一种用于脑活动介观宽场光学成像的大范围侧颅开颅术

摘要

本方案介绍了一种在小鼠大脑皮层的颞区和顶区创建大型单侧开颅窗的方法。该方法特别适用于对大脑半球大范围区域进行实时成像。

摘要

开颅手术是一种常用于暴露脑组织的手术操作 体内 实验。在小鼠研究中，大多数实验室采用小尺寸的颅骨开窗，通常为3 mm × 3 mm。本方案介绍一种制备显著更大的7 mm × 6 mm颅窗的方法，可暴露小鼠颞叶和顶叶皮层上方的大部分大脑半球例如， 前囟2.5 - 4.5 mm，外侧0 - 6 mm。实施该手术时，头部需倾斜约30°，并需充分牵开大部分颞肌。由于需去除大量颅骨，该术式仅适用于全程在麻醉状态下进行的急性实验。

这种创新的大范围侧颅窗的主要优势在于能够同时接触大脑皮层的内侧和外侧区域。这种大范围的单侧颅窗可用于研究细胞之间以及不同皮层区域之间的神经动态，结合多电极电生理记录、神经元活动成像（例如，内在或外在成像）以及光遗传学刺激等多种技术。此外，这种大范围开颅还暴露了大面积的皮层血管，从而允许直接操控外侧皮层的血管系统。

引言

开颅手术是神经科学家用于暴露部分大脑的标准操作。自电生理学诞生以来，开颅手术推动了神经科学领域的诸多突破性进展。通过电极对大脑皮层进行高密度定位映射，已促成大量基于这些图谱的假说与理论验证实验。我们最近进入了一个新的时代，开颅手术正被用于 体内 皮层血流成像^1,2,3 神经血管结构⁴，从而实现对暴露区域皮层活动的实时可视化观察^5,6,7尽管许多研究采用开颅术联合 体内 光学成像技术用于研究皮层神经元、胶质细胞及皮层血管的结构与功能^8,9，但进一步的研究受到暴露皮层面积较小的限制（但参见¹⁰).

本实验方案的目的是提供一种方法，用于制作一个较大的侧向颅骨开窗，暴露从正中线至鳞状骨、并延伸超过前囟和后囟的大脑皮层。这种大范围的颅骨开窗可同时观察联合皮层（压后皮层、扣....

方案

以下方案遵循莱斯布里奇大学动物护理委员会（ACC）的指南，并按照加拿大动物护理委员会（CCAC）的标准进行。

1. 准备

1. 对于长期研究，需将所有已打开的外科手术用品进行高压灭菌，并确保手术全程维持无菌状态。若需进行多次手术，每次手术之间均应重新高压灭菌。 
2. 确保备有充足的脑缓冲液（至少 50 mL）。该溶液包含 134 mM 氯化钠、5.4 mM 钾、1 mM 六水合氯化镁、1.8 mM 二水合氯化钙，以及 5 mM HEPES 钠，用 5 M 盐酸调节 pH 至 7.4。
3. 将小鼠置于诱导室中，使用 3 - 4% 异氟烷进行麻醉诱导，术中维持麻醉时使用 1.0 - 2.0% 异氟烷。 成像期间可进一步降低至 0.4 – 0.8%，前提是维持适当的麻醉深度。^5,13,14,15 此类低浓度麻醉需对小鼠进行密切且频繁的监测（约每 5 分钟一次），以确保其对疼痛刺激无反射反应。
   注意： 由于小鼠体表面积与体积比高，且长时间使用异氟烷会加重症状，脱水可能成为问题。
   1. 每 1 - 2 小时皮下注射生理盐水....

结果

为了研究单侧大脑半球内皮层区域之间的相互作用，我们采用了一个跨越矢状窦并向外侧延伸5 - 6 mm的大颅骨开窗。该颅窗涵盖了右侧脑半球的初级皮层（运动、体感、视觉、听觉）、次级皮层（运动、视觉）以及联合皮层（压后皮层、扣带皮层、顶叶联合皮层）（图3A）。本研究使用了电压敏感染料（VSD）成像技术，该技术可反映膜电位的变化³。该方案同样适用于其他外源性（例如，钙¹⁷和谷氨酸¹⁸成像）或内源性成像实验。在使用0.5%异氟烷轻度麻醉的小鼠中，对后肢、前肢、须部、视觉或听觉系统进行刺激时，我们观察到皮层去极化的共识性模式（图3B）。与先前的研究结果一致^5,19,

讨论

这种创新的大颅窗手术方案能够同时对大脑皮层的颞叶和顶叶区域进行成像。结合光学成像技术，有助于揭示皮层区域在自发活动和刺激诱导活动期间的神经动态。这种大范围开颅手术还可暴露大面积的皮层血管网络，包括大脑中动脉（MCA）的近端部分，从而实现 体内 血流成像及对侧支血管的直接操控用于缺血模型。该技术将对近期开发的表达电压和钙离子指示蛋白的小鼠品系具有重要应用价值²³这些小鼠具有实际优势，可避免在皮层上孵育电压敏感性染料的需要。这类外源性染料需较长时间才能充分渗透脑组织（约 60 - 90 分钟），且存在轻度毒性限制。此前也有研究通过大范围开颅来利用电压敏感性染料成像（VSDI）观察发育中的大鼠脑部活动。¹¹新生大鼠的头部明显更大，体型与成年小鼠相当。这为研究人员提供了一个独特的机会来研究神经科学中的发育问题，尽管无法使用转基因小鼠进行此类研究。

该方法的主要局限性在于无法进行慢性实验。由于颅骨具有曲率，使得钻孔过程比小骨窗开颅更为困难且耗时。对于这种大骨窗开颅，至关重要的是调.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
加热垫	FHC	40-90-2
精细剪刀	Fine Science Tools	14058-09
镊子	Fine Science Tools	11251-35	建议准备2对或以上
弹簧剪	Fine Science Tools	15000-00, 15000-10	应指定1对专用于硬脑膜剥离
Jet 牙色粉末	LANG Dental	Jet Tooth Shade Powder	需与 Jet 液体混合使用
Jet 牙色液体	LANG Dental	Jet Tooth Shade Liquid	需与 Jet 粉末混合使用
钻头 - 碳化钨车针 FG 1/4 389	Midwest Dental	385201
琼脂糖粉末	Sigma-Aldrich	A9793
明胶海绵（Gelfoam）	Sinclair Dental Canada	Pfizer Gelfoam
异氟烷	Western Drug Distribution Centre Ltd	124125
2% 利多卡因肾上腺素	Western Drug Distribution Centre Ltd	125299
地塞米松 5 mg/mL	Western Drug Distribution Centre Ltd	125231
丁基氰基丙烯酸酯胶（VetBond）	Western Drug Distribution Centre Ltd	12612