方法文章

活体人眼中小梁网对眼压升高的反应

DOI：

10.3791/52611

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2015年6月20日

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1Department of Ophthalmology, UPMC Eye Center, Eye and Ear Institute, Ophthalmology and Visual Science Research Center, University of Pittsburgh School of Medicine, 2Department of Bioengineering, Swanson School of Engineering, University of Pittsburgh, 3The McGowan Institute for Regenerative Medicine, University of Pittsburgh School of Medicine, 4Deptartment of Biostatistics, Graduate School of Public Health, University of Pittsburgh

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小梁网（TM）在眼压计引起的急性眼压升高作用下可发生向施莱姆管腔隙的迁移，该现象可通过谱域光学相干断层扫描进行观察。本方法旨在定量评估活体组织中房水外流通路对急性眼压升高的形态计量学反应。 原位.

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

小梁网（trabecular meshwork, TM）的力学特性与房水外流阻力及眼内压（intraocular pressure, IOP）调节密切相关。该技术的原理在于直接观察小梁网在急性眼内压升高时的力学响应。扫描前需测量基线状态及眼内压升高时的IOP值。在基线状态和眼内压升高期间（使用眼动测量仪（ophthalmodynamometer, ODM）施加30 g力），对角膜缘区域进行谱域光学相干断层扫描（spectral-domain optical coherence tomography）。利用ImageJ软件处理扫描图像，以增强房水外流通路的可视化效果。通过血管解剖标志确定基线与眼内压升高状态下扫描体积中的对应位置。在Schlemm管（Schlemm canal, SC）一段1 mm长的节段内，选取10个位置手动测量SC的横截面积（SC-CSA）以及沿其长轴从前至后的长度。内壁至外壁的平均距离（短轴长度）通过将SC的面积除以其长轴长度计算得出。为探讨邻近组织对眼内压升高效应的贡献，在滴用托吡卡胺诱导平滑肌松弛前后分别重复上述测量。小梁网向Schlemm管内的移位受小梁网自身刚度的抵抗，但可因小梁网与睫状体内部平滑肌相连而获得支持，从而增强其位移。该技术是首次用于测量活体人眼小梁网对压力升高的响应。 原位 在人眼的生理条件下。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

青光眼是全球导致不可逆失明的第二大原因1。眼内压（IOP）升高是青光眼发生和进展的主要致病危险因素2-7。 IOP由房水的生成与外流之间的平衡所调节8。 房水外流阻力最大的部位是近管组织以及Schlemm管（SC）的内壁，即SC与小梁网（TM）之间的界面9-11。 尽管TM的刚度可能有助于防止在眼内压升高时SC发生塌陷， Overby 等 12 最近研究表明，青光眼中的基因表达发生改变，导致SC内皮细胞刚度增加，阻碍孔隙形成，从而引起青光眼眼内IOP升高13。 TM的形态和刚度与外流易度相关14,15， 这凸显了测量其生物力学特性的必要性。

原子力显微镜对小梁网（TM）的测量显示，青光眼患者捐献的眼球组织刚度升高（81 kPa），相比之下，无青光眼捐献者的眼球组织刚度为4.0 kPa16, 但这些测量是在离体解剖的组织上进行的。ex vivo。后部小梁网通过纵行肌细胞的前部肌腱锚定于睫状肌，这些肌腱插入外层板状和筛状的小梁网结构中17。 睫状肌（CM）的活动可能增加小梁网的紧张度，模拟出小梁网刚度升高的状态17。 已有动物模型研究表明，平滑肌扰动可引起施莱姆管（SC）塌陷阻力的变化18。 我们已证明，可利用谱域光学相干断层扫描（OCT）对活体人眼中小梁网及远端施莱姆管在内的主要房水外流系统进行无创成像19-21。 利用该技术，我们已证实能够量化小梁网和施莱姆管对急性眼内压升高的形态测量学反应22。

本方法的总体目标是定量评估活体组织原位条件下小梁网对急性眼内压升高的形态计量学反应。in situ 活体组织检测技术的优势在于可在生理条件下观察小梁网（TM），其中包括小梁网内和睫状肌（CM）的收缩纤维活动对小梁网刚度的共同贡献，而不同于以往在离体组织中进行的测量。采用该技术观察小梁网机械反应的理论依据在于，它能够为我们提供关于小梁网机械行为的独有见解，而目前我们已知小梁网的机械行为直接与房水外流阻力及眼内压调节相关13。 为区分收缩组织对总体刚度的贡献，我们对一小部分受试者在未抑制和使用托吡卡胺抑制平滑肌活性的条件下进行了检测。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

伦理声明：在开始招募受试者之前，已获得匹兹堡大学医学院机构审查委员会的批准。所有受试者在参与研究前均签署了书面知情同意书。

1. 数据采集

  1. 眼压升高
    1. 滴入一滴0.5%丙美卡因于眼部，3分钟后起效，进行基线测量（眼压和OCT测量）。
    2. 用眼压计轻轻按压颞侧巩膜，第1组施加30 g压力，第2组依次施加5 g和10 g压力。随后按以下步骤进行所需的眼压（IOP）和光学相干断层扫描（OCT）测量
      1. 眼内压测量
        1. 测量基线眼内压。按照第1.1节所述升高压力。
        2. 在队列1中，滴入一滴0.5%丙帕卡因，等待3分钟起效，然后对巩膜施加30 g的压力。在加压过程中，按照制造商说明使用眼压计测量眼内压。
        3. 在第2组中，滴入一滴0.5%丙帕卡因，等待3分钟以发挥药效，随后使用眼压计施加5 g的巩膜压力。在压力升高的过程中，按照制造商说明使用眼压计测量眼内压。
          1. 在5 g测量后等待5分钟。
          2. 使用眼压描计器施加10 g的巩膜压力，并按照眼压计制造商的说明，在压力升高期间测量眼内压（IOP）。记录眼内压值及状况（即， 基线或10克）记录在研究记录中。
      2. OCT 扫描
        1. 将受试者安置在OCT扫描仪上。对于新受试者，输入其人口统计学数据；对于 previously scanned subjects，从OCT数据库中调取其人口统计学数据。
        2. 选择眼前节512 x 128扫描方案。在视频图像窗口中将眼睛居中。减小扫描仪与眼睛之间的距离，直至角膜横截面图像出现在扫描窗口中
        3. 通过指导患者将视线转向鼻侧，使用口头指令将颞侧角膜缘置于扫描窗中心
        4. 获取基线扫描图像，并评估扫描质量。若符合要求，则保存；若不符合要求，则重复此步骤。
          1. 如果扫描过程中无眨眼，且在整个容积范围内角度均可见，未偏离图像边缘或在顶部发生翻转，则接受该扫描。
        5. 滴入一滴0.5%丙帕他卡因，等待3分钟起效，然后重复步骤1.3.2至1.3.5。
        6. 对于队列1，应用30 g 使用眼动脉压测量仪施加巩膜压力，并在加压过程中获取扫描图像。解除压力后，检查扫描图像质量。若图像质量可接受，则保存；若不可接受，则重复此步骤。
        7. 对于队列2，使用眼压计施加5 g的巩膜压力，并在施压过程中获取扫描图像。移除压力后，检查扫描图像质量。如果图像质量可接受，则保存；若不可接受，则重复此步骤。
        8. 等待5分钟，使眼睛从5 g的压力扰动中恢复。
        9. 对于队列2，使用眼动脉压计施加10 g的巩膜压力，并在施压过程中获取扫描图像。解除压力后，检查扫描图像质量。若图像质量可接受，则保存；若不可接受，则重复此步骤。
        10. 记录扫描时间、条件（即， 基线或10 g）以及研究记录中的位置。

2. 数据处理

  1. 将大容量USB存储设备插入OCT设备。在OCT的“记录”菜单中选择“导出”选项。在USB驱动器上指定导出文件的存储位置。取消勾选“.zip”选项。输入待导出扫描图像的患者姓名，并选择需要导出的扫描图像。启动导出过程。
  2. 导出完成后，从OCT设备上安全卸载并拔出USB驱动器。将包含已导出图像的大容量USB驱动器插入图像处理工作站。
  3. 启动图像处理程序，在本例中为ImageJ。
  4. 导入原始图像数据；从文件菜单中选择“文件 -> 导入 -> 原始数据”。从USB驱动器中选择以“_cube_raw.img”结尾的文件进行处理。
  5. 使用新名称保存导入的文件，以确保原始图像数据保持未更改状态（http://www.ori.dhhs.gov/education/products/RIandImages）。
  6. 按如下参数输入导入设置：图像类型：8位，宽度：512，高度：1,024，偏移量：0；图像数量：128。
  7. 从插件菜单中选择“插件 -> 配准 -> StackReg”，然后选择“刚体变换”选项。随后选择“文件 -> 另存为 -> TIFF”以保存对齐后的图像栈。
  8. 从处理菜单中选择“处理 -> 滤波器 -> 3D均值”。将滤波参数设置为X = 1，Y = 1，Z = 1。重复此步骤两次。
  9. 选择“文件 -> 另存为 -> TIFF”以保存平均处理后的图像栈。滚动鼠标滚轮，切换至活动图像栈的第1帧。
  10. 从处理菜单中选择“处理 -> 增强局部对比度（CLAHE）”。使用以下参数：区块大小：31，直方图灰阶数：256，最大斜率：5，掩膜：无，并勾选“快速”选项。使用右箭头键进入下一帧。
  11. 切换至活动图像栈的第2帧，并重复执行“处理 -> 增强局部对比度（CLAHE）”。重复此操作，直至所有帧的对比度均得到增强。
  12. 选择“文件 -> 另存为 -> TIFF”以保存对比度增强后的图像栈。然后从图像菜单中选择“图像 -> 调整 -> 大小”。取消勾选“约束宽高比”选项，然后输入宽度：2,048，高度：1,024。
  13. 从图像菜单中选择“图像 -> 变换 -> 垂直翻转”。然后从分析菜单中选择“分析 -> 设置标尺”。输入像素距离：2,048，已知距离：4,000，像素宽高比：1，点击确定。选择“文件 -> 另存为 -> TIFF”以保存已校准的1:1宽高比图像栈。
  14. 缓慢滚动鼠标滚轮，目视检查扫描图像，识别一个明显的血管交叉点作为扫描内的参考位置。在分析电子表格中记录图像编号和参考帧编号。
  15. 按左箭头键15次，进入第一个测量帧。从工具栏中选择“自由选择”工具。
  16. 将鼠标置于SC中心，然后按向上箭头键。重复此操作，直至SC充满屏幕。
  17. 使用鼠标围绕SC边界手动勾画分割区域。按住控制键（Ctrl）并按下D键，对当前图像帧进行复制。按住Ctrl键，再按下M键。将SC横截面积的测量值及测量帧编号转录至分析电子表格中。取消选中已勾画区域。按右箭头键3次。重复此步骤，直至在10个帧中完成SC的测量。
  18. 按左箭头键30次，返回至第一个测量帧。
  19. 从工具栏中选择直线段工具。
  20. 从SC最前部至最后部位置画一条直线。按住控制键并仅对当前帧按下D键。按住控制键，再按下M键。将SC长度及帧编号转录至分析电子表格中。取消选中已勾画区域。按右箭头键3次。重复此步骤，直至在与SC横截面积相同的10个帧中完成SC长度的测量。
  21. 在分析电子表格中插入公式 SC-IOWD = SC-CSA / 轴向长度，通过将面积测量值除以长度测量值，计算SC内壁至外壁的平均距离（SC-IOWD）。
  22. 按左箭头键30次，返回至第一个测量帧。
  23. 从工具栏中选择直线段工具。
  24. 从SC最前部位置画一条直线至小梁网与前房的边界。确保该直线与边界垂直。按住Ctrl键并按下D，然后按下M。
  25. 从SC最后部位置画一条直线至小梁网（TM）与前房的边界。确保该直线与边界垂直。按住Control键并按下D，然后按下M。
  26. 从SC中心画一条直线至小梁网（TM）与前房的边界。确保该直线与边界垂直。按住控制键并仅对当前帧按下D键。
  27. 将三个小梁网（TM）厚度测量值及帧编号转录至分析电子表格中。为此，请按右箭头键3次。重复此步骤，直至在与SC横截面积相同的10个帧中完成TM厚度的测量。

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结果

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利用这些数据采集和图像分析技术，可以获得眼内压（IOP）小幅和大幅变化对流出道形态参数（如Schlemm管的横截面积）的影响（图1）。可以看出，较高的眼内压水平会导致Schlemm管出现明显的塌陷，表现为横截面积显著减小。眼睛似乎能够耐受眼内压的小幅升高，这一点由Schlemm管横截面积（SC-CSA）未发生改变得以证实（图1）。这些结果表明，该技术能够量化流出道在急性眼内压挑战下的形态测量学反应。目前尚无其他任何技术或方法家族能够同时提供关于流出道生物力学的可视化和定量信息。

在整个研究过程中，未观察到小梁网（TM）厚度发生显著变化。当眼内压（IOP）升高23 mmHg时，Schlemm管（SC）内壁至外壁的距离减少了5.03 µm。在未抑制和平滑肌活性被抑制的情况下，眼内压升高6 mmHg分别导致Schlemm管内壁至外壁的距离减少了0.18 µm和2.34 µm。此外，在抑制平滑肌活性后，Schlemm管的基线横截面积（CSA）从4,597 ± 2,503 µm2下降至3,588 ± 1...

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讨论

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目前的技术利用对软组织机械响应的非侵入性观察，以量化Schlemm管（SC）的塌陷。未来需要使用人尸体眼球进行研究，以在解剖后校准组织形变与实际组织刚度之间的关系。然而，这类研究将面临以往流出道模型相同的局限性；具体而言，活体肌肉对组织张力的贡献将不存在。在活体哺乳动物眼球模型中进一步校准，可能实现对成像 以及小梁网（TM）刚度的直接测量进行校准。

该技术存在若干局限性。目前尚未在其他OCT平台上验证该方法。文献表明，其他OCT设备可能也能观察到相同结构，但这些设备对人眼急性眼压升高相关变化的敏感性尚未得到证实。本研究使用当前设备是出于便利性考虑，因为该设备无需额外光学组件即可进行眼前节扫描。本研究面临的最大挑战是在扫描图像中识别施莱姆管（SC）。在单个切片中无法明确识别施莱姆管。必须对整个三维图像体积进行分析，首先定位包含施莱姆管的组织区域，再通过观察集液管开口以及不同切片中施莱姆管各段之间的相互连接来确认其身份。根据我们的经验，施莱姆管在角膜缘区域可表现为0至4个开口，这些开口可能在靠近集液管开口处融合成单个较大的开口，也可能塌陷为完全闭合的狭窄段。

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披露

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Schuman 博士因麻省理工学院和麻省眼耳医院授权给蔡司公司（Zeiss, Inc.）的知识产权获得了版税。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

部分由美国国立卫生研究院合同 R01-EY13178 和 P30-EY08098（马里兰州贝塞斯达）、眼科与耳科基金会（宾夕法尼亚州匹兹堡）以及防止失明研究组织（纽约州纽约市）的无限制资助支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
光谱域光学相干断层扫描ZeissCirrus
影像工作站AppleiMac
眼压计Baillairt Matalene Ophthalmodynamometer, Surgical instruments CO., Inc. New York, NY
图像处理程序rsb.info.nih.gov/ijImageJ, FIJI

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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