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Leprdb 小鼠2型糖尿病模型：胰岛分离与完整胰岛的活细胞双光子成像

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DOI：

10.3791/52632

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2015年5月11日

 ,  , 
1School of Biomedical Sciences, The University of Queensland

本文内容

摘要

本文介绍了一种从2型糖尿病小鼠模型Leprdb中分离胰岛的实验方案，以及一种利用双光子显微镜检测完整胰岛活细胞胰岛素分泌的实时细胞检测方法的详细步骤。

摘要

2型糖尿病是一种慢性疾病，2013年影响了3.82亿人，预计到2035年将上升至5.92亿人1。在过去的20年中，β细胞功能障碍在2型糖尿病中的作用已得到明确证实2。研究进展依赖于胰岛分离技术的建立。本文所介绍的胰岛分离方案与其他研究团队的方案有许多共同步骤，同时进行了一些改进，以提高从野生型和糖尿病Leprdb（db/db）小鼠中分离胰岛的得率和质量。随后介绍了一种活细胞双光子成像方法，可用于研究胰岛内胰岛素分泌的调控机制。

引言

β细胞功能障碍在疾病中的作用已被广泛认识3,4。MIN6和INS-1等细胞系是研究β细胞生物学行为的有用工具。然而，胰岛素分泌的生理调控发生在胰岛（Langerhans岛）内部。这些胰岛包含数千个紧密排列的β细胞，以及血管和其他内分泌细胞类型。胰岛内的这一微环境影响胰岛素的分泌，可能在糖尿病的发生发展中起重要作用。因此，要理解胰岛素分泌的生理调控机制以及疾病的病理生理过程，研究完整的胰岛至关重要。

胰岛分离

活体人胰岛，尤其是来自2型糖尿病患者的胰岛，难以获取。此外，人胰岛在实验性分子操作方面存在诸多限制。因此，研究人员常采用动物来源的胰岛以及2型糖尿病的动物模型。其中一种疾病模型是db/db小鼠。这是一种自发性突变，其表型进展与人类2型糖尿病高度相似5,6。本文所述的从糖尿病db/db小鼠中分离胰岛的实验方案，与其他研究团队的方法有许多共同步骤，但在提高得率、纯化效果及增强胰岛存活率方面进行了若干优化。

双光子成像

本文所述的活细胞双光子检测方法可使研究人员定量分析来自糖尿病7和野生型胰岛8,9的多个细胞中含胰岛素颗粒的数量，并评估其特性。

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方案

注意：所有实验均根据昆士兰大学动物伦理程序进行（已获昆士兰大学解剖生物科学伦理委员会批准）。

1. 胰岛分离

  1. 试剂准备
    1. 酶混合物
      1. 对于胰腺消化，使用liberase和IV型胶原酶的混合物。将1瓶5 mg的liberase TL（thermolysin low）用26 ml DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）溶解。
      2. 在 Hank’s 缓冲液中配制 IV 型胶原酶，浓度为 0.5 mg/ml，添加 5 mM HEPES 和 0.5 mM CaCl₂2，0.1 mg/ml DNA酶和1 mg/ml牛血清白蛋白。
      3. 将 liberase TL 溶液与胶原酶溶液按 4:1（体积比）混合， 即，4 ml Liberase TL + 1 ml 胶原酶。将酶混合物分装为每份2.5 ml，于-20 °C保存。
        注意：不同批次的酶处理时，组织孵育时间略有差异（30 秒 至1分钟 因此，可能需要进行批次测试。
    2. RPMI 分离培养基
      1. 将一管 RPMI 1640 粉末在室温下溶于 1 L 水中，并加入 2 g NaHCO₃ 补充成分3，4.02 g HEPES。
      2. 将RPMI分离培养基加入一个大锥形瓶中，使用磁力搅拌器混匀，用NaOH调节pH至7.4，过滤除菌后于4 °C保存。
    3. RPMI 培养基
    4. 使用含10%胎牛血清和1%抗生素的RPMI培养基即，青霉素 100 U/ml，链霉素 100 μg/ml。
  2. 胰岛分离与培养
    1. 动物牺牲
      1. 通过颈椎脱位或CO₂处死小鼠2 根据当地机构的伦理程序实施窒息安乐死。用70%乙醇彻底喷洒小鼠尸体。
    2. 胰腺灌注
      1. 沿腹部皮肤和腹膜横向做两个长切口，形成一个V形皮瓣。将皮瓣向上拉开，暴露整个腹腔，移开肠管，并用折叠的滤纸固定肝脏以保持其位置，从而显露胆总管图示 1 和 2将动物放置，使其头部朝向术者，尾部远离术者。
      2. 在十二指肠壁的壶腹部施加血管夹，以阻止注入的酶进入十二指肠（图 1).
        注意：此步骤至关重要，因为它决定了注入的酶是进入胰管并灌注胰腺，还是反流至注射部位（夹闭过度）或流入十二指肠（夹闭不足）。
      3. 在肝总管与胆囊管汇合处附近，用31 G针头穿刺胆总管图 1）并预留空间以便在胰腺首次灌注失败时进行第二次注射。将约 2 ml 冷的酶混合液缓慢（约 10 秒内）注入小鼠胆总管。
        注意：如果夹子位置正确，胰腺将被迅速灌注。
      4. 如果针头位于胆总管内但无法灌注胰腺，则调整夹子位置（即若夹持过度，则将夹子稍向上移，远离肝脏；若夹持不足，则将夹子稍向下移，靠近肝脏。
        注意：针头有时会进入周围包膜而非导管腔内。注射时若观察到导管扩张，可作为判断针头是否位于胆总管内的有用指标。若胰腺灌注失败，可选择将酶混合液注射至胰腺多个位点，但预期产量较低。灌注胰腺左侧部分（脾叶）对于最大化胰岛产量至关重要。
      5. 胰腺灌注后，迅速取出胰腺，放入一个约20 ml的玻璃瓶中，孵育约19分钟 在37 °C水浴中。
        注意：孵育时间可能因小鼠品系和年龄的不同而略有差异。
      6. 孵育结束后，加入约 20 ml 冷分离培养基以终止消化过程。轻轻振荡离心管以充分分散胰腺组织，随后将悬液通过普通茶筛（孔径 1 mm）滤入无菌 50 ml 离心管中。用分离培养基补至满管体积，于 400 x g 离心 1 分钟。 4 °C，关闭离心机刹车。
      7. 将沉淀物再次溶于分离液中，转移至两个15 ml离心管，然后以400 x g离心1分钟 4°C下关闭刹车离心。吸除上清液后，每管加入6 ml密度梯度细胞分离介质（Histopaque 1077溶液），通过涡旋或吹打充分混匀两个沉淀。然后沿管壁缓慢加入约6 ml分离介质，覆盖在密度梯度分离介质上方，100 × g离心15分钟。 4 °C，关闭离心机刹车。
      8. 将上层（分离培养基）、中层和下层（密度梯度细胞分离培养基）的上清液分别收集到3个独立的培养皿中。在解剖显微镜下，使用移液器从这3个培养皿中手工挑选胰岛。
        注意：中层含有大部分胰岛。胰岛表现为直径约50至500 μm的致密结构（图 3）。我们在野生型小鼠中获得约200个胰岛，而在 <db/db 小鼠中的 100 个胰岛
    3. 胰岛培养
      1. 为了帮助胰岛从酶消化中恢复，将每组40个胰岛置于含6 ml RPMI培养基（10 mM葡萄糖）的25 cm培养皿中，在37 °C、5% CO₂/95%空气条件下培养2/2 活细胞双光子成像前连续培养2天，每天更换培养基.

2. 活细胞双光子成像

  1. 试剂准备
    1. 细胞外缓冲液
      1. 为双光子检测配制富含钠的细胞外缓冲液，其中包含 140 mM NaCl、5 mM KCl、2.5 mM CaCl2、1 mM MgCl2、5 mM NaHCO3 和 10 mM HEPES。
    2. 细胞外染料
      1. 为双光子检测配制 8 mM 储存液 SRB 溶于细胞外缓冲液中，分装至小管中，于 -20 °C 保存。使用前将 SRB 储存液用新鲜细胞外缓冲液按 1:10 稀释，获得 0.8 mM 的工作浓度。
  2. 双光子成像
    1. 首先，将培养 2 天的胰岛在含 3 mM 葡萄糖的细胞外缓冲液中预孵育 30 分钟。
      注意：我们使用培养 2 至 5 天的胰岛。
    2. 然后，将玻璃载片置于安装在显微镜载物台上的温控腔室中。使用真空脂防止溶液泄漏。
    3. 向腔室中加入 500 μl 含 0.8 mM SRB 及不同浓度葡萄糖（3 mM、6 mM、15 mM 和 20 mM 葡萄糖）的细胞外缓冲液。
    4. 接着，将预孵育后的胰岛置于腔室中央，并将焦平面聚焦于胰岛内部 3–4 层细胞深度处，在啮齿类动物胰岛中，胰岛素免疫染色显示该区域大多数细胞为 β 细胞。
      注意：SRB 会迅速标记胰岛所有细胞膜，此时胰岛即可进行成像。
    5. 使用配备 60 倍油浸物镜（NA 1.42）的双光子显微镜及成像软件（例如，ScanImage 11）。图 4 展示了典型的显微成像装置。利用飞秒激光脉冲在 880 nm 激发 SRB 作为细胞膜非通透性荧光细胞外标记物，并在 550–650 nm 范围内检测荧光信号，记录胰岛对刺激的响应。
    6. 通过荧光斑点的突然出现（分辨率为 10 像素/μm）识别单个胞吐事件，并通过感兴趣区域（约 0.78 μm2）荧光信号的快速上升相加以确认。

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结果

胰岛产量与纯化

对于正常的野生型小鼠，预计可获得约200个胰岛。健康的胰岛外观明亮、呈圆形，边界光滑。消化过度的分离样本通常含有较小且轮廓模糊的胰岛，而消化不足的样本则胰岛数量较少，并伴有腺泡细胞附着的胰岛（图3）。对于糖尿病db/db小鼠，胰岛的产量和形态取决于疾病进展程度：血糖控制较好的小鼠胰岛更大、更明亮，数量也更多（可达300个胰岛），而血糖控制较差的小鼠胰岛较小，呈半透明状，数量少于100个。

双光子检测

双光子成像是一种间接检测方法，用于在单个胰岛素颗粒融合水平上测量胰岛素分泌。在葡萄糖或高钾等刺激下，胰岛素颗粒与质膜融合，胞外染料SRB进入颗粒内，从而产生直径约400 nm的突然荧光斑点（图5）。已有多种实验验证了该检测方法可准确反映含胰岛素颗粒的融合事件，例如：随着葡萄糖浓度增加，颗粒融合事件数量呈剂量依赖性上升，且与预期的胰岛素分泌量一致；双光子成像中响应细胞的大小与β细胞相符；双光子成...

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讨论

胰岛分离过程中最关键的步骤是胰腺的初始灌注；灌注不足的胰腺会导致胰岛得率显著降低。其他因素也会影响分离质量，例如消化时间和振荡强度，这些因素可在一定程度上弥补灌注不足的问题。例如，充分灌注的胰腺在37 °C条件下仅需轻轻振荡孵育约18分30秒，而灌注不足的胰腺则可能需要约20分钟 的消化时间并配合更强的振荡。我们发现，联合使用两种消化酶的效果优于单独使用其中一种。对于仅使用胶原酶的方法，消化时间对胰岛得率至关重要，仅30秒的时间差异就可能显著影响分离质量。而仅使用Liberase时，虽然得率尚可，但有时会出现消化不足的情况；我们认为添加胶原酶有助于更有效地消化结缔组织。

我们发现，db/db 小鼠即使在同窝仔鼠中也表现出多样化的糖尿病表型。因此，通常在处死每只动物前对其进行葡萄糖耐量试验。这有助于根据空腹血糖水平以及注射葡萄糖后血糖曲线下面积对动物进行分类。

胰岛分离后可进行多种可能的实验。分离的胰岛可在分离后立即用多聚甲醛或甲醇固定，并用于免疫荧光染色，以确定目的蛋白的定位10。分离的胰岛也可...

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披露

作者声明不存在相互竞争的经济利益。

致谢

本工作得到了澳大利亚研究理事会基金 DP110100642（资助对象：PT）以及国家健康与医学研究理事会基金 APP1002520 和 APP1059426（资助对象：PT 和 HYG）的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Liberase TL 5 mgRoche-5401020001
IV型胶原酶 1gGibco-Life Technologies17104-019
Histopaque 1077 500 mlSigma Aldrich10771
RPMI 1640 培养基 (10x) 1LSigma AldrichR1383用于制备分离培养基
RPMI 1640 (1x) 500 mlGibco-Life Technologies21870-076用于制备培养培养基
青霉素-链霉素 100 mlGibco-Life Technologies15140-122用于制备培养培养基 
胎牛血清 500 mlGibco-Life Technologies10099-141用于制备培养培养基
DMEM（Dulbecco 改良 Eagle 培养基）Gibco-Life Technologies11966-025用于稀释 Liberase
Metamorph 程序Molecular Devices, USA用于分析双光子图像

参考文献

  1. Guariguata, L., et al. Global estimates of diabetes prevalence for 2013 and projections for 2035. Diabetes Research and Clinical Practice. 103, 137-149 (2014).
  2. Ashcroft, F. M., Rorsman, P. Diabetes mellitus and the beta cell: The last ten years. Cell. 148, 1160-1171 (2012).
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Lepr db SRB

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