原发性肿瘤和MEF细胞分离用于肺转移研究

摘要

本实验方案的目的是研究乳腺肿瘤的发生。通过该技术，可切除小鼠乳腺肿瘤并从肿瘤组织中分离制备原代细胞。本方案还包括肺组织提取步骤，用于研究肺转移。此外，还提供了从小鼠胚胎中分离分析小鼠胚胎成纤维细胞的另一套实验方案。

摘要

在乳腺肿瘤发生过程中，疾病的转移阶段对患者构成最大威胁。基因型发生改变的正常乳腺细胞现在具备了侵袭其他组织并在其中存活的能力。在本方案中，将切除小鼠乳腺肿瘤，并从肿瘤组织中制备原代细胞。通过该操作分离得到的细胞可用于基因表达谱分析实验。为了成功发生转移，这些细胞必须能够侵入血管、在循环系统中存活、穿出血管到达远端器官，并在新的器官环境中存活下来。肺是乳腺癌转移的典型靶器官。已发现一组基因可介导转移对肺组织的选择性。本文描述了一种利用基因工程小鼠模型研究肺转移的方法。此外，还包括一种从小鼠胚胎中分离小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）的实验方案。来自同种动物的MEF细胞为非癌细胞的基因表达提供了线索。综合而言，这些技术在研究小鼠乳腺肿瘤发生、相关信号机制以及胚胎发育异常的通路方面具有重要应用价值。

引言

转移是乳腺癌进展的最后一步¹。该过程包括一系列步骤，恶性细胞从原发肿瘤中释放并扩散至其他器官²。这些细胞必须能够侵入血管、在循环中存活、迁移到远端器官并在此新器官系统中存活³。肿瘤发生过程中的每一步均由细胞通过多种遗传和表观遗传改变进行严密调控⁴。为了研究乳腺癌肿瘤发生的机制，研究人员已采用小鼠模型，因其寿命短、体型小且繁殖周期快。在癌症研究中使用小鼠模型的一些主要优势在于其与人类在分子和生理上的高度相似性⁵。

已建立的小鼠和人类细胞系在乳腺癌研究中被广泛使用。尽管利用这些细胞可以获得有关转移过程某些步骤的信息，但通过基因改造的动物模型（携带肿瘤抑制基因/癌基因）能够提供关于从胚胎阶段开始的肿瘤发生和转移的更为详尽的信息。因此，利用这些小鼠模型，我们可以获得肿瘤生长过程中的遗传和发育调控机制。此外，肿瘤微环境在肿瘤细胞基因表达中也起着重要作用，而使用已建立的细胞系进行研究时，往往难以模拟出相同的生物学情境。原代人乳腺肿瘤也可用于研究小鼠乳腺肿瘤的发生。使用分离的乳腺肿瘤的主要缺点在于，新植入的肿瘤缺乏小鼠自身的血管系统和淋巴组织。相比之下，用于研究乳腺肿瘤发生的遗传性小鼠模型系统则能够让我们监测转移的各个步骤，分析肿瘤微环境，并对整个机体进行系统性观察⁵。

本实验方案的总体目标是研究小鼠中的....

方案

所有小鼠实验均按照路易斯安那州立大学医学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）批准的协议进行。所有器械在解剖前必须经过高压灭菌。

1. 小鼠乳腺肿瘤原代细胞的制备

1. 使用经基因工程改造的小鼠模型，该模型携带小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT转基因小鼠），可如先前所述自发形成肿瘤 ⁶.
2. 使用异氟烷（99.9%）处死小鼠，并喷洒75%乙醇以确保无菌环境（图1A).
3. 从尿道口区域开始，用剪刀向颈部方向剪开皮肤。将皮肤固定，以便于暴露和接触器官。图1B).
4. 分离乳腺肿瘤组织，用冷的无菌磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤图1C).
5. 将肿瘤转移至无菌的10 cm组织培养皿中，使用无菌剃刀片和剪刀将其切成约1 mm大小的组织块³ 组织块。后续步骤应在无菌超净工作台中进行。
6. 将切碎的肿瘤组织与溶于无血清DMEM培养基的胶原酶在37 °C、摇床上孵育2小时，胶原酶终浓度为1 mg/ml。将肿瘤组织悬液在300 × g离心3分钟 200 × g
   注意：胶原酶孵育对于组织的酶解离至关重要。
7. 弃去上清液，用 PBS（pH 7.4）洗涤沉淀物 3 次，每次离心 3 分钟 在200 × g条件下离心。最....

结果

处死动物的时间点取决于具体研究设计和IACUC指南。在图1A中，一只携带小鼠乳腺肿瘤病毒多瘤病毒中T抗原（MMTV-PyMT）的100日龄C57BL/6小鼠在三个月龄时被处死。用剪刀从尿道口区域向颈部剪开皮肤，并将皮肤固定，以便于暴露器官，如图1B所示。这使得可以方便地获取肿瘤，如图1C所示。从肿瘤中获得的原代细胞如图1D所示。由于多种基因介导乳腺癌向肺转移¹，我们提取了肺组织（图2A）以研究转移过程。肺组织用Z-fix固定液灌注，并用印度墨水染色（图2B），以可视化肿瘤结节。图3展示了从小鼠FVB品系胚胎中分离得到的小鼠胚胎成纤维细胞。

讨论

本方案用于从新鲜的小鼠肿瘤中分离原代细胞。通过该方法制备的裂解液可用于蛋白质、DNA和RNA分析。原发性乳腺肿瘤的癌细胞常转移至脑、肺和骨骼¹。本文还包括一种用于检测转移的肺组织提取技术。使用墨水染色肺组织可使肿瘤结节可视化，如图2B所示。将肺组织固定于Z-fix溶液中，可制备肺组织切片，并使用适用于研究转移机制的抗体进行染色。此外，本文还提供了一种小鼠胚胎成纤维细胞的分离方案。该方法可用于在同一动物类型中比较原发性肿瘤细胞与胚胎成纤维细胞的基因表达。

在原代细胞和MEF的制备过程中，最关键的步骤是组织的切碎。如果未能充分切碎，将导致细胞数量偏低。若获得的细胞数较少，仍可继续按照方案操作，但需要延长细胞培养时间。在肺组织提取过程中，适当的染色与脱色至关重要，以便观察肿瘤结节。若要从肺组织中提取RNA/蛋白质，建议使用未经染色和固定的肺组织。然而，RNA也可从固定过的组织中提取⁸。

由于乳腺癌的转移阶段对患者构成最大威胁²，因此可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM	HyClone	SH30243.01	4 °C 保存
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life  technologies	25300-062	–20 °C 保存
IV型胶原酶	Sigma-Aldrich	C5138	–20 °C 保存
透明质酸酶	Sigma-Aldrich	H3506	–20 °C 保存
青霉素-链霉素溶液（Pen Strep）	Life  technologies	15140-122	4 °C 保存
胎牛血清（FBS）	Gemini Bio-Products	100-106	–80 °C 保存
Z-fix	ANATECH	#174	室温保存
印度墨水	Yasutomo		室温保存
AERRANE（异氟烷）	Baxter	NDC 10019-773-60	室温保存
乙醇	EMD	AX0441-3	室温保存