用于研究模式豆科植物Medicago truncatula早期胚胎发育调控的合子胚与体细胞胚获取方案

摘要

本研究旨在说明，模式豆科植物Medicago truncatula可被广泛用于研究早期植物胚胎发育的调控机制，从而补充非豆科模式植物拟南芥的研究。豆荚形态与合子胚胎发育阶段密切相关，本文还提供了一种利用组织培养技术收集胚胎的实验方案。

摘要

从单细胞合子开始的早期胚胎发生经历快速的细胞分裂和形态发生，形态上可分为前球形期、球形期、心形期、鱼雷形期和子叶期。这一渐进发育过程受到复杂分子网络的严密调控。获取大量发育阶段相近的早期胚胎，对于研究早期胚胎发生的细胞与分子调控机制至关重要。然而，由于早期胚胎发生过程在短时间内经历快速的形态建成，因此获取足够数量且发育同步的早期胚胎并非易事。 例如 8 天 Medicago truncatula 以达到子叶早期阶段。本文中，我们通过两种方法来解决这一问题。第一种方法建立了胚胎发育与豆荚形态之间的关联，以帮助判断合子胚胎所处的发育阶段。该方法主要依据豆荚螺旋的数量以及刺的发育程度。另一种补充方法 在体 通过培养叶片外植体以产生体细胞胚来进行研究。培养基包含一种非常规的激素组合——生长素（1-萘乙酸）、细胞分裂素（6-苄氨基嘌呤）、脱落酸和赤霉素。不同发育阶段的体细胞胚无需解剖即可从愈伤组织中清晰观察到。

引言

豆科植物是仅次于禾本科的第二大收获面积和总产量的作物，为被子植物中第三大科，约有20,000个物种，其学名为Leguminosae（或Fabaceae）¹大豆是全球第三大种植作物。食用豆类为人类提供了约三分之一的膳食蛋白质和三分之一的植物油。²豆科植物及其氮₂ 固定能力也有助于可持续农业系统的发展。 Medicago truncatula与大豆类似，其种子的子叶中储存蛋白质和油脂，是一种具有丰富遗传与基因组资源的豆科模式植物^3,4。尽管 M. truncatula 促进了对豆科植物-根瘤菌共生关系的理解⁴ 它被越来越多地用于研究豆科植物种子生物学^5-7 和胚胎发生^8,9拟南芥胚胎发育已被广泛研究^10,11 但它不是豆科植物，其胚胎发生过程的细节与蒺藜苜蓿（Medicago）并不相同^8,10合子胚胎发生 M. truncatula 具有有趣的特征，包括独特的多细胞基足、内多倍体悬垂丝以及基部传递细胞⁸.

体细胞胚胎发生（SE）常用于植物再生¹²。在豆科模式植物M. truncatula中，Jemalong 2HA（2HA）品系由亲本Jemalong选育而来，具有较高的体细胞胚胎发生率¹³。近年来，通过在长期使用的培养基中同时添加赤霉素（GA）和脱落酸（ABA），所产生的胚胎数量显著增加¹⁴。在此情况下，GA与ABA表现为协同作用，这较为罕见，因为通常GA与ABA之间为拮抗关系¹⁴。由愈伤组织产生的胚胎在表面发育，便于通过肉眼观察胚胎发生的阶段并方便收获。拥有遗传背景接近且分别具有胚胎发生能力（2HA）和无胚胎发生能力（Jemalong）的近等基因系，有助于对体细胞胚胎发生进行研究，同时具备in vivo和in vitro两种实验系统，可提供多种实验可能性。

了解胚胎发育的细胞和分子机制对于理解种子和植物发育至关重要。在豆科植物中，与其他双子叶植物一样，胚胎的子叶负责储存供人类营养利用的物质。早期胚胎发生过程涉及快速的细胞分裂和正确的胚胎模式形成。受精后大约8天，M. truncatula 胚胎达到早期子叶阶段。在温室条件下，受精后的天数并不能准确反映胚胎的形态学特征。因此，建立一种高效且标准化的方法来判定发育中胚胎的阶段，对于研究合子胚胎早期发生的遗传调控具有重要价值。

本文提供了两种标准化方案，用于采集豆科模式植物M. truncatula的发育中胚胎，以开展胚胎发生过程的生物学研究。第一种方法是通过结合胚胎发生过程与豆荚形态特征来采集合子胚胎；第二种方法是通过培养叶片外植体进行体细胞胚胎发生，从而获得数量充足且易于获取的胚胎材料。

方案

1. 合子胚胎发育

1. 植物材料
   1. 在温室中种植蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）野生型Jemalong或其近等基因型、高再生能力的基因型Jemalong 2HA¹³（简称2HA），光照周期为14小时，昼夜温度分别为23 °C/19 °C。
      1. 播种前用23号针头刺穿种皮表面，使水分能够进入种子，并将种子在水中浸泡过夜。加水至完全覆盖种子。
      2. 在每个直径15 cm的花盆中播种3粒种子（共10盆），使用栽培基质（粗砂、珍珠岩、椰糠（1:1:1）并添加5 g Osmocote Exact Standard缓释肥料），然后转移至温室。种子萌发后保留最健壮的幼苗，使每盆保留1株植物，并在周围设置支架供植株茎蔓攀爬。
2. 收获豆荚
   1. 从野生型Jemalong或2HA植株上采集豆荚，以获取适当发育阶段的早期胚胎，方法如先前所述⁹。
      注：不同豆荚发育阶段见图1，对应的胚胎发育阶段见图2。
   2. 根据表1中的标准，在收获时判断不同豆荚发育阶段。通过测量从第6阶段开始经过的时间，以区分第6和第7阶段（表2）。
3. 从豆荚中解剖胚珠并鉴定胚胎发育阶段
   1. 使用精细镊子单独或配合体视解剖显微镜和镊子从豆荚中分离胚珠。如有需要，可使用普通复式显微镜快速检查胚胎发育阶段（图3B）。
   2. 配制改良Hoyer溶液：含阿拉伯胶7.5 g、水合氯醛100 g、甘油5 ml、去离子蒸馏水60 ml。搅拌3–5小时或过夜至完全溶解。
   3. 为获得更清晰的显微观察效果，将解剖得到的胚珠置于改良Hoyer溶液中进行透明处理^15,16。小心夹取完整胚珠，放入适量Hoyer溶液中（以完全覆盖胚珠为宜），室温下静置至透明。
   4. 使用微分干涉差（DIC）光学系统观察样品，并通过数码相机采集图像⁹（图2）。
   5. 选取豆荚中部区域发育最均匀的胚珠，并积累所需数量。示例见图3A。将胚珠置于冰上收集，并根据后续分析需要在相应温度下保存（如核酸分析需保存于-80 °C）。
      注：有关组织切片分析、透射电子显微镜和原位杂交的详细方法，请参见文献^8,9。

2. 体细胞胚胎发育 体外

1. 使用一种易于在培养中形成胚胎的M. truncatula栽培品种。本叶盘转化实验方案使用2-4个月大的2HA植株^13,17。
2. 从伸长茎上最新近完全展开的三小叶复叶中取下小叶。
3. 将三小叶复叶置于培养皿中湿润的纸巾上，以防脱水。
   注意：三小叶复叶采收后应尽快使用，避免延迟。
4. 培养基的制备
   1. 使用含琼脂（0.8% w:v）的P4 10:4:1:5培养基，倒入9 cm培养皿中。
      注意：P4 10:4:1:5培养基由P4基础培养基¹⁸添加10 μM 萘乙酸（NAA）、4 μM 6-苄氨基嘌呤（BAP）、1 μM 脱落酸（ABA）和5 μM 赤霉酸（GA）组成。GA与ABA的联合使用可加速胚胎形成，并显著增加胚胎数量¹⁴。
   2. 配制1 L的P4基础培养基，包括大量元素（钙单独配制）、微量元素、维生素（表3）、螯合铁（单独配制）、酪蛋白氨基酸（酪蛋白水解物）、30 g蔗糖和8 g琼脂。
   3. 将大量元素、钙、酪蛋白氨基酸、微量元素和维生素的储备液分装后于-20 °C保存；螯合铁溶液储存在4 °C。
   4. 配制螯合铁溶液（200倍浓缩液）：在搅拌条件下，将7.44 g Na₂EDTA•2H₂O溶于约900 ml去离子蒸馏水中，加热至98–99 °C，再加入1.853 g FeSO₄•7H₂O，待完全溶解后定容至1 L。置于棕色瓶中，4 °C保存。
   5. 按照表4使用储备液配制P4基础培养基。培养基中激素终浓度为10 μM NAA、4 μM BAP、1 μM ABA、5 μM GA（见表4和特定材料表）。NAA和BAP在灭菌前加入，ABA和GA在高压灭菌后、培养基冷却至约55 °C时，通过连接有0.22 µm滤器的注射器过滤除菌后加入。轻轻旋转混匀。
   6. 在高压灭菌前，用1 M KOH将培养基pH调节至5.8。121 °C高压灭菌20分钟。
   7. 灭菌后，加入经滤器除菌的ABA和GA，然后在超净工作台或生物安全柜中将约25 ml培养基倒入无菌的9 cm培养皿中。打开皿盖冷却，使琼脂凝固。盖上皿盖，确保皿盖无冷凝水。按需标记，并于4 °C保存（建议用纸箱存放，防止皿盖产生冷凝水）。
5. 叶组织的消毒
   1. 在经紫外线灭菌的超净工作台或生物安全柜中操作。
   2. 将叶片放入已高压灭菌的弹簧式茶漏的金属网球中。
   3. 将装有叶片的茶漏浸入含70%（v:v）乙醇的培养皿中30秒。
      注意：本实验所有步骤均使用已灭菌的250 ml聚碳酸酯螺口培养皿。
   4. 倒去乙醇，将茶漏转移至含1:8（v:v）稀释漂白液（含0.5%次氯酸钠）的培养皿中，浸泡10分钟，期间轻轻摇晃。
   5. 倒去漂白液，将茶漏转移至盛有无菌去离子蒸馏水的培养皿中，轻轻摇晃后倒去多余水分。再用另一份无菌去离子蒸馏水重复清洗一次。
   6. 用无菌镊子将叶片从茶漏中取出，放入盛有无菌去离子蒸馏水的新培养皿中。盖上无菌盖，通过倒置和轻摇进行冲洗。使叶片漂浮在无菌水中，待后续制备外植体时使用。
6. 外植体的制备与接种
   1. 采用无菌操作，用解剖刀从消毒后的小叶边缘切除多余部分，将剩余部分切成两至三个矩形外植体（8–10 × 3–5 mm），确保每块外植体中央包含主脉（图5A）。
      注意：外植体大小对启动初生愈伤组织至关重要。切割操作可在一次性食品容器的无菌皿盖上进行。
   2. 将6个外植体接种于9 cm培养皿的琼脂固化培养基上（图5B）。接种时将外植体的远轴面（abaxial面）朝下，以保持叶片自然方向。
   3. 用Parafilm封口膜环绕培养皿密封（图5C）。组织现已准备就绪，可进行培养。
7. 组织培养
   1. 将培养皿置于恒温培养室或培养箱中，28 °C避光培养，整个培养周期均保持此条件。
      注意：外植体将启动去分化，经历细胞分裂、增殖（形成愈伤组织）及胚胎发生（再分化）。
   2. 3周后将正在分化的外植体转接至新鲜培养基。转接时在超净工作台或生物安全柜中，使用无菌不锈钢刮刀和镊子整体转移外植体。当愈伤组织开始形成且其大小超过图5C中最大者时，每次转接取50%的单个愈伤组织接种至新鲜培养基。
   3. 约4周后可观察到首批胚胎。尽管胚胎发育具有一定同步性，仍应在4–8周的培养期内陆续收集不同发育阶段的胚胎（图6A,B）。在解剖显微镜下进行收集，并根据实验目的进行后续处理。
   4. 每3周转接一次，定期移除已形成的胚胎，以维持外植体持续产胚能力，可持续约3个月。

结果

在合子胚胎发生过程中，不同胚胎发育阶段对应的豆荚结构如图所示 图1A-F 而不同胚胎发育阶段如图所示 图 2A-F通过选择处于相同发育阶段的豆荚，可以获得较为均一的胚珠样品（图3A通过使用RT-qPCR，可轻松检测胚胎特异性基因，并评估时间过程研究⁹一些额外的解剖操作可进一步富集胚胎图3B）。处理用于 原位 杂交策略可轻松实施，也可开展任何涉及光的互补性研究图 4A、B）和电子显微镜技术⁸该系统中尤为有价值的是胚柄和悬垂器的显著特征图 4A、B).

对于体细胞胚胎发生，从单个小叶上切取初始外植体的操作如图5A所示。将外植体背轴面朝上放置，使其与琼脂紧密接触（图5B）。愈伤组织形成后，约3...

讨论

所述方案相对简单，可利用现有的细胞和分子技术对豆科植物胚胎发生进行研究。我们认识到，in vivo 和 in vitro 方法各有优缺点。与未成熟种子培养相比，这两种方法均能更集中地研究早期胚胎发生¹⁹。

对于体内研究，通常描述的是从豆荚中分离胚珠，该方法适用于多种胚胎研究。当然，也可通过切下“钩状”区域（图3B）进一步富集胚胎组织。在胚胎发育的最早期阶段，由于胚胎与周围组织连接较弱，在解剖过程中容易丢失，因此难以分离，这使得使用胚珠更具优势。利用豆荚形态学特征可避免对每朵花进行标记以及建立相应的时间进程方案。此外，除非环境条件得到严格控制，否则发育时间的测定方法可能存在一定变异性。植物的最适生长至关重要，以确保豆荚形成不处于胁迫条件下。应熟悉豆荚的发育过程，并可根据具体情况对形态学分期进行细微调整，以匹配特定的胚胎发育阶段。

在体细胞胚胎发生的情况下，需要认识到这些胚胎是无性繁殖产生的，而非来自合子。此外，其营养来源...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
P4 培养基	Sigma-Aldrich		使用 Sigma-Aldrich 化学品或其他分析纯级别的供应商
大量盐类
微量盐类
维生素
琼脂	Bacto Laboratories	214010	Bacto 琼脂
植物激素
1-萘乙酸	Sigma-Aldrich	N0640	用少量 1 M NaOH 溶解
脱落酸	Sigma-Aldrich	A1049	用少量 1 M NaOH 溶解
6-苄氨基嘌呤	Sigma-Aldrich	B3274	用 MQ 水加热并加入几滴 1 N HCl 溶解
赤霉酸	Sigma-Aldrich	G7645	用少量乙醇溶解
仪器设备
体视显微镜	Leica	MZFLIII	或同类产品
光学显微镜	Zeiss	Axiophot	或同类产品，配备合适光学系统
数码相机	Zeiss	AxioCam HRc	或同类产品
叶片灭菌
250 mL 聚碳酸酯螺口容器，带聚丙烯盖	SARSTEDT	75.9922.519	可高压灭菌