Leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

摘要

本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Lepr^db中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。

摘要

2型糖尿病是一种慢性疾病，2013年影响了3.82亿人，预计到2035年将上升至5.92亿人¹。在过去的20年中，β细胞功能障碍在2型糖尿病中的作用已得到明确证实²。研究进展依赖于胰岛分离技术的建立。本文所介绍的胰岛分离方案与其他研究团队的方案有许多共同步骤，同时进行了一些改进，以提高从野生型和糖尿病Lepr^db（db/db）小鼠中分离胰岛的得率和质量。随后介绍了一种活细胞双光子成像方法，可用于研究胰岛内胰岛素分泌的调控机制。

引言

β细胞功能障碍在疾病中的作用已被广泛认识^3,4。MIN6和INS-1等细胞系是研究β细胞生物学行为的有用工具。然而，胰岛素分泌的生理调控发生在胰岛（Langerhans岛）内部。这些胰岛包含数千个紧密排列的β细胞，以及血管和其他内分泌细胞类型。胰岛内的这一微环境影响胰岛素的分泌，可能在糖尿病的发生发展中起重要作用。因此，要理解胰岛素分泌的生理调控机制以及疾病的病理生理过程，研究完整的胰岛至关重要。

胰岛分离

活体人胰岛，尤其是来自2型糖尿病患者的胰岛，难以获取。此外，人胰岛在实验性分子操作方面存在诸多限制。因此，研究人员常采用动物来源的胰岛以及2型糖尿病的动物模型。其中一种疾病模型是db/db小鼠。这是一种自发性突变，其表型进展与人类2型糖尿病高度相似^5,6。本文所述的从糖尿病db/db小鼠中分离胰岛的实验方案，与其他研究团队的方法有许多共同步骤，但在提高得率、纯化效果及增强胰岛存活率方面进行了若干优化。

双光子成像

本文所述的活细胞双光子检测方法可使研究人员定量分析来自糖尿病⁷和野生型胰岛^8,9的多个细胞中含胰岛素颗粒的数量，并评估其特性。

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方案

注意：所有实验均根据昆士兰大学动物伦理程序进行（已获昆士兰大学解剖生物科学伦理委员会批准）。

1. 胰岛分离

1. 试剂准备
   1. 酶混合物
      1. 对于胰腺消化，使用liberase和IV型胶原酶的混合物。将1瓶5 mg的liberase TL（thermolysin low）用26 ml DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）溶解。
      2. 在 Hank’s 缓冲液中配制 IV 型胶原酶，浓度为 0.5 mg/ml，添加 5 mM HEPES 和 0.5 mM CaCl₂₂，0.1 mg/ml DNA酶和1 mg/ml牛血清白蛋白。
      3. 将 liberase TL 溶液与胶原酶溶液按 4:1（体积比）混合， 即，4 ml Liberase TL + 1 ml 胶原酶。将酶混合物分装为每份2.5 ml，于-20 °C保存。
         注意：不同批次的酶处理时，组织孵育时间略有差异（30 秒 至1分钟 因此，可能需要进行批次测试。
   2. RPMI 分离培养基
      1. 将一管 RPMI 1640 粉末在室温下溶于 1 L 水中，并加入 2 g NaHCO₃ 补充成分₃，4.02 g HEPES。
      2. 将....

结果

胰岛产量与纯化

对于正常的野生型小鼠，预计可获得约200个胰岛。健康的胰岛外观明亮、呈圆形，边界光滑。消化过度的分离样本通常含有较小且轮廓模糊的胰岛，而消化不足的样本则胰岛数量较少，并伴有腺泡细胞附着的胰岛（图3）。对于糖尿病db/db小鼠，胰岛的产量和形态取决于疾病进展程度：血糖控制较好的小鼠胰岛更大、更明亮，数量也更多（可达300个胰岛），而血糖控制较差的小鼠胰岛较小，呈半透明状，数量少于100个。

双光子检测

双光子成像是一种间接检测方法，用于在单个胰岛素颗粒融合水平上测量胰岛素分泌。在葡萄糖或高钾等刺激下，胰岛素颗粒与质膜融合，胞外染料SRB进入颗粒内，从而产生直径约400 nm的突然荧光斑点（图5）。已有多种实验验证了该检测方法可准确反映含胰岛素颗粒的融合事件，例如：随着葡萄糖浓度增加，颗粒融合事件数量呈剂量依赖性上升，且与预期的胰岛素分泌量一致；双光子成像中响应细胞的大小与β细胞相符；双光子成.......

讨论

胰岛分离过程中最关键的步骤是胰腺的初始灌注；灌注不足的胰腺会导致胰岛得率显著降低。其他因素也会影响分离质量，例如消化时间和振荡强度，这些因素可在一定程度上弥补灌注不足的问题。例如，充分灌注的胰腺在37 °C条件下仅需轻轻振荡孵育约18分30秒，而灌注不足的胰腺则可能需要约20分钟 的消化时间并配合更强的振荡。我们发现，联合使用两种消化酶的效果优于单独使用其中一种。对于仅使用胶原酶的方法，消化时间对胰岛得率至关重要，仅30秒的时间差异就可能显著影响分离质量。而仅使用Liberase时，虽然得率尚可，但有时会出现消化不足的情况；我们认为添加胶原酶有助于更有效地消化结缔组织。

我们发现，db/db 小鼠即使在同窝仔鼠中也表现出多样化的糖尿病表型。因此，通常在处死每只动物前对其进行葡萄糖耐量试验。这有助于根据空腹血糖水平以及注射葡萄糖后血糖曲线下面积对动物进行分类。

胰岛分离后可进行多种可能的实验。分离的胰岛可在分离后立即用多聚甲醛或甲醇固定，并用于免疫荧光染色，以确定目的蛋白的定位¹⁰。分离的胰岛也可.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Liberase TL 5 mg	Roche	-5401020001
IV型胶原酶 1g	Gibco-Life Technologies	17104-019
Histopaque 1077 500 ml	Sigma Aldrich	10771
RPMI 1640 培养基 (10x) 1L	Sigma Aldrich	R1383	用于制备分离培养基
RPMI 1640 (1x) 500 ml	Gibco-Life Technologies	21870-076	用于制备培养培养基
青霉素-链霉素 100 ml	Gibco-Life Technologies	15140-122	用于制备培养培养基
胎牛血清 500 ml	Gibco-Life Technologies	10099-141	用于制备培养培养基
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）	Gibco-Life Technologies	11966-025	用于稀释 Liberase
Metamorph 程序	Molecular Devices, USA		用于分析双光子图像