基于聚丙烯酰胺的简易多孔硬度检测法用于研究细胞对基质硬度的依赖性反应

摘要

本文介绍了一种可在多孔板中快速、高效且低成本制备聚丙烯酰胺凝胶的方法。该方法无需任何专用设备，任何研究实验室均可轻松采用。该方法在致力于研究刚度依赖性细胞反应的研究中尤为有用。

摘要

目前，大多数 体外 细胞研究通常在刚性组织培养用聚苯乙烯表面（约1 GPa）上进行，而体内大多数细胞附着于弹性且柔软得多的基质（0.1–100 kPa）上。由于这种刚度差异显著影响细胞行为，因此人们迫切希望开发出刚度范围广泛的水凝胶材料，用作细胞培养基底。聚丙烯酰胺凝胶成本低廉，其刚度可覆盖体内所有软组织的范围，已成为许多研究团队首选的水凝胶材料。然而，聚丙烯酰胺凝胶的制备过程耗时、繁琐，且仅适用于小批量制备。本文介绍一种利用永久性柔性塑料薄膜作为凝胶结构支撑的实验方法，可在多孔板中制备聚丙烯酰胺凝胶。该技术比现有方法更快速、高效且成本更低，并可制备常规条件下无法获得的定制尺寸凝胶。由于无需任何专用设备，该方法易于被各类研究实验室采用，尤其适用于探究基质刚度依赖性细胞反应的研究。 关键词：细胞研究，聚丙烯酰胺凝胶，水凝胶，基质刚度，多孔板，柔性塑料薄膜，细胞反应

引言

人体大多数组织都是柔软的粘弹性材料，其杨氏模量范围从脑组织的0.1 kPa到软骨组织的100 kPa不等，然而，大多数 体外 细胞研究通常在组织培养用聚苯乙烯（TCP）上进行，其模量约为1 GPa。¹ 这种刚度不匹配显著影响细胞对其环境的响应方式。因此，越来越多的研究致力于阐明基底刚度对各类细胞命运的影响，^2,3 包括干细胞。⁴ 因此，已开发出多种水凝胶以帮助研究刚度依赖性细胞生物学，包括聚丙烯酰胺（PA），^5-7 聚乙二醇（PEG）^8,9 聚二甲基硅氧烷（PDMS）¹⁰ 和海藻酸盐。¹¹ 尽管基质硬度显著影响细胞命运的证据日益增多，但大多数研究仍局限于小规模样本。针对多种细胞类型或环境条件下基质硬度效应的系统性、多维度研究仍然罕见。¹²

目前已开发出多种有前景的高通量水凝胶技术，包括基于聚乙二醇（PEG）的微阵列¹³、用于制备琼脂糖水凝胶微珠的微流控装置¹⁴，以及通过微柱直径和高度调节刚度的微米和纳米级棒状结构¹⁵。然而，制备此类基底的技术较为复杂，仅有少数实验室具备相关条件。大量涉及刚度调控细胞响应的研究采用聚丙烯酰胺（PA）凝胶，这种材料不仅成本低廉、操作简便，而且其杨氏模量处于生理相关范围内，即 0.3 – 30....

方案

1. 水凝胶相关溶液和分装样品的制备

1. 聚丙烯酰胺凝胶前体溶液的制备。
   1. 通过将丙烯酰胺（A）（40% w/v，M_r 71.08 g/mol）、交联剂双丙烯酰胺（B）（2% w/v，M_r 154.17 g/mol）和去离子水按表1中指定的体积百分比混合，制备聚丙烯酰胺凝胶前体溶液。
      注意：这些溶液可大量配制，并在4 °C下保存数月。
      1. 注意：丙烯酰胺在吸入或摄入时具有毒性，尤其是粉末形式：因此，建议使用40% w/v的溶液以降低毒性风险。操作时必须穿戴防护服，如手套、护目镜和实验服。储存于避光、密封容器中，并置于冰箱内（<23 °C，通风良好区域）。
      2. 注意：双丙烯酰胺在吸入或摄入时具有毒性，尤其是粉末形式：因此，建议使用2% w/v的溶液以降低毒性风险。操作时必须穿戴防护服，如手套、护目镜和实验服。储存于避光、密封容器中，并置于冰箱内（<4 °C，通风良好区域）。
2. N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4'-叠氮-2'-硝基苯氨基)己酸酯（Sulfo-SANPAH，M_r 492.40 g/mol）分装液的制备与使用。注意：Sulfo-SANPAH会引起严重的眼部刺激；操作时需佩戴手套及适当的眼部或面部防护装置。收到后应于-....

结果

聚丙烯酰胺（PA）水凝胶被广泛用于研究细胞对基质刚度的依赖性响应。^17,24 通过混合不同浓度的丙烯酰胺（A）和双丙烯酰胺（B），可以制备出弹性模量范围覆盖体内大多数软组织（0.3 – 300 kPa）的聚丙烯酰胺凝胶。¹ 然而，聚丙烯酰胺凝胶的制备过程繁琐且耗时，常常限制了其在药物筛选等“高通量”应用中的使用。¹² 本文介绍了一种在多孔板或任何其他所需组织培养容器中快速简便地组装PA凝胶的方法（图1）。图2A展示了不同A和B浓度下的杨氏模量（也在表1中进行了总结）。其他A和B组合的凝胶模量已在文献中报道。^17,25,26 完全溶胀凝胶的凝胶刚度通过流变仪（AR 2000ex流变仪，TA Instruments）测定，采用20 mm的上部平行几何结构，进行1 – 10 Hz的振荡频率扫描测试，并保持2%的恒定应变。正如预期，结果显示储能模量G’和损耗模量G”均与频率无关（图2B）。此外，还证实了将凝胶干燥后再重新水化.......

讨论

聚丙烯酰胺凝胶最初是为电泳技术开发的²⁸，如今已常规用作细胞培养基底，以研究基底刚度对细胞形态、运动性、通讯以及其他细胞特性的影响^3,24,29。通过简单调节聚合物前体的浓度，即可调控聚丙烯酰胺基底的刚度，使其覆盖人体内所有软组织的刚度范围（0.3 – 300 kPa）¹（图2，表1，另见参考文献^17,25,26）。加之聚丙烯酰胺凝胶制备成本较低且操作简便，已成为研究刚度依赖性细胞-材料相互作用不可或缺的平台。然而，尽管制备方法相对简单，目前的聚丙烯酰胺凝胶制备技术仍局限于小批量生产。这一限制源于水凝胶凝胶化过程的本质：该过程是由过硫酸铵和TEMED催化的自由基聚合反应³⁰。由于该反应属于自由基链式聚合，任何可作为自由基捕获剂的物质（如氧气）都可能抑制反应进程。因此，在聚合过程中必须避免氧气扩散进入聚合物溶液——对于最软的凝胶，该过程可能长达45分钟——这使得直接将聚丙烯酰胺溶液移液至开放式的多孔板中变得不可行。此外，作为二维（2D）细胞培养基底使用时，聚丙烯酰胺凝胶的表面必须保持平整。上述两项.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
40% 丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0140
2% 双丙烯酰胺	Bio-Rad	161-0142
过硫酸铵	Bio-Rad	161-07000
TEMED	Sigma Aldrich	T9281
Sulfo-SANPAH	Thermo Scientific	22589
Ⅰ型胶原蛋白（来自大鼠尾腱，3.68 mg/ml）	BD Biosciences	354236
二甲基亚砜（DMSO）	Fisher Scientific	BP231-100
疏水溶液 — Repel Silane	GE Healthcare Bio-Sciences	17-1332-01
PBS (1x)，pH 7.4	HyClone	SH30256.01
聚二甲基硅氧烷（PDMS）[Slygard 182 弹性体试剂盒]	Elsworth Adhesives	3097358-1004
胰蛋白酶/EDTA (10x)	Sigma Aldrich	44174
RPMI-1640 培养基 (1x)	HyClone	SH30027-02
胎牛血清	HyClone	SH30073-03
青霉素-链霉素	MP Biomedicals	1670046
去垢剂：Triton-X	Sigma Aldrich	T8787
甲醛 37% 溶液	Sigma Aldrich	F1635
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma Aldrich	A2153
基于 BSA 的细胞黏附封闭试剂盒 — ECM 细胞黏附阵列试剂盒	Chemicon International	ECM540
一次性实验耗材
柔性塑料支撑膜 — 用于聚丙烯酰胺凝胶的 GelBond PAG 膜	GE Healthcare Bio-Sciences	309819
玻璃板	Slumpys	GBS4100SFSL
50 ml 锥形管	Fisher Scientific	3181345107
15 ml 锥形管	FALCON	352097
微量离心管	Fisher Scientific	2 ml: 02681258
96 孔板（平底）	Fisher Scientific	12565501
一次性移液管（1 ml、2 ml、5 ml、10 ml、25 ml、50 ml）	Fisher Scientific	1 ml: 13-678-11B，2 ml: 05214038，5 ml (FALCON): 357529，10 ml: 13-678-11E，25 ml: 13-678-11，50 ml: 13-678-11F
玻璃转移移液管	Fisher Scientific	5 3/4": 1367820A，9":136786B
移液器吸头（1–200 μl、101–1000 μl）	Fisher Scientific	2707509
塑料标准一次性转移移液管	Fisher Scientific	13-711-9D
Parafilm 封口膜	PARAFILM	PM992
无粉检查手套	Quest	92897
硅胶垫片 — 硅胶片，厚 0.5 mm / 13 cm × 18 cm	Grace Bio-Labs	JTR-S-0.5
大型/非一次性实验设备
明场与荧光显微镜（Axiovert 200M）	Zeiss	3820005619
显微镜软件	Zeiss	AxioVision Rel. 4.8.2
紫外烘箱	UVITRON	UV1080
真空室/脱气装置	BelArt	999320237
脱气装置用真空泵	KNF Lab	5097482
组织培养罩	NUAIRE	NU-425-600
化学通风橱	KEWAUNEE	99151
倒置显微镜（Axiovert 25）	Zeiss	663526
培养箱	NUAIRE	NU-8500
移液器辅助器	Drummond Scientific Co.	P-76864
血细胞计数板	Bright-Line	383684