备方法此前已在 Song 中有描述 等, 2014¹⁴在此，我们详细阐述所采用的方法 P. aeruginosa 和 E. coli 形成生物膜，但其他物种也可能适用。我们使用了 P. aeruginosa PAO1-gfp，以持续表达绿色荧光蛋白（GFP）的模式生物作为生物膜发育的研究模型。此外，我们还使用了 E. coli DH5α 形成混合物种生物膜 P. aeruginosa. P. aeruginosa 且 E. coli 菌株在LB琼脂平板上培养。

1. 采用氧等离子体处理将聚二甲基硅氧烷（PDMS）键合至玻璃盖玻片上，制备流式细胞室，具体方法如文献¹⁴所述。流式细胞室腔体的尺寸为23 mm × 13 mm × 0.24 mm（长 × 宽 × 深）。
2. 制备改良FAB培养基¹⁵。为在流式细胞室内观察营养梯度下的生物膜生长，从一个入口引入含0.6 μM葡萄糖的改良FAB培养基¹⁵，从另一入口引入不含任何碳源的FAB培养基。在加入FAB培养基前，需对葡萄糖储备液（60 mM）进行过滤除菌（滤膜孔径 = 0.2 μm）。使用前还需将FAB培养基经高压灭菌（程序1：液体，15分钟；121 °C，17 psi）。
3. 对流式系统进行灭菌。接种前，除位于流式细胞室上游的塑料三通阀（一次性且预灭菌）外，其余整个流路（培养基瓶、管路、气泡捕集器、流式细胞室）均需采用程序1进行高压灭菌。（三通阀用于注入菌液、荧光示踪剂和微珠。）为避免组装过程中污染，高压灭菌前应使用铝箔或灭菌袋覆盖所有管路和连接口的开口处。
4. 连接流式系统。仔细组装流式细胞系统各组件（参见视频中的系统组装过程），并通过蠕动泵将培养基输送至流式细胞室，以精确控制流速。
5. 接种前准备菌液：从LB平板上挑取一单菌落的P. aeruginosa或E. coli接种至3 ml LB液体培养基中，在37 °C、225 rpm条件下振荡培养过夜。将过夜培养物用1 ml无菌水稀释至终浓度OD₆₀₀ = 0.01，作为接种液。（在超净工作台中进行细菌培养与稀释操作，以防污染。）
6. 进行多物种生物膜实验时，将两种细菌培养物按1:1比例混合，并分别调整至每种细菌的OD₆₀₀ = 0.01，总体积为1 ml。
7. 接种流式细胞室。通过三通阀向流式细胞室入口注入1 ml接种液。注射后暂停流动1小时，使细菌细胞附着于盖玻片表面。（确保流式细胞室放置时盖玻片一侧朝下，以便悬浮细胞沉降到盖玻片上。）
8. 1小时后恢复流动，以每个入口0.03 ml/min的恒定流速向流式细胞室持续泵入培养基，持续3天。

2. 利用共聚焦显微镜表征营养梯度下生物膜发育的过程

注意：P. aeruginosa 可通过组成型表达的绿色荧光蛋白（GFP）进行成像，但混合物种生物膜中的E. coli必须通过复染法进行成像。

1. 使用共聚焦显微镜观察培养3天的生物膜。在代表性结果中，使用配备63倍物镜的共聚焦显微镜观察生物膜。成像前，在双入口流动池的盖玻片侧用网格标记。（此网格的作用是帮助实验者定位流动池腔室内的成像区域。）
2. 进行复染时，将10 μl细胞通透性红色荧光核酸染料（如STYO 62，绿色荧光核酸染料）储备液（1 mM）加入990 μl无菌水中稀释，然后通过上游三通阀用注射器缓慢将稀释后的染料注入流动池腔室。使流动池静置并在避光条件下孵育30分钟，随后恢复流速，冲洗15分钟以去除未结合的染料。
3. 进行共聚焦成像。激活488 nm氩离子激光器作为激发光源，并设置GFP（500–535 nm）和核酸染料（对于绿色荧光核酸染料，650–750 nm）的发射光采集通道。调节两个通道的增益和偏移值，以获得明亮且清晰的图像。选择xyz模式及同步成像模式。使用z轴控制旋钮确定视野中生物膜的底部和顶部位置。将z轴步进设为0.5 μm，以采集三维图像堆栈。（为确保高图像质量，图像采集时采用四次线平均。）
4. 为绘制生物膜在流动池内发育的空间模式图，沿流动池入口处三个或更多纵向（x）位置，以及相对于施加的营养梯度的三个横向（y）位置进行生物膜成像，如图1所示。

3. 通过保守性荧光示踪剂注射表征内部溶质运输

注意：可以使用一种保守性荧光示踪剂（如 Cy5）来表征生物膜内的溶质传输模式。

1. 将Cy5（单反应性NHS酯）溶于水中，配制成终浓度为10 mg/ml的储备液。将Cy5储备液保存于-20 °C冰箱中。
   注意：由于Cy5对光敏感，储存、稀释和注射Cy5溶液时均需避光操作。
2. 在注射荧光示踪剂之前，使用共聚焦显微镜（配备63倍物镜）对培养3天的生物膜进行三维图像采集。（大面积的生物膜菌落区域适合用于观察染料运输的时间序列变化。）同时选择一个菌落分布较为分散的z平面进行成像（如图5A所示）。
3. 每项Cy5注射实验中，取2 μl Cy5储备液加入998 μl无菌水中，配制成浓度为20 μg/ml的注射溶液。
4. 暂停泵流以停止流动，通过三通阀使用注射器将Cy5溶液注入流式细胞池的上游端。（注射过程中应避免气泡进入流路。反向注射时应保持气泡捕获装置处于开放状态。）
5. 注射Cy5溶液后，关闭气泡捕获装置，调节三通阀，并重新启动泵，使注射的Cy5溶液进入流式细胞池。
6. 将共聚焦成像模式切换至xyt模式。在同步成像模式下激活Cy5和GFP通道。调整Cy5信号的共聚焦参数（激光强度、增益和偏移），避免信号饱和，这对定量分析至关重要。（高时间分辨率有助于清晰观察染料渗透过程，但快速扫描会降低图像质量。）选择合适的扫描速度和线平均次数，以平衡成像时间分辨率与图像质量。本方案推荐使用4次线平均，帧速率为0.15 Hz。
7. 恢复流动，将Cy5送入流式细胞池（流速仍保持0.03 ml/min），同时开始时间序列共聚焦成像。
8. 通过在二维圆形生物膜菌落内对Cy5强度进行径向平均，量化Cy5的渗透情况。具体操作如下：首先确定生物膜簇的边缘，然后生成该簇二维截面的距离图，最后对Cy5强度的径向分布进行平均，生成渗透曲线（见图 6）。
   1. 为实现步骤3.8的计算分析，可使用BioSPA（生物膜空间模式分析）软件包（未发表，软件及使用手册可应要求提供）或其他图像分析程序。
   2. 使用BioSPA时，首先将图像集导入软件，然后为GFP和Cy5通道选择合适的阈值以生成二值图像。在分析/计算菜单中选择“高级分析”，然后选择“扩散分析”。利用GFP通道定义菌落边缘，并使用多边形工具选择一个菌落作为感兴趣区域（ROI）。
   3. 双击选定的生物膜菌落以执行扩散分析。保存扩散分析结果，并利用标准曲线将Cy5强度校准为Cy5浓度。
      1. 为建立Cy5浓度标准曲线，需在共聚焦显微镜下测量不同Cy5浓度梯度下的Cy5强度。（Cy5强度与浓度呈线性关系。）

4. 通过追踪荧光粒子表征周围流场

注意：可以使用荧光微球等荧光颗粒来表征生物膜周围的流场。通过粒子示踪测速软件分析颗粒位置的时间序列观测数据，可计算生物膜周围的流场。本实验中所示结果使用 Streams 2.02 软件包¹⁶ 获得（软件下载地址及用户指南请访问 http://www.civil.canterbury.ac.nz/streams.shtml）。

1. 将荧光微珠（直径约 1 μm）用无菌水稀释至最终固含量为 0.2%、终体积为 0.5 ml。涡旋振荡以确保微珠充分分散。
2. 按照步骤 3.3 至 3.5 的操作流程，将稀释后的荧光微珠注入并输送至流动池中。为准确追踪颗粒路径，请使用相对较低的流速（本文所示颗粒追踪结果采用 0.01 ml/hr）。
3. 将共聚焦显微镜设置切换至 xyt 模式，以在单一 z 层面追踪颗粒运动，并采集时间序列图像。（本文展示的代表性结果使用了 1 Hz 的帧率。）在不同 z 位置重复进行颗粒注入与成像，以构建三维流场。
4. 使用 ImageJ（软件下载及使用手册见 http://imagej.nih.gov/ij/）或其他程序对时间序列共聚焦图像进行预处理，减去背景荧光信号（即图像序列中首幅图像的信号）。
5. 在 ImageJ 中打开图像序列的第一幅图像，然后导入整个图像序列。在“Process / Image Calculator”下，用图像序列减去第一幅图像。保存预处理后的图像序列。
6. 为计算流速矢量，将时间序列共聚焦图像导入 Streams 2.02 软件。在“Open process view”中，选择并执行“Identify particles”。使用适当的阈值识别颗粒；对于 1 μm 颗粒，建议将最小和最大直径阈值分别设为 0.5 和 5 μm。
7. 随后在“Open process view”中，选择并执行“PTV analysis pipeline”以生成颗粒运动轨迹。检查颗粒轨迹是否真实反映颗粒运动。最后，选择并执行“Create velocity field”，生成流速矢量图。

结果

双入口微流控流动池可实现对生物膜在流动腔内由两种溶液混合形成的明确定义的化学梯度下的生长情况进行观察。该化学梯度此前通过染料注入法进行观测，并由 Song et al.¹⁴ 进行了详细表征。如图1所示，横向方向上形成了平滑的浓度梯度。浓度分布曲线在入口附近较陡，随着向下游扩散而逐渐趋于平缓（图1）。为观察生物膜在营养梯度条件下的发育情况，我们采用一种定义明确的最低培养基（FAB培养基），仅向其中一个入口添加葡萄糖作为唯一碳源。这在流动池腔内形成了葡萄糖梯度，而其他所有营养物质则均匀分布。铜绿假单胞菌（P. aeruginosa）PAO1 生物膜的生长与局部葡萄糖供给量密切相关（图2）。由于在入口附近的横向葡萄糖浓度梯度较陡，生物膜生物量从高葡萄糖区域到低葡萄糖区域急剧下降。随着向下游方向葡萄糖梯度逐渐平缓，生物膜生物量分布也趋于均一。我们进一步展示了该流动池用于研究在葡萄糖梯度下 P. aeruginosa 与 E. coli 在生物膜中共生相...

讨论

我们展示了一系列方法，用于表征生物膜与环境相互作用的三个重要方面：生物膜对化学梯度的响应、生物膜生长对周围流动微环境的影响，以及由内部传质限制导致的生物膜异质性。

我们首次展示了利用一种新型微流控流动池来施加明确定义的化学梯度，以促进生物膜的形成。为了在流动池内建立明确的化学梯度，必须保持两个入口的流速一致。请确保蠕动泵对两个流动通道均调节得当，使培养基以相同的速率输送。同时，在生物膜生长过程中需确保流路中无堵塞现象。在该流动池中对双物种生物膜生长的观察表明，化学梯度显著影响了生物膜的生长及其内部的种间相互作用。由于传质限制、化学结合与反应以及微生物的摄取和代谢等因素的共同作用，化学梯度在生物膜生长的自然环境中普遍存在^18-20。该微流控流动池能够在单个装置内，在明确定义的化学条件范围内，实现对多种生物膜活性的研究。例如，已有研究证明该流动池可用于在抗菌剂浓度梯度下研究生物膜的杀灭过程¹⁴。

随后，我们展示了利用粒子示踪测速技术来观测生物膜簇周围流场的方法。为了确保准确追踪注入的荧光...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
蠕动泵	Gilson	Miniplus 3	流动池装置与接种
泵管 0.50 mm OVC，橙色/黄色	Gilson	F117934	流动池装置与接种
带旋转公鲁尔锁的三通旋塞阀	Smiths Medical	MX9311L	流动池装置与接种
用于太阳能板制造的Sylgard 184太阳能电池封装材料	ML Solar LLC		流动池装置与接种
Pyrex中号瓶，1 L，GL45	VWR	16157-191	流动池装置与接种
C-FLEX管	Cole-Parmer	06422-02	流动池装置与接种
1 ml TB注射器	BD	309659	流动池装置与接种
聚合物管	IDEX	1520G	流动池装置与接种
无菌Intramedic鲁尔短接头适配器	Clay Adams	427564	流动池装置与接种
PrecisionGlide针头	BD	305195	流动池装置与接种
分光光度计	HACH		流动池装置与接种
注射器滤器——无菌（0.2 μm）	Fisherbrand	09-719A	流动池装置与接种
MAXQ摇床	Thermo Scientific		流动池装置与接种
硫酸铵	Sigma Aldrich	A4418	培养基
无水磷酸氢二钠	Sigma Aldrich	RES20908-A7	培养基
磷酸二氢钾	Sigma Aldrich	P5655	培养基
氯化钠	Sigma Aldrich	S7653	培养基
氯化镁	Sigma Aldrich	M8266	培养基
氯化钙	Sigma Aldrich	C5670	培养基
二水合硫酸钙	Sigma Aldrich	C3771	培养基
七水合硫酸亚铁	Sigma Aldrich	215422	培养基
一水合硫酸锰(II)	Sigma Aldrich	M7634	培养基
硫酸铜(II)	Sigma Aldrich	451657	培养基
七水合硫酸锌	Sigma Aldrich	Z0251	培养基
七水合硫酸钴(II)	Sigma Aldrich	C6768	培养基
钼酸钠	Sigma Aldrich	243655	培养基
硼酸	Sigma Aldrich	B6768	培养基
葡萄糖	Sigma Aldrich	D9434	培养基
LB肉汤（Luria Bertani Broth）	Sigma Aldrich	L3022	培养基
TCS SP2共聚焦显微镜	Leica		荧光成像
SYTO 62	Life Technology	S11344	荧光成像
Cy5	GE Healthcare Life Sciences	PA15100	荧光成像
红色荧光（580/605）FluoSphere	Life Technology	F-8801	荧光成像
BioSPA	Packman Lab		图像处理
ImageJ	NIH		图像处理
Volocity	PerkinElmer		图像处理
Streams 2.02	University of Cantebury		图像处理