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方法文章

基于聚丙烯酰胺的简易多孔硬度检测法用于研究细胞对基质硬度的依赖性反应

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DOI：

10.3791/52643

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2015年3月25日

 ,  , 
1Biomedical Engineering Department, Saint Louis University

本文内容

摘要

本文介绍了一种可在多孔板中快速、高效且低成本制备聚丙烯酰胺凝胶的方法。该方法无需任何专用设备，任何研究实验室均可轻松采用。该方法在致力于研究刚度依赖性细胞反应的研究中尤为有用。

摘要

目前，大多数 体外 细胞研究通常在刚性组织培养用聚苯乙烯表面（约1 GPa）上进行，而体内大多数细胞附着于弹性且柔软得多的基质（0.1–100 kPa）上。由于这种刚度差异显著影响细胞行为，因此人们迫切希望开发出刚度范围广泛的水凝胶材料，用作细胞培养基底。聚丙烯酰胺凝胶成本低廉，其刚度可覆盖体内所有软组织的范围，已成为许多研究团队首选的水凝胶材料。然而，聚丙烯酰胺凝胶的制备过程耗时、繁琐，且仅适用于小批量制备。本文介绍一种利用永久性柔性塑料薄膜作为凝胶结构支撑的实验方法，可在多孔板中制备聚丙烯酰胺凝胶。该技术比现有方法更快速、高效且成本更低，并可制备常规条件下无法获得的定制尺寸凝胶。由于无需任何专用设备，该方法易于被各类研究实验室采用，尤其适用于探究基质刚度依赖性细胞反应的研究。 关键词：细胞研究，聚丙烯酰胺凝胶，水凝胶，基质刚度，多孔板，柔性塑料薄膜，细胞反应

引言

人体大多数组织都是柔软的粘弹性材料，其杨氏模量范围从脑组织的0.1 kPa到软骨组织的100 kPa不等，然而，大多数 体外 细胞研究通常在组织培养用聚苯乙烯（TCP）上进行，其模量约为1 GPa。1 这种刚度不匹配显著影响细胞对其环境的响应方式。因此，越来越多的研究致力于阐明基底刚度对各类细胞命运的影响，2,3 包括干细胞。4 因此，已开发出多种水凝胶以帮助研究刚度依赖性细胞生物学，包括聚丙烯酰胺（PA），5-7 聚乙二醇（PEG）8,9 聚二甲基硅氧烷（PDMS）10 和海藻酸盐。11 尽管基质硬度显著影响细胞命运的证据日益增多，但大多数研究仍局限于小规模样本。针对多种细胞类型或环境条件下基质硬度效应的系统性、多维度研究仍然罕见。12

目前已开发出多种有前景的高通量水凝胶技术，包括基于聚乙二醇（PEG）的微阵列13、用于制备琼脂糖水凝胶微珠的微流控装置14，以及通过微柱直径和高度调节刚度的微米和纳米级棒状结构15。然而，制备此类基底的技术较为复杂，仅有少数实验室具备相关条件。大量涉及刚度调控细胞响应的研究采用聚丙烯酰胺（PA）凝胶，这种材料不仅成本低廉、操作简便，而且其杨氏模量处于生理相关范围内，即 0.3 – 300 kPa16–22。然而，现有用于细胞培养的PA凝胶制备方法劳动强度大，因此通常只能小批量制备。PA凝胶作为细胞基底在制备过程中存在若干难点，主要源于以下要求：1）需在无氧环境中进行以确保完全聚合；2）表面必须平整光滑，以促进细胞均匀贴附和铺展；3）必须牢固固定于细胞培养皿底部，防止凝胶漂浮。

多个研究团队曾尝试批量制备用于细胞培养的PA凝胶。Semler 等 制备较厚的PA凝胶片，然后用打孔器打孔并放入96孔板中。23 然而，该方法仅限于较硬的凝胶。 即， > 1 kPa的杨氏模量，因为较软的凝胶具有“黏性”，难以切割且易受损。Mih 等 开发了一种更为精密的技术，可使凝胶直接在玻璃底多孔板中聚合。6 通过将凝胶溶液倒入经过功能化的玻底板中，并使用定制的盖玻片阵列进行“三明治”式封装来形成凝胶。6 尽管该技术前景良好，但仍观察到轻微的边缘效应。此外，该技术需要定制设计的阵列，而这类阵列并非大多数实验室可立即获得，同时还需使用成本较高的玻璃底多孔板。

本文介绍了一种在多孔板中组装聚丙烯酰胺（PA）凝胶的简单且低成本的方法，该方法可被任何实验室轻松采用。此处使用了一种具有两面性的柔性塑料支撑材料：一面为疏水性，对PA凝胶具有排斥作用；另一面为亲水性，可在PA凝胶沉积后与其发生共价结合。一旦PA凝胶片层沉积并永久固定于该柔性塑料支撑材料上，即可方便地操作任意厚度或硬度的凝胶，并将其切割成任意所需形状。该方法不仅能制备市面上通常无法获得的特定尺寸的定制塑料“盖玻片”，还省去了对玻璃表面（包括玻璃盖玻片或昂贵的玻璃底多孔板的孔壁）预先用PA结合溶液进行处理的步骤，而这一预处理过程通常繁琐且耗时。最后，可批量制备均匀的PA凝胶片层，并以脱水状态保存数月之久。

总之，本实验方法在多个方面对现有技术有所改进。首先，多孔板的组装过程高效，且所需材料的总体成本较低。其次，水凝胶可在单一均质凝胶膜中大规模批量制备。最后，仅需使用 commercially available 的材料即可完成实验。通过探究基质刚度对细胞形态和铺展面积的影响，展示了该检测方法的应用价值。

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方案

1. 水凝胶相关溶液和分装样品的制备

  1. 聚丙烯酰胺凝胶前体溶液的制备。
    1. 通过将丙烯酰胺（A）（40% w/v，Mr 71.08 g/mol）、交联剂双丙烯酰胺（B）（2% w/v，Mr 154.17 g/mol）和去离子水按表1中指定的体积百分比混合，制备聚丙烯酰胺凝胶前体溶液。
      注意：这些溶液可大量配制，并在4 °C下保存数月。
      1. 注意：丙烯酰胺在吸入或摄入时具有毒性，尤其是粉末形式：因此，建议使用40% w/v的溶液以降低毒性风险。操作时必须穿戴防护服，如手套、护目镜和实验服。储存于避光、密封容器中，并置于冰箱内（<23 °C，通风良好区域）。
      2. 注意：双丙烯酰胺在吸入或摄入时具有毒性，尤其是粉末形式：因此，建议使用2% w/v的溶液以降低毒性风险。操作时必须穿戴防护服，如手套、护目镜和实验服。储存于避光、密封容器中，并置于冰箱内（<4 °C，通风良好区域）。
  2. N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯（Sulfo-SANPAH，Mr 492.40 g/mol）分装液的制备与使用。注意：Sulfo-SANPAH会引起严重的眼部刺激；操作时需佩戴手套及适当的眼部或面部防护装置。收到后应于-20 °C保存，并在分装前保持该温度。
    1. 储存Sulfo-SANPAH的方法：将Sulfo-SANPAH溶于二甲基亚砜（DMSO）中，浓度为50 mg/ml。将储备液分装至50个微量离心管中，每管20 μl。在干冰或液氮中快速冷冻（可选但推荐步骤，以最大程度保持交联剂活性），然后于-80 °C保存。
      注意：分装后的样品可保存数月。
    2. 使用Sulfo-SANPAH的方法：短暂解冻分装液，并用480 μl去离子水稀释。立即使用。Sulfo-SANPAH在水中水解迅速：因此需注意尽快完成上述所有步骤。
  3. 过硫酸铵（Mr 228.18 g/mol）分装液的制备。
    注意：过硫酸铵会引起眼部、皮肤和呼吸道刺激。操作时应穿戴适当的个人防护装备。在化学通风橱中处理过硫酸铵粉末。将粉末储存于干燥、通风良好的地方。分装后的稀释溶液可在工作台使用。
    1. 将过硫酸铵溶于去离子水中，使其最终浓度为10% w/v。分装后于-20 °C保存。使用前立即解冻。
  4. Ⅰ型胶原溶液的制备。
    1. 通过将储备液用pH 7.4的1×磷酸盐缓冲液（PBS）稀释，制备0.2 mg/ml的胶原溶液。稀释后短暂置于冰上或立即使用。

2. 水凝胶制备（参见图1）

  1. 疏水性玻片的制备
    1. 在玻璃板上滴加数滴疏水溶液，用纸巾将溶液均匀涂抹至整个表面。静置晾干后，再次用纸巾擦拭，使疏水涂层分布均匀。
      注意：将疏水性溶液在室温下储存于易燃物专用柜中。操作时需佩戴个人防护装备，并在通风良好的区域进行工作。
  2. 柔性塑料支架的制备
    1. 将柔性塑料支撑物裁剪至与疏水涂层玻璃板尺寸相同。
    2. 用锋利的工具（如手术刀）在柔性塑料支撑物的表面轻轻划痕，以标记其疏水面。
      注意：凝胶完全透明，干燥后，划痕标记将有助于区分哪一侧的柔性塑料支撑板上含有凝胶。
      注意：柔性塑料支撑板具有疏水和亲水两侧。一旦沉积，聚丙烯酰胺会永久黏附于塑料支撑板的亲水侧，从而便于后续水凝胶的操作。
  3. 凝胶制备（以5 ml凝胶前体溶液为例给出体积）。
    注意：当凝胶初始厚度为0.5 mm时，5 ml足以制备约40块凝胶。若减少凝胶厚度，可制备更多凝胶。
    1. 加入4972.5 μl所需终浓度的聚丙烯酰胺前体溶液（表1) 转移至50 ml锥形管中，敞口置于脱气室中30分钟。
      注意：氧气可作为自由基捕获剂，其存在会抑制聚合反应。
    2. 加入25 µl 10% w/v 过硫酸铵（参见步骤1.3），使过硫酸铵的终浓度为0.05%。
    3. 加入 2.5 µl 的 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺（TEMED, Mr 116.24 g/mol）加入脱气的凝胶溶液中，使TEMED的终浓度为0.5%。
      注意：将TEMED储存在室温下的易燃品柜中。操作时应穿戴适当的个人防护装备，并在化学通风橱中进行。由于该物质对空气和水分高度敏感，需在惰性气体环境下密封保存。
    4. 轻轻吹打溶液3至5次以混匀。禁止涡旋，以避免氧气扩散进入凝胶前体溶液。
    5. 将凝胶溶液用移液器滴加到柔性塑料支撑片的亲水面上，并与涂有疏水层的玻璃盖片夹合。使用所需厚度的硅胶垫片将两张玻片隔开。例如， 0.5 mm）。在50 ml锥形管中保留少量（约100 μl）聚合前体溶液，用于指示凝胶化过程。
      注意：可使用任意垫片。例如，单层 Parafilm 膜可使凝胶最终溶胀厚度达到 100 – 120 μm。
    6. 在柔性塑料支撑物/凝胶夹层上方放置另一块玻璃板，以确保聚合后获得均匀的水凝胶表面。
    7. 让凝胶聚合45分钟，但若需要，较高质量分数的凝胶可缩短聚合时间。为确认凝胶是否已聚合，可观察50 ml锥形管中剩余的溶液；如果剩余溶液已发生凝胶化，则玻璃板上的凝胶化反应很可能也已开始。但需注意，过早打开模具将导致聚合不完全。
    8. 凝胶形成后，将带有共价结合的聚丙烯酰胺凝胶的柔性塑料支撑膜剥离下来，胶面朝上放置，晾干。
      注意：也可使用对流或加热干燥以加速此步骤。一旦凝胶干燥至柔性塑料支撑物上，可长期保存。
      1. 标记柔性塑料支撑物上的任何空白区域，这些区域因气泡导致未形成聚丙烯酰胺凝胶。应在凝胶仍处于水合状态时进行标记，因为一旦凝胶干燥，标记将与柔性塑料支撑物融合。

3. 多孔板组装、胶原蛋白包被及灭菌

  1. 多孔板组装。
    1. 干燥后，将聚丙烯酰胺（PA）凝胶切割成所需形状。
      1. 对于96孔板，使用直径约为6 mm的重型打孔器。使用重型切纸器将凝胶切割成方形或矩形；也可使用剪刀。
    2. 根据制造商说明，每块96孔板准备约500 μl的聚二甲基硅氧烷（PDMS）。为将凝胶粘附至多孔板底部，向每个孔的中心加入少量PDMS（约5 μl）。用镊子将一块聚丙烯酰胺凝胶放入每个孔中，确保柔性塑料支撑面朝下。为使PDMS固化，将组装好的板置于37 °C环境中至少4小时。
  2. 聚丙烯酰胺凝胶的胶原蛋白包被。
    1. 用移液管向每个孔中加入少量（7–8 μl）sulfo-SANPAH（参见第1.2.2步），并左右轻轻摇晃，使凝胶表面均匀覆盖。由于sulfo-SANPAH在水中不稳定，操作应迅速完成。
    2. 将板置于高强度紫外灯下（强度=37 mW，λ=302–365 nm）照射5分钟。用PBS冲洗凝胶，以去除未反应的sulfo-SANPAH。
    3. 向每个孔中加入50 µl浓度为0.2 mg/ml的I型胶原蛋白溶液（参见第1.4步）。将板盖好后在室温下放置至少2小时，或在4 °C过夜。
      注意：为加快胶原蛋白包被过程，可使用移液管加入胶原溶液。通常1–2滴溶液即可完全覆盖凝胶表面。
    4. 将板在室温下放置至少2小时，以促进胶原蛋白结合。
    5. 用PBS冲洗以去除多余的胶原溶液，并在生物安全柜中用紫外光（λ=200 nm）照射2小时进行灭菌。
    6. 将凝胶浸泡在完全培养基中（培养基成分见第4.1节）过夜，以充分水化和平衡。可立即用于细胞接种，或在冰箱中保存最多2天。

4. 在PA硬度测定中接种细胞

注意：尽管该方案通常适用于常见的哺乳动物细胞系，但本节所述方案专门用于乳腺癌 MDA-MB-231 细胞系（见图 4 和5）。

  1. 将组织培养瓶中的细胞在 37 °C 条件下用 5% 胰蛋白酶/EDTA 处理 5 分钟以收集细胞。每 cm2 培养瓶表面积使用约 80 μl 胰蛋白酶/EDTA；例如，T25 细胞培养瓶使用 2 ml 胰蛋白酶/EDTA。将收集的细胞重悬于完全培养基中，培养基中需添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素/链霉素，并调整至所需的目标细胞浓度。根据细胞倍增时间以及细胞在检测体系中培养的时间长短，选择合适的亚融合细胞浓度。确保加入的培养基足以完全浸没水凝胶。
    注意：由于水凝胶已在培养基中预先平衡（参见步骤 3.2.6），100 μl 体积通常已足够。对于多孔板，使用常规培养基体积即可，因为凝胶已在前一步骤中完成预平衡。
    注意：该检测适用于任何依赖贴壁生长的细胞类型。
    1. 使用血细胞计数板在倒置显微镜下计数细胞数量。将 10 µl 细胞悬液加入血细胞计数板的每个加样口，至少统计 8 个象限的细胞数并取平均值。为获得最终细胞浓度，将细胞计数结果乘以 104。
      注意：当血细胞计数板每个象限内的细胞数为 20 – 50 时，可获得最佳计数结果。
  2. 将细胞接种至 PA 刚度检测体系中，在 37 °C、5% CO2 的湿润培养箱中进行培养。每 2 – 3 天更换一次培养基。需要时，在 37 °C 条件下用 5% 胰蛋白酶/EDTA 处理 5 分钟以收集细胞。每 cm2 组织培养瓶表面积使用约 80 μl 胰蛋白酶/EDTA。在所有细胞操作步骤中，需特别注意避免破坏水凝胶表面：吸液或加样时，可将多孔板略微倾斜，使移液器枪头接触每个孔的侧壁，而非直接接触水凝胶。
    注意：除在常规组织培养操作中需特别注意保护水凝胶表面外，接种于刚度检测体系中的细胞可按照接种于普通多孔板中的方式同样进行操作。

5. 在PA刚度测定法上接种细胞的成像

  1. 直接在PA刚度检测中对细胞进行成像。
    注意：可用于细胞成像的显微镜类型包括倒置显微镜、荧光显微镜或共聚焦显微镜。
    注意：用于构建刚度检测的柔性塑料支撑材料完全透明，无自发荧光，不会干扰细胞成像。然而，尽管柔性塑料支撑材料本身透明，成像能力仍受限于物镜的工作距离。该柔性塑料支撑材料厚度为0.23 mm，10X物镜的典型工作距离约为4 mm，且随着放大倍数升高，工作距离显著缩短。
    1. 对于活细胞成像，将PA刚度检测装置置于显微镜的培养皿 holder 中并进行成像。成像时间应控制在2小时以内，或使用配备环境培养舱的显微镜以支持更长时间的成像。
    2. 若无需进行活细胞成像，使用含0.1%去垢剂的4%甲醛溶液固定细胞。室温下浸泡固定至少2小时，随后用PBS洗涤两次。将固定液废弃物弃置于指定的废液容器中。
      注意：细胞可立即成像，或在4 °C条件下浸没于PBS中保存最多2周。注意：甲醛在吸入或接触时具有毒性，需在化学通风橱中佩戴手套操作。
      注意：细胞固定方案的选择应基于后续的染色和处理步骤，因为某些固定剂可能破坏特定细胞蛋白。
    3. 进行荧光成像时，在多孔板中直接对固定后的细胞使用所需的细胞染料进行染色，并立即成像。

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结果

聚丙烯酰胺（PA）凝胶被广泛用于研究细胞对基质刚度的依赖性响应。17,24 通过混合不同浓度的丙烯酰胺（A）和双丙烯酰胺（B），可以制备出弹性模量范围覆盖体内大多数软组织（0.3 – 300 kPa）的聚丙烯酰胺凝胶。1 然而，聚丙烯酰胺凝胶的制备过程繁琐且耗时，常常限制了其在药物筛选等“高通量”应用中的使用。12 本文介绍了一种在多孔板或任何其他所需组织培养容器中快速、简便组装PA凝胶的方法（图1）。图2A展示了不同A和B浓度下的弹性模量（结果亦总结于表1）。其他A和B组合的凝胶模量已有文献报道。17,25,26 完全溶胀凝胶的凝胶刚度通过流变仪（AR 2000ex流变仪，TA Instruments）测定，采用20 mm上平行几何结构，进行1 – 10 Hz的振荡频率扫描测试，并保持2%的恒定应变。如预期所示，储能模量G'和损耗模量G”均与频率无关（图2B）。此外，还证实了凝胶的干燥后再水化过程不会影响其弹性模量...

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讨论

聚丙烯酰胺凝胶最初是为电泳技术开发的28，如今已常规用作细胞培养基底，以研究基底刚度对细胞形态、运动性、通讯以及其他细胞特性的影响3,24,29。通过简单调节聚合物前体的浓度，即可调控聚丙烯酰胺基底的刚度，使其覆盖人体内所有软组织的刚度范围（0.3 – 300 kPa）1（图2，表1，另见参考文献17,25,26）。加之聚丙烯酰胺凝胶制备成本较低且操作简便，已成为研究刚度依赖性细胞-材料相互作用不可或缺的平台。然而，尽管制备方法相对简单，目前的聚丙烯酰胺凝胶制备技术仍局限于小批量生产。这一限制源于水凝胶凝胶化过程的本质：该过程是由过硫酸铵和TEMED催化的自由基聚合反应30。由于该反应属于自由基链式聚合，任何可作为自由基捕获剂的物质（如氧气）都可能抑制反应进程。因此，在聚合过程中必须避免氧气扩散进入聚合物溶液——对于最软的凝胶，该过程可能长达45分钟——这使得直接将聚丙烯酰胺溶液移液至开放式的多孔板中变得不可行。此外，作为二维（2D）细胞培养基底使用时，聚丙烯酰胺凝胶的表面必须保持平整。上述两项...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

本工作由圣路易斯大学为 Silviya Zustiak 博士提供的启动资金，以及圣路易斯大学授予 Silviya Zustiak 博士的校长研究基金（PRF）资助。我们感谢 Naveed Ahmed 和 Keval Shah 提供的技术支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
40% 丙烯酰胺Bio-Rad161-0140
2% 双丙烯酰胺Bio-Rad161-0142
过硫酸铵Bio-Rad161-07000
TEMEDSigma AldrichT9281
Sulfo-SANPAHThermo Scientific22589
Ⅰ型胶原蛋白（来自大鼠尾腱，3.68 mg/ml）BD Biosciences354236
二甲基亚砜（DMSO）Fisher ScientificBP231-100
疏水溶液 — Repel SilaneGE Healthcare Bio-Sciences17-1332-01
PBS (1x)，pH 7.4HyCloneSH30256.01
聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Slygard 182 弹性体试剂盒]Elsworth Adhesives3097358-1004
胰蛋白酶/EDTA (10x)Sigma Aldrich44174
RPMI-1640 培养基 (1x)HyCloneSH30027-02
胎牛血清HyCloneSH30073-03
青霉素-链霉素MP Biomedicals1670046
去垢剂：Triton-XSigma AldrichT8787
甲醛 37% 溶液Sigma AldrichF1635
牛血清白蛋白（BSA）Sigma AldrichA2153
基于 BSA 的细胞黏附封闭试剂盒 — ECM 细胞黏附阵列试剂盒Chemicon InternationalECM540
一次性实验耗材
柔性塑料支撑膜 — 用于聚丙烯酰胺凝胶的 GelBond PAG 膜GE Healthcare Bio-Sciences309819
玻璃板SlumpysGBS4100SFSL
50 ml 锥形管Fisher Scientific3181345107
15 ml 锥形管FALCON352097
微量离心管Fisher Scientific2 ml: 02681258
96 孔板（平底）Fisher Scientific12565501
一次性移液管（1 ml、2 ml、5 ml、10 ml、25 ml、50 ml）Fisher Scientific1 ml: 13-678-11B，2 ml: 05214038，5 ml (FALCON): 357529，10 ml: 13-678-11E，25 ml: 13-678-11，50 ml: 13-678-11F
玻璃转移移液管Fisher Scientific5 3/4": 1367820A，9":136786B
移液器吸头（1–200 μl、101–1000 μl）Fisher Scientific2707509
塑料标准一次性转移移液管Fisher Scientific13-711-9D
Parafilm 封口膜PARAFILM PM992
无粉检查手套Quest92897
硅胶垫片 — 硅胶片，厚 0.5 mm / 13 cm × 18 cmGrace Bio-LabsJTR-S-0.5
大型/非一次性实验设备
明场与荧光显微镜（Axiovert 200M）Zeiss3820005619
显微镜软件ZeissAxioVision Rel. 4.8.2
紫外烘箱UVITRONUV1080
真空室/脱气装置BelArt999320237
脱气装置用真空泵KNF Lab5097482
组织培养罩NUAIRENU-425-600
化学通风橱KEWAUNEE99151
倒置显微镜（Axiovert 25）Zeiss663526
培养箱NUAIRENU-8500
移液器辅助器Drummond Scientific Co.P-76864
血细胞计数板Bright-Line383684

参考文献

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