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方法文章

一种用于脑活动介观宽场光学成像的大范围侧颅开颅术

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⸱

DOI：

10.3791/52642

⸱

2017年5月7日

 ,  ,  ,  , 
1Canadian Center for Behavioural Neuroscience, University of Lethbridge

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本方案介绍了一种在小鼠大脑皮层的颞区和顶区创建大型单侧开颅窗的方法。该方法特别适用于对大脑半球大范围区域进行实时成像。

摘要

开颅手术是一种常用于暴露脑组织的手术操作 体内 实验。在小鼠研究中，大多数实验室采用小尺寸的颅骨开窗，通常为3 mm × 3 mm。本方案介绍一种制备显著更大的7 mm × 6 mm颅窗的方法，可暴露小鼠颞叶和顶叶皮层上方的大部分大脑半球例如， 前囟2.5 - 4.5 mm，外侧0 - 6 mm。实施该手术时，头部需倾斜约30°，并需充分牵开大部分颞肌。由于需去除大量颅骨，该术式仅适用于全程在麻醉状态下进行的急性实验。

这种创新的大范围侧颅窗的主要优势在于能够同时接触大脑皮层的内侧和外侧区域。这种大范围的单侧颅窗可用于研究细胞之间以及不同皮层区域之间的神经动态，结合多电极电生理记录、神经元活动成像（例如，内在或外在成像）以及光遗传学刺激等多种技术。此外，这种大范围开颅还暴露了大面积的皮层血管，从而允许直接操控外侧皮层的血管系统。

引言

开颅手术是神经科学家用于暴露部分大脑的标准操作。自电生理学诞生以来，开颅手术推动了神经科学领域的诸多突破性进展。通过电极对大脑皮层进行高密度定位映射，已促成大量基于这些图谱的假说与理论验证实验。我们最近进入了一个新的时代，开颅手术正被用于 体内 皮层血流成像1,2,3 神经血管结构4，从而实现对暴露区域皮层活动的实时可视化观察5,6,7尽管许多研究采用开颅术联合 体内 光学成像技术用于研究皮层神经元、胶质细胞及皮层血管的结构与功能8,9，但进一步的研究受到暴露皮层面积较小的限制（但参见10).

本实验方案的目的是提供一种方法，用于制作一个较大的侧向颅骨开窗，暴露从正中线至鳞状骨、并延伸超过前囟和后囟的大脑皮层。这种大范围的颅骨开窗可同时观察联合皮层（压后皮层、扣带皮层和顶叶皮层）、初级和次级运动皮层、体感皮层、视觉皮层以及听觉皮层。该方法此前已与电压敏感染料成像技术（VSDI）结合使用，用于研究在自发性和刺激诱发的皮层活动中多个皮层区域之间的相互作用5,11,12。该操作中最困难的部分包括动物头部的定位、头固定板的安装，以及在分离颞肌与顶骨时避免出血。在钻孔和去除颅骨的过程中也必须格外小心，因为颅骨呈斜向弯曲。

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方案

以下方案遵循莱斯布里奇大学动物护理委员会（ACC）的指南，并按照加拿大动物护理委员会（CCAC）的标准进行。

1. 准备

  1. 对于长期研究，需将所有已打开的外科手术用品进行高压灭菌，并确保手术全程维持无菌状态。若需进行多次手术，每次手术之间均应重新高压灭菌。 
  2. 确保备有充足的脑缓冲液（至少 50 mL）。该溶液包含 134 mM 氯化钠、5.4 mM 钾、1 mM 六水合氯化镁、1.8 mM 二水合氯化钙，以及 5 mM HEPES 钠，用 5 M 盐酸调节 pH 至 7.4。
  3. 将小鼠置于诱导室中，使用 3 - 4% 异氟烷进行麻醉诱导，术中维持麻醉时使用 1.0 - 2.0% 异氟烷。 成像期间可进一步降低至 0.4 – 0.8%，前提是维持适当的麻醉深度。5,13,14,15 此类低浓度麻醉需对小鼠进行密切且频繁的监测（约每 5 分钟一次），以确保其对疼痛刺激无反射反应。
    注意： 由于小鼠体表面积与体积比高，且长时间使用异氟烷会加重症状，脱水可能成为问题。
    1. 每 1 - 2 小时皮下注射生理盐水一次，剂量为每 10 g 体重 0.1 mL。当小鼠充分水化时，应每 1 - 2 小时排尿一次。
  4. 密切监测小鼠，确保在整个手术和成像过程中麻醉状态稳定。不得让小鼠无人看管，并确保其不会恢复意识。
  5. 将麻醉后的小鼠转移至头部固定装置，并放置在设定为 37 °C 的温控加热垫上。将其上门齿固定于门齿夹中。
  6. 将小鼠头部向左旋转约 30°，以暴露头部右侧侧面，并使用耳棒的钝端固定小鼠头部（图 1A）。
  7. 涂抹眼用软膏，防止角膜干燥。
  8. 为减轻脑水肿，肌肉注射地塞米松（4 mg/kg）。
  9. 用浸有 4% 氯己定的棉签擦拭手术区域皮肤 3 次，再用 70% 乙醇擦拭 3 次。每根棉签仅使用一次。
  10. 戴上外科手套，并用粘性塑料膜覆盖动物身体。在颅骨开窗部位皮下注射利多卡因（8 - 10 mg/kg；含 2% 肾上腺素）以实施局部麻醉。等待 3 - 5 分钟，使药物充分渗透至组织中。

2. 去除颅骨上的皮肤并牵开肌肉

  1. 在解剖显微镜下观察颅骨的同时进行几乎所有的上述操作（例如， 0.7 - 4.5倍，根据具体情况而定。
  2. 用镊子提起中线左侧1 mm处（耳后）的皮肤，用手术剪做一个小的横向切口。
  3. 向右耳方向做一条5-6毫米的侧向切口，然后向头部前端方向切开。
  4. 在初始切口处插入剪刀，向前端方向剪开10 mm。
  5. 在右耳周围和右眼附近切开皮肤，以暴露右侧颅骨和颞肌。确保暴露区域最宽处至少为7 mm。若需扩大手术区域，可进一步修剪皮肤。
  6. 用几滴丁基氰基丙烯酸酯胶水将切口周围的皮肤固定在颅骨与皮肤之间。 确保已使用棉签或卷纸将组织预先擦干，以提高粘合剂的粘合效果。
  7. 使用棉签以环形动作擦拭颅骨表面，以去除颅骨上的骨膜。通过彻底干燥颅骨确保无任何残留。
  8. 使用弹簧剪和镊子将颞肌从颅骨上分离；横向剪开并牵拉肌肉，直至暴露鳞状骨图1C务必小心操作，避免损伤沿眼周鳞骨表面走行的浅颞静脉，否则可能引起出血。
  9. 用预先浸泡在脑缓冲液中的明胶海绵控制出血。对于严重出血，使用热灼器止血。 在使用热灼烧器处理后，将丁基氰基丙烯酸酯胶水滴加至出血部位。使用棉签或卷纸预先将区域擦干，以提高粘合剂的粘附效果。 

3. 开颅术

注意：在去除颅骨和硬脑膜的过程中，外科医生必须保持谨慎，以避免不必要的并发症。若出现并发症，可参考文中的故障排除步骤进行处理。

  1. 用细头记号笔标记前囟的位置，或剪一小块三角形胶带，将其一个角对准前囟图2A以定位其下方的脑区。
  2. 在安装头板之前，确保颅骨完全干燥。使用浸有脑缓冲液的明胶海绵后，颅骨可迅速自然风干；如需进一步干燥，可使用棉签。此步骤对头板固定至关重要。图1B).
    注意：如果颅骨上残留有骨膜，或在粘贴头板前颅骨未完全干燥，头板可能脱落。若发生此情况，应轻柔取下头板并重新开始。此过程中可能出现出血，需等待数分钟使其凝固，然后轻柔清除。此操作不建议重复超过两次。
  3. 在头板的底边周围涂抹氰基丙烯酸乙酯胶水16，并将头板粘附在颅骨开窗区域（图1D & 图 2A).
  4. 用牙科水泥填充颅骨与头板之间的开口，仅暴露颅骨开窗区域。等待牙科水泥干燥并固化，通常需要5 - 10分钟。图2B).
    1. 水泥凝固后，用脑缓冲液短暂灌注小孔，浸泡3 - 5分钟。钻孔前用卷好的纸巾吸除脑缓冲液图2C).
  5. 用牙科钻头在颅骨表面轻划刻痕，以标出手术区域。使用气动钻（压力设定不超过20 PSI），配备FG ¼钻针，并通过可调速脚踏板控制。
  6. 轻轻沿原始划痕轨迹使用钻头加深切口，确保钻头不穿透颅骨进入脑组织（图 2D每隔几分钟轮流进行钻孔和用湿润的卷纸轻拭颅骨表面，以减少因机械摩擦和长时间暴露导致的颅骨过热和干燥。
    注意：涂抹湿凝胶泡沫后，颅骨会迅速风干。如果需要进一步干燥，可使用棉签。
    注意：颅骨厚度不均匀。例如，顶颞嵴是颅骨最厚的区域，而靠近中线和鳞状缝标志的颅骨区域相对较薄。
  7. 钻孔过程中，应定期用镊子或不旋转的钻头轻轻按压颅骨，检查是否出现变形。当骨片开始发生变形时，立即停止钻孔，并将整个窗区浸入脑缓冲液中。
    注意：如果血液从某个区域迅速涌出，可能提示硬脑膜已受损。若出现此情况，应将一块半湿的明胶海绵覆盖在该区域，并用棉签轻轻按压海绵，以吸收血液并施加轻柔压力。
  8. 在去除颅骨前至少等待5分钟，以软化骨骼并降低硬脑膜黏附于骨骼的可能性，从而使颅骨去除过程更加容易。
  9. 在颅骨浸没于脑组织缓冲液的条件下进行颅骨去除操作。
    注意：如果部分颅骨仍难以剥离，可使用#11手术刀片轻轻划开颅骨。务必格外小心，避免刀片刺穿颅骨进入脑组织。
  10. 从前方边缘开始，用镊子轻轻将松动的颅骨从硬脑膜上剥离。
    注意：如果在去除颅骨过程中出现少量出血，需用移液管或注射器移除缓冲液，然后更换新的缓冲液。
  11. 一旦骨骼松动且 "漂浮" 在硬脑膜上，用镊子牢固夹住骨片，并将骨片从硬脑膜上抬起。确保骨片切勿刺入脑组织。
  12. 为控制出血，将组织的一角卷成尖头状，吸除颅骨窗内大部分缓冲液。迅速将预先用缓冲液浸泡过的明胶海绵敷于出血区域，同时用棉签轻轻施加轻微压力。
    注意：出血通常来自骨缘或硬脑膜表面；这两种情况均属正常，只要未损伤主要血管，出血会迅速停止。如果出血持续，血液可能充满整个成像窗口，在成像区域形成一层血凝块。
    1. 为了移除血块片，需小心地从成像区域拾取凝结的血块碎片，同时保留破裂血管出血源周围的血块完整。注意不要清除出血源处的血块，以免造成更严重的失血。用脑缓冲液冲洗脑表面，以清除残留的血液。
    2. 注意避免触碰脆弱的脑组织或将外来物质带入脑内；重复操作直至出血停止，约持续 2 - 5 分钟（图2E).
      注意：此时开颅已完成，可进行颅窗制备（见步骤5）。如需在植入颅窗前去除硬脑膜（见步骤4）。

4. 硬脑膜去除

注意：硬脑膜的剥离需要极其小心，可能需要超过 15 分钟。

  1. 吸除颅骨开窗处多余的缓冲液。在保持表面湿润的同时，用镊子夹住一小片硬脑膜并轻轻撕开。
  2. 使用镊子和弹簧剪轻轻撕开并剪除硬脑膜。
  3. 在脑表面滴加更多脑缓冲液，使硬脑膜漂浮并帮助其与脑组织分离。持续操作直至颅窗区域的硬脑膜完全去除。操作正确时，脑组织表面应显得非常干净，血管清晰可见，无任何瑕疵（对比 图2E 与 2F).
    注意：硬脑膜的某些区域附着于脑表面的小动脉上（例如，靠近顶叶联合区近中线处），去除该区域时可能撕裂小动脉。此时，可保留小块硬脑膜覆盖在小动脉上方。虽然电压敏感染料成像可能无法穿透该小区域，但相比发生大出血，此处理更为可取。
  4. 尽快用琼脂糖固定脑表面，以尽量减少脉动引起的移动并防止进一步肿胀（参见步骤5）。

5. 制备颅窗

  1. 用70%乙醇喷洒盖玻片，并使用压缩空气罐轻轻吹干。确保玻片完全清洁，无任何斑点或灰尘残留。
  2. 通过将200 mg琼脂糖粉末溶于15 mL脑缓冲液中，加热制备1.3%琼脂糖溶液。将微波炉调至高火，每次加热10–15秒，期间轻轻搅拌，直至琼脂糖完全溶解。
    注意：确保溶液中无气泡或颗粒存在，否则会影响成像质量。
  3. 将温度计插入热琼脂糖溶液中，冷却至略高于凝固温度（约40 °C）。
    注意：用冷水冲洗琼脂糖容器外壁可加快冷却过程。持续轻轻搅拌，确保无气泡或颗粒产生。
  4. 在施加琼脂糖前，立即从颅窗中移除脑缓冲液。用移液管吸取琼脂糖溶液，直接滴加到脑组织表面。迅速将盖玻片覆盖其上，并在四个角滴加琼脂糖液滴以固定盖玻片。

6. 安乐死

注意：根据我们的经验，经验丰富的外科医生至少需要进行 3 - 4 次练习手术，才能达到超过 90% 的成功率。经验较少的外科医生可能需要更多的练习。在开颅或硬脑膜切开过程中，脑组织可能会受到损伤，例如钻头穿透颅骨进入脑组织。开颅边缘出现轻微损伤可能是允许的。然而，如果脑组织外观不呈现"清洁"状态，即未见鲜红色的完整血管和白色的皮层，则可能需要终止实验。制备不良的例子包括血管坏死，或皮层上出现撕裂或损伤的血管。如果出现上述任何迹象，实验将难以获得高质量的数据。 无论手术/实验是否成功，均应在实验结束后人道处死小鼠。

  1. 使用至少 3.5% 异氟烷进行深度麻醉，随后以 300 mg/kg 剂量腹腔注射戊巴比妥钠。理想情况下，若针头插入肝脏，动物将迅速死亡（< 1 分钟）。
  2. 若需要灌注，请在继续操作前确认动物已深度麻醉（见步骤 1.3）。
  3. 或者，若无需灌注，则等待至少 5 分钟后确认小鼠已死亡。需确认呼吸、心跳消失，且无疼痛退缩反应和角膜反射。同时观察四肢是否呈现苍白发蓝或白色，以及大脑皮层表面血管是否变暗。

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结果

为了研究单侧大脑半球内皮层区域之间的相互作用，我们采用了一个跨越矢状窦并向外侧延伸5 - 6 mm的大颅骨开窗。该颅窗涵盖了右侧脑半球的初级皮层（运动、体感、视觉、听觉）、次级皮层（运动、视觉）以及联合皮层（压后皮层、扣带皮层、顶叶联合皮层）（图3A）。本研究使用了电压敏感染料（VSD）成像技术，该技术可反映膜电位的变化3。该方案同样适用于其他外源性（例如，钙17和谷氨酸18成像）或内源性成像实验。在使用0.5%异氟烷轻度麻醉的小鼠中，对后肢、前肢、须部、视觉或听觉系统进行刺激时，我们观察到皮层去极化的共识性模式（图3B）。与先前的研究结果一致5,19,

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讨论

这种创新的大颅窗手术方案能够同时对大脑皮层的颞叶和顶叶区域进行成像。结合光学成像技术，有助于揭示皮层区域在自发活动和刺激诱导活动期间的神经动态。这种大范围开颅手术还可暴露大面积的皮层血管网络，包括大脑中动脉（MCA）的近端部分，从而实现 体内 血流成像及对侧支血管的直接操控用于缺血模型。该技术将对近期开发的表达电压和钙离子指示蛋白的小鼠品系具有重要应用价值23这些小鼠具有实际优势，可避免在皮层上孵育电压敏感性染料的需要。这类外源性染料需较长时间才能充分渗透脑组织（约 60 - 90 分钟），且存在轻度毒性限制。此前也有研究通过大范围开颅来利用电压敏感性染料成像（VSDI）观察发育中的大鼠脑部活动。11新生大鼠的头部明显更大，体型与成年小鼠相当。这为研究人员提供了一个独特的机会来研究神经科学中的发育问题，尽管无法使用转基因小鼠进行此类研究。

该方法的主要局限性在于无法进行慢性实验。由于颅骨具有曲率，使得钻孔过程比小骨窗开颅更为困难且耗时。对于这种大骨窗开颅，至关重要的是调...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究得到了加拿大自然科学与工程研究理事会（NSERC）发现基金 #40352、阿尔伯塔省创新计划校园主席基金、阿尔伯塔阿尔茨海默病研究计划对 MHM 的资助，以及 NSERC BIF 博士生奖学金和 AIHS 研究生奖学金对 MK 的资助。我们感谢 Pu Min Wang 在本实验方案开发及手术培训中的贡献，感谢 Behroo Mirza Agha 和 Di Shao 在动物饲养方面的协助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
加热垫FHC40-90-2
精细剪刀Fine Science Tools14058-09
镊子 Fine Science Tools11251-35建议准备2对或以上
弹簧剪Fine Science Tools15000-00, 15000-10应指定1对专用于硬脑膜剥离 
Jet 牙色粉末LANG DentalJet Tooth Shade Powder需与 Jet 液体混合使用
Jet 牙色液体LANG DentalJet Tooth Shade Liquid需与 Jet 粉末混合使用 
钻头 - 碳化钨车针 FG 1/4 389Midwest Dental385201
琼脂糖粉末Sigma-AldrichA9793
明胶海绵（Gelfoam）Sinclair Dental CanadaPfizer Gelfoam
异氟烷Western Drug Distribution Centre Ltd124125
2% 利多卡因肾上腺素Western Drug Distribution Centre Ltd125299
地塞米松 5 mg/mLWestern Drug Distribution Centre Ltd125231
丁基氰基丙烯酸酯胶（VetBond）Western Drug Distribution Centre Ltd12612

参考文献

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