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EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒

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DOI：

10.3791/52646

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2016年1月16日

 ,  ,  ,  ,  , 
1National Exposure Research Laboratory, U.S. Environmental Protection Agency, 2Technical Services Center, Office of Ground Water and Drinking Water, U.S. Environmental Protection Agency

本文内容

摘要

本文介绍了一种利用反转录-定量PCR方法对环境水和饮用水中肠道病毒和诺如病毒进行定量的实验流程。采用美国环境保护署方法1615（EPA Method 1615）的标准流程，从地下水中回收病毒的平均效率为：脊髓灰质炎病毒20%，小鼠诺如病毒30%。

摘要

EPA 方法 1615 用于检测环境水和饮用水中存在的人肠道病毒和诺如病毒。该方法的开发旨在为《未受控污染物监测规则》第 3 轮监测期间多个分析实验室使用提供一种标准化方法。本文介绍了从水样浓缩物中提取病毒核糖核酸（RNA）以及利用逆转录-定量 PCR（RT-qPCR）定量检测人肠道病毒和诺如病毒浓度的实验方案。分子检测中的病毒浓度依据标准曲线，以每升水中病毒 RNA 的基因组拷贝数表示。该方法采用多种质量控制措施，以提高数据质量，并减少实验室间和实验室内的变异。该方法通过在地下水和试剂纯度级别的水中添加脊髓灰质炎病毒 3 型和鼠诺如病毒（作为人诺如病毒的替代物）来评估病毒回收率。脊髓灰质炎病毒在地下水中的平均回收率为 20%，在试剂纯度水中的平均回收率为 44%；RT-qPCR 检测中鼠诺如病毒在地下水中的平均回收率为 30%，在试剂纯度水中的平均回收率为 4%。

引言

定量 PCR（qPCR；本文所用术语的定义见补充材料）和逆转录-定量 PCR（RT-qPCR）是检测和定量环境水样及饮用水中人源肠道病毒的有力工具，尤其适用于许多无法在细胞培养系统中增殖或增殖能力较差的病毒。这两种技术均已证实，全球范围内的环境水和饮用水中普遍存在多种类型的病毒1-6。在疾病暴发调查中，结合扩增基因组片段的测序分析使用这些技术，已为水源性病毒传播提供了证据，表明饮用水中检出的病毒与暴发病例患者排出的病毒完全一致7-10。

qPCR 和 RT-qPCR 均是有效的公共卫生工具。例如，美国环境保护署（EPA）开展的研究数据显示，通过 qPCR 测定的指示物水平与娱乐用水中的健康效应之间存在显著关联。因此，EPA 2012 年发布的最终《娱乐用水水质标准》中纳入了用于监测娱乐性海滩的 qPCR 方法11,12。Borchardt 及其同事还发现，使用未经处理的地下水源社区中急性胃肠炎的发病率与通过 RT-qPCR 检测到的地下水中病毒之间存在显著相关性1。

本文旨在介绍美国环保署方法1615（EPA Method 1615）13,14中的分子检测部分。该检测采用反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR），根据通过正电滤膜的环境水或饮用水原始体积，定量估算每升水中肠道病毒和诺如病毒的基因组拷贝数（GC）。分子检测流程的概览见图1。方案第1节详细说明了标准曲线的制备步骤，这些标准品由含有所有引物/探针组目标序列RNA拷贝的试剂制备而成。第2节描述了三级浓缩程序。第3节给出了从浓缩水样及对照样品中提取RNA的操作流程。每个测试样品的RNA通过三重重复反应和随机引物进行反转录以启动转录过程（第4节）。每个反转录反应所得的cDNA被均分为五份，分别用于五种病毒特异性的qPCR检测，每种检测均进行三重重复分析（第5节；图2）。该检测采用来自科学文献中的引物和探针（表1），可检测多种肠道病毒和诺如病毒，同时使用含有庚型肝炎病毒（hepatitis G）RNA的试剂以识别对RT-qPCR具有抑制作用的测试样品15。

方案

注意：使用数据表记录方案的所有步骤；补充材料中的表S2-S4提供了示例数据表。

1. 标准曲线制备

  1. 制备标准曲线试剂的工作液（例如，通过将制造商提供的浓度稀释至2.5 × 108 颗粒/毫升（2.5 × 108 GC/ml）使用TSM III缓冲液。将工作液分装至1.5 ml微量离心管中，每管250 µl，并于-20 °C保存。
    注意：有关制备病毒和质粒工作液作为替代标准曲线试剂的操作说明，请参见补充材料方案步骤S1。
  2. 解冻一份或多份工作储备液。使用1.5 ml微量离心管制备五次10倍系列稀释液，得到浓度分别为2.5 x 107，2.5 × 106，2.5 × 105，2.5 × 104，以及 2.5 × 103 GC/ml
    1. 通过将25 µl的2.5 x 108 将GC/ml工作液加入225 µl TSM III缓冲液中，使用涡旋混合器混匀5–15秒。
    2. 将步骤1.2.1中制备的稀释液25 µl加入225 µl TSM III缓冲液中，制备下一个稀释度。再次混匀，并继续采用类似方法制备后续三个10倍稀释液。
  3. 立即使用第3节中的步骤，从标准曲线工作原液及其五个稀释样本中提取RNA。

2. 三级浓缩

  1. 为每个收集的样品准备一个离心浓缩管（30,000 分子量截留），向其上层样品室加入至少 10 ml 的 1x PBS、0.2% 牛血清白蛋白（BSA）。确保溶液已充满薄层通道浓缩室，然后于 4 °C 过夜孵育。
    1. 弃去液体。用至少10 ml无菌试剂级水冲洗浓缩器一次，以去除多余的BSA，然后弃去水。
  2. 从每个测试样品中加入等量的二次水浓缩物 S将测定样品体积分别加入离心浓缩管中。
    1. 使用公式 1 计算 S，
      figure-protocol-1
      其中，D 为测定的原始水样体积，TSV 为总样本体积，FCSV 为最终浓缩样本体积。S 的计算示例见补充材料 S2。
  3. 将每个测试样品在4 °C条件下，于摆桶转子中以3,000–6,000 × g离心20–30分钟。检查细通道浓缩室中的体积。
    1. 如果体积大于 400 µl，再次离心 20 分钟或更长时间。持续离心，直至细管浓缩室中的样品体积减少至不足 400 µl。不要弃去上清液。
  4. 用1 ml无菌的0.15 M磷酸钠溶液（pH 7–7.5）冲洗离心浓缩管管壁，以提高病毒回收率。再次于3,000–6,000 × g、4 °C离心，直至样品体积减少至不足400 µl。重复此洗涤步骤一次。
  5. 使用 100–200 µl 微量移液器，小心量取并转移每份浓缩样品至 1.5 ml 微量离心管中（即转移200 µl至微量离心管中，然后通过调节移液器，将剩余浓缩液完全吸入移液器吸头，以测定剩余体积。加入0.15 M磷酸钠缓冲液（pH 7–7.5），调节终体积至400 ± 2 µl。
  6. 立即进行第3步以提取核酸。无法立即处理的浓缩样品可在4 °C下保存，但不得超过24小时。

3. 核酸提取

  1. 取200 µl 按步骤3.3所述配制的提取缓冲液，以及步骤2.5中各测试样品或步骤1.3中标准曲线稀释液的200 µl三级浓缩液，分别加入已标记的1.5 ml微量离心管中。将剩余的三级浓缩液于-70 °C或更低温度下冷冻保存。按照核酸提取试剂盒制造商提供的血液样本离心柱操作说明书提取各样品中的核酸，但需遵循以下例外条件。
  2. 不得向水样中添加蛋白酶，也不得使用核酸提取试剂盒提供的提取缓冲液。
  3. 配制含载体RNA的提取缓冲液
    1. 向含有310 µg载体RNA的小瓶中加入310 µl载体RNA稀释缓冲液。混匀至完全溶解，然后分装为约6份，每份约50 µl。于-20 °C保存。
    2. 每毫升提取缓冲液中加入28 µl解冻的载体RNA，使载体RNA终浓度为0.027 µg/µl。使用添加了载体RNA的提取缓冲液替代试剂盒中提供的提取缓冲液。
  4. 通过向试剂盒提供的洗脱缓冲液中加入核糖核酸酶（RNase）抑制剂，使其终浓度达到400单位/ml，配制洗脱缓冲液主溶液。
    1. 将50 µl含RNase抑制剂的洗脱缓冲液加入核酸结合离心柱中，以洗脱RNA。静置1分钟，然后在室温下以6,000 × g离心1分钟。
    2. 重复步骤3.4.1，随后移除并弃去离心柱。
  5. 对步骤3.4.2获得的RNA提取物进行分装。将标准曲线工作原液及各标准曲线稀释液分别分装为至少6份，每份不少于15 µl；其余所有RNA样品每份至少分装4份，每份不少于22 µl。若样品及标准曲线对照可在4小时内进行逆转录反应，则将每份样品和对照中的一份保存在4 °C；否则，所有分装样品均应于-70 °C或更低温度下保存。

4. 逆转录（RT）

  1. 根据 表1 中列出的每种寡核苷酸引物和探针，通过向每个小瓶中加入适量（微升）的PCR级水来配制100 µM的储存液，加水量（以微升计）等于小瓶中寡核苷酸的纳摩尔数（nmol）的10倍（如小瓶标签或制造商说明书所示，例如，将含有36.3 nmol的引物溶于363 µl水中）。混匀以溶解。
    1. 用PCR级水将100 µM溶液按1:10稀释，配制10 µM的工作溶液。
  2. 在洁净室中根据 表2 的指南配制RT主混合液1和2。使用多通道移液器将16.5 µl RT主混合液1加入每个PCR板孔中。
  3. 若已冷冻，请将来自每个现场样品和实验室加标样品基质（LFSM；即接种过的水基质样品）的核酸提取物解冻。
    1. 用含有400单位/ml RNase抑制剂的洗脱缓冲液将每个现场样品和LFSM样品分别按1:5和1:25稀释。
    2. 若已冷冻，请解冻但不要稀释实验室加标空白（LFB；即使用接种试剂级水的阳性质量控制样品）、实验室试剂空白（LRB；即使用试剂级水的阴性质量控制样品）、性能评估样品（PE；即在研究开始前用于评估实验室性能的接种试剂级水样品）、性能测试样品（PT；即滴度对分析人员未知、用于在研究过程中评估实验室性能的接种试剂级水样品）、NA批次阴性提取对照，或标准曲线组中已提取的RNA。
  4. 将每个测试样品、对照样品和标准曲线样品的6.7 µl RNA分别加入不同的PCR板孔中，测试样品和对照样品设三个复孔，标准曲线设两个复孔（参见 图S1 中RT板示例）。
    1. 将6.7 µl洗脱缓冲液分别加入用于无模板对照（NTC）的独立PCR板孔中。每块RT板应包含2–8个NTC，第一个样品处设置两个，之后每新增四个样品再增加两个。
    2. 将阴性提取对照和NTC对照均匀分布在整块板上。
  5. 使用耐热板封膜密封PCR板。将样品混匀5–10秒，然后在≥500 × g条件下短暂离心。
  6. 在热循环仪中于99 °C孵育4分钟，随后迅速冷却至4 °C。再次在≥500 × g条件下短暂离心。
  7. 小心移除板封膜，然后向每个孔中加入16.8 µl RT主混合液2。再次使用耐热板封膜密封PCR板，随后混匀并短暂离心（≥500 × g）。
  8. 将PCR板放入热循环仪中，先在25 °C运行15分钟，接着在42 °C运行60分钟，再在99 °C运行5分钟，最后保持在4 °C。
  9. 立即或在8小时内进行qPCR（第5步），或将样品储存于-70 °C或更低温度直至处理。可在8小时内处理的样品应储存于4 °C。

5. 实时定量 PCR（qPCR）

  1. 在运行任何检测样本之前，确定每批庚型肝炎试剂的平均庚型肝炎Cq值。
    1. 使用按NTC对照（步骤4.1.1）所述方法制备的10个重复样本进行RT实验。按照下述方法运行庚型肝炎qPCR实验（步骤5.2至5.5.3）。计算10个重复样本的平均Cq值。
    2. 调整RT主混合液1中的庚型肝炎试剂用量（表2如有需要，调整引物浓度以获得25至32个单位之间的平均Cq值。通过相应增减加入的水量，补偿引物体积的变化，使每份反应中RT Master Mix 1的终体积保持在16.5 µl。
    3. 通过重复步骤 5.1.1 至 5.1.2 确认任何调整，并进行更改 表2 以反映调整后的数量。 
  2. 在洁净室中，根据指南配制qPCR预混液 表3 肠道病毒 表4 和 表5 针对诺如病毒基因组I型， 表6 针对诺如病毒第二基因组， 表7 用于小鼠诺如病毒（诺如病毒V基因组群），以及 表8 用于庚型肝炎病毒检测。混合每种主混合液，然后在≥ 500 x g 条件下短暂离心。
  3. 将PCR预混液加入已标记的光学反应板的相应孔中，每孔14 µl，每个qPCR检测使用单独的反应板（参见 图 S2 基于RT布局的qPCR实验可能布局方案 图 S1).
  4. 将第4.8步的RT板在室温下解冻（如已冷冻）。使用板式混匀器混匀后，以≥ 500 × g短暂离心。
  5. 将6 µl相应的cDNA加入到光学反应板的相应孔中。混匀光学反应板中的样品，并在≥ 500 x g条件下短暂离心。
    1. 在进行所有其他qPCR检测之前，先对未稀释和已稀释的野外样本及LFSM样本进行庚型肝炎病毒qPCR检测。使用可产生可靠信号的最低稀释度的野外或LFSM样本 <1 个 Cq 值大于肠道病毒和诺如病毒 qPCR 检测中丙型肝炎病毒 G 型 Cq 值的平均值。
    2. 根据制造商的说明设置定量 PCR 热循环仪软件。将标准曲线样品标识为标准品，并针对每个标准曲线稀释度，输入下表所示的基因组拷贝数 表9.
    3. 在定量PCR仪中运行反应板，95 °C预变性10分钟，随后进行45个循环：95 °C变性15秒，60 °C退火延伸1分钟。
  6. 确定每条标准曲线是否符合给定的可接受值 表10参见补充材料部分S3中的示例。
    1. 使用公式 2 计算标准曲线的整体标准差（StdDev）
      figure-protocol-2
      其中 Cq 为每个标准曲线重复样的报告值， Cq 是每组重复样本的平均值，#Cq 是所有具有正值的标准对照重复样本的 Cq 值总数（即，而非未确定值），#Stds 为具有阳性值的标准品对照数量。
    2. 如果定量 PCR 热循环仪软件未计算每条标准曲线的斜率，请使用公式 3 计算斜率，  
      figure-protocol-3
      其中 Cq 是所用最高与最低稀释度的平均值，log GC 为所用最高与最低稀释度对应的基因组拷贝数的对数值 表9. 
    3. 计算 R2 使用公式4计算数值。
      figure-protocol-4
      其中 Cq 是所有Cq值的平均值 对数GC 每个重复样本的平均Log GC值。
    4. 使用公式 5 计算效率百分比：
      figure-protocol-5
  7. 根据符合规定标准曲线的热循环仪软件计算出的所有测试样本的GC值进行记录 表10 以及每个样本的平均GC值。重新运行任何标准曲线未达到以下标准的样本 表10 或任何阴性对照（LRB、NA批次阴性提取对照或NTC）出现阳性结果的情况。在重新运行过程中，对任何未达到标准或出现假阳性对照的样本进行重新处理。
  8. 确定每升中的GC数量（GCL 使用公式6计算每个测试样品：
    figure-protocol-6
    其中GC为步骤5.7中获得的平均基因组拷贝数，系数“199”为在三级浓缩、RNA提取和RT-qPCR步骤中因体积减少所致的总稀释倍数，DF为用于校正抑制效应的稀释倍数，D为被检测原始水样的体积（单位：升）。计算GC的示例详见补充材料部分S4。L.
  9. 将步骤5.5中获得的平均GC值乘以199，再除以0.3，计算LFB和LRB样品的总GC。

结果

通过配对的现场水样和LFSM地下水样测定总体病毒回收率。共分析了七组样品，其中三组来自公共处理厂（每个处理厂在不同时间采集了两组样品），另一组来自私人水井。LFSM样品的加标水平为3 × 106 MPN的萨宾3型脊髓灰质炎病毒和5 × 106 PFU的小鼠诺如病毒。由于缺乏足够浓度的人诺如病毒毒株用于LFSM样品，方法评价中采用小鼠诺如病毒作为替代病毒。对于地下水样品，脊髓灰质炎病毒的平均回收率为20%，标准误差为2%14，而小鼠诺如病毒的平均回收率为30%，标准误差为3%（图3）。每个LFSM对应的常规现场地下水样品中均未检出肠道病毒或诺如病毒。

使用接种和未接种的试剂级水对LFB和LRB样品进行检测。所有LRB样品均为阴性（数据未显示）。脊髓灰质炎病毒的回收率平均为44%，标准误差为1%（图3），而小鼠诺如病毒的回收率平均为4%，标准误差为0.5%。

实时定量 PCR 需要使用合适的标准曲线试剂。图4展示了肠道病毒和诺如病毒GII型的典型标准曲线。诺如病毒GII型的标准曲线符合标准曲线性能标准（表10），其R2值为0.9987，总体标准差为0.14，扩增效率为101%。诺如病毒GIA型和GIB型的标准曲线（未显示）与GII型几乎完全相同。肠道病毒的标准曲线也符合方法性能标准，R2值为0.9874，总体标准差为0.58，扩增效率为103%，但其灵敏度比诺如病毒标准曲线低约100倍，因此检测限更高。

figure-results-1
图1. 分子实验流程概览。 分子实验流程包括在检测感染性病毒基础上进一步的样品浓缩、核酸提取、两步法逆转录（RT）以及定量PCR（qPCR）。起始体积（S）代表了原始水样中按方法定义的比例部分。

figure-results-2
图2. RT-qPCR 检测流程示意图。 每个提取的测试样本RNA均通过三个重复反应（RT1、RT2 和 RT3）进行逆转录。随后，对每个重复逆转录反应所得的cDNA分别进行特异性病毒检测，包括肠道病毒（EV PCR）、诺如病毒基因群I（NoV GIA PCR 和 NoV GIB PCR）、诺如病毒基因群II（NoV GII PCR）以及庚型肝炎病毒（HGV PCR）检测。

figure-results-3
图3. 脊髓灰质炎病毒和小鼠诺如病毒从地下水和试剂级水中回收的平均值（%）。 图中显示了脊髓灰质炎病毒从地下水（figure-results-4；n = 7）和试剂级水（figure-results-5；n = 12）中的平均回收率，以及小鼠诺如病毒从地下水（figure-results-6；n = 7）和试剂级水（figure-results-7；n = 12）中的平均回收率（1），其中“n”表示处理的独立水样数量。误差线代表标准误。

figure-results-8
图4. 肠道病毒和诺如病毒GII型标准曲线。 图中显示了肠道病毒和诺如病毒GII型的典型标准曲线。每条曲线的斜率及R2值计算公式由热循环仪自动得出。

补充文件 1。请点击此处下载该文件。

病毒组引物/探针名称 (1)序列 (2)参考文献
肠道病毒
EntF (EV-L)CCTCCGGCCCCTGAATG20
EntR (EV-R)ACCGGATGGCCAATCCAA20
EntP (Ev-probe)6FAM-CGGAACCGACTACTTTGGGTGTCCGT-TAMRA21
诺如病毒 GIA
NorGIAF (JJV1F)GCCATGTTCCGITGGATG22
NorGIAR (JJV1R)TCCTTAGACGCCATCATCAT22
NorGIAP (JJV1P)6FAM-TGTGGACAGGAGATCGCAATCTC-TAMRA22
诺如病毒 GIB
NorGIBF (QNIF4)CGCTGGATGCGNTTCCAT23
NorGIBR (NV1LCR)CCTTAGACGCCATCATCATTTAC23
NorGIBP (NV1LCpr)6FAM-TGGACAGGAGAYCGCRATCT-TAMRA23
诺如病毒 GII
NorGIIF (QNIF2d)ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA25
NorGIIR (COG2R)TCGACGCCATCTTCATTCACA25
NorGIIP (QNIFS)6FAM-AGCACGTGGGAGGGCGATCG-TAMRA25
诺如病毒 GV
MuNoVF1AGATCAGCTTAAGCCCTATTCAGAAC14
MuNoVR1CAAGCTCTCACAAGCCTTCTTAAA14
MuNoVP1VIC-TGGCCAGGGCTTCTGT-MGB14
庚型肝炎病毒
HepF (5'-NCR 正向引物)CGGCCAAAAGGTGGTGGATG19
HepR (5'-NCR 反向引物)CGACGAGCCTGACGTCGGG19
HepP (庚型肝炎病毒 TaqMan 探针)6FAM-AGGTCCCTCTGGCGCTTGTGGCGAG-TAMRA1

表1. 通过RT-qPCR检测病毒所用的引物和TaqMan探针。
(1) 方法1615的引物和探针名称由病毒名称的前三个字母与F、R或P组合而成，分别代表正向引物、反向引物和探针。诺如病毒的基因群通过在名称后添加GI和GII来标明。两组诺如病毒GI引物还通过A和B加以区分。原始参考文献中的引物和探针名称列于括号内。
(2) 引物和探针序列的方向为5’至3’。以下为所使用的简并碱基符号：N——四种核苷酸的混合物；R——A + G；Y——T + C；W——A + T；I——次黄嘌呤核苷（inosine）。

成分每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl) (3)
RT 主混合液 1
随机引物 0.810 ng/μl (约 5.6 μM)84
丙型肝炎G型装甲RNA (4)1105
PCR级水 14.71543.5
总计16.51732.5
RT 主混合液 2
10x PCR Buffer II410 mM Tris, pH 8.3, 50 mM KCl420
25-mM MgCl24.83 mM504
10-mM dNTPs3.20.8 mM336
100-mM DTT410 mM420
RNase抑制剂0.50.5 单位/μl52.5
SuperScript II RT0.31.6 单位/μl31.5
总计16.81764

表2. RT主混合液1和2 (1).
(1) 在洁净室中配制反转录主混合液， 即一个不进行分子和微生物操作的房间。
(2) 最终的RT反应体系体积为40 µl。
(3) 所示体积基于105个检测反应，足以满足96孔PCR板的需求，并额外增加了一些检测反应以弥补损耗。可根据待分析样本和对照的数量按比例调整用量。
(4) 根据补充材料步骤S4所述，确定在RT主混合液1中加入的丙型肝炎G试剂的用量。

成分 每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl) (3)
2x LightCycler 480 Probes Master Mix10专有成分1050
ROX 参比染料 (4)0.40.5 mM42
PCR 级水1105
10 μM EntF0.6300 nM63
10 μM EntR1.8900 nM189
10 μM EntP0.2100 nM21
总计141470

表3. 肠道病毒（EV）检测的PCR主混合液(1)。
(1) 所有PCR主混合液均需在洁净室中配制。
(2) 定量PCR检测的最终反应体积为20 µl。
(3) 所示体积基于105个检测反应。此数量足以满足一个96孔PCR板的需求，并额外增加若干反应以弥补操作过程中的损耗。可根据待分析样本和对照的数量按比例放大或缩小试剂用量。
(4) 若所用仪器无需该试剂，则以PCR级水替代。

成分 每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl) (3)
2x LightCycler 480 Probes Master Mix10专有成分1050
ROX 参比染料 (4)0.40.5 mM42
PCR 级水1.4147
10 μM NorGIAF1500 nM105
10 μM NorGIAR1500 nM105
10 μM NorGIAP0.2100 nM21
总计141470

表4. 诺如病毒GIA（NoV GIA）检测的PCR预混液(1)。
脚注 (1)–(4) 参见表3。

成分每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl) (3)
2x LightCycler 480 Probes Master Mix10专有成分1050
ROX 参比染料 (4)0.40.5 mM42
PCR 级水0.331.5
10 μM NorGIBF1500 nM105
10 μM NorGIBR1.8900 nM189
10 μM NorGIBP0.5250 nM52.5
总计141470

表5. 诺如病毒GIB（NoV GIB）检测的PCR预混液(1)。
脚注 (1)–(4) 参见表3。

成分每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl) (3)
2x LightCycler 480 Probes Master Mix10专有成分1050
ROX 参比染料 (4)0.40.5 mM42
PCR 级水0.331.5
10 μM NorGIIF1500 nM105
10 μM NorGIIR1.8900 nM189
10 μM NorGIIP0.5250 nM52.5
总计141470

表6. 诺如病毒GII型（NoV GII）检测的PCR预混液(1)。
脚注 (1)–(4) 参见表3。

成分每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl) (3)
2x LightCycler 480 Probes Master Mix10专有成分1050
ROX 参比染料 (4)0.40.5 mM42
PCR 级水0.331.5
10 μM MuNoVF11500 nM105
10 μM MuNoVR11.8900 nM189
10 μM MuNoVP10.5250 nM52.5
总计141470

表7. 小鼠诺如病毒检测的PCR预混液(1)。
脚注 (1)–(4) 参见表3。

成分每反应体积 (μl) (2)终浓度每份主混合液体积 (μl)(3)
2x LightCycler 480 Probes Master Mix10专有成分1050
ROX 参比染料 (4)0.40.5 mM42
PCR 级水1.4147
10 μM HepF1500 nM105
10 μM HepR1500 nM105
10 μM HepP0.2100 nM21
总计141470

表8. 丙型肝炎G病毒（HGV）检测的PCR主混合液(1)。
脚注 (1)–(4) 见表3。

标准曲线浓度每次RT-qPCR检测的基因组拷贝数 (1, 2)
2.5 x 108502,500
2.5 x 10750,250
2.5 x 1065,025
2.5 x 105502.5
2.5 x 10450.25
2.5 x 1035.025

表9. 标准曲线基因组拷贝数。
(1) 将标准曲线孔确定为标准品，并将每次RT-qPCR检测的基因组拷贝数输入至热循环仪软件中的相应位置。
(2) 可接受的标准曲线应具有70%–110%的扩增效率，R2值>0.97，且诺如病毒的总体标准差<0.5，肠道病毒的总体标准差<1.0。

标准可接受值
诺如病毒肠道病毒
总体标准偏差<0.5<1.0
R2>0.97>0.97
扩增效率70% 至 115%70% 至 115%

表10. 标准曲线接受标准(1)。
(1) 扩增效率（% Efficiency）在70%–110%之间的标准曲线可被接受，但90%–115%范围内的值更为理想。低于90%的值可能提示移液或稀释操作存在误差。

质量控制组分平均回收率范围 (%)变异系数 (%)
实验室试剂空白；阴性PT或PE样品0N/A(1)
实验室加标空白；实验室加标样品基质5-200N/A
阳性PT和PE样品15-175≤130

表11. 方法1615性能标准。
(1) 不适用。

培养基成分
0.15 M 磷酸钠，pH 7.0–7.5通过将 40.2 g 磷酸氢二钠（Na2HPO4 · 7H2O）溶解于终体积为 1 L 的去离子水（dH2O）中，配制 0.15 M 磷酸钠溶液。用 HCl 调节 pH 至 7.0–7.5。在 121 °C、15 psi 条件下高压灭菌 15 分钟。磷酸钠溶液可在室温下保存最长 12 个月。
5% BSA将 5 g BSA 溶解于 100 ml 去离子水（dH2O）中配制。通过 0.2-μm 滤膜过滤除菌。
PBS，0.2% BSA将 4 ml 5% BSA 加入 96 ml PBS 中配制。通过 0.2-μm 滤膜过滤除菌。
TSM III 缓冲液将 1.21 g Trisma 碱、5.84 g NaCl、0.203 g MgCl2、1 ml Prionex 明胶和 3 ml Microcide III 溶解于 950 ml 试剂级水中。调节 pH 至 7.0，然后加水定容至 1 L。通过 0.2-μm 滤膜过滤除菌。
0.525% 次氯酸钠（NaClO）将家用漂白剂用去离子水（dH2O）1:10 稀释，配制 0.525% NaClO 溶液。0.525% NaClO 溶液可在室温下保存最长 1 周。
1-M 硫代硫酸钠（Na2S2O3）五水合物通过将 248.2 g Na2S2O3 溶解于 1 L 去离子水（dH2O）中配制 1 M 溶液。硫代硫酸钠溶液可在室温下保存最长 6 个月。

表12. 培养基一览表。

讨论

对水源水和饮用水中病毒污染进行大规模国家级研究时，需要使用多个分析实验室。在此类条件下，必须采用标准方法，以确保多个实验室所产生的数据具有可比性。目前已发表多种病毒检测的分子方法，但标准化的分子方法却极为有限。美国环保署方法1615（EPA Method 1615）是一种标准化方法，专门设计用于通过反转录定量PCR（RT-qPCR）检测水体基质中的肠道病毒和诺如病毒。目前已有针对食品中病毒检测的标准化分子方法（CEN/ISO TS 15216-1 和 CEN/ISO TS 15216-2；2013年4月7日）16,17，并已应用于泉水中甲型肝炎病毒和诺如病毒的检测16。所有标准方法必须包含质量性能控制措施和评价标准，以最大限度减少因实验室污染导致的实验室间与实验室内的变异以及假阳性数据。为进一步减少假数据，EPA Method 1615遵循美国环保署关于分子方法的指导原则18，规定在样品处理过程中应分区操作，并采用单向工作流程。该方法包含肝炎病毒G1,19作为内参对照，以及减少因RT-qPCR抑制物导致假阴性结果的程序15。该方法采用定量检测，并结合标准化的采样水量和分析水量，使所有现场数据均以每升现场水或饮用水中的基因组拷贝数表示。尽管高效的单管（一步法）RT-PCR检测试剂盒已有商业化产品，但该方法有意采用分离的检测步骤。这种方法的缺点是减少了每次反应中可检测的样品量，但提高了使用多种引物组合的灵活性。RT-qPCR检测的灵敏度和准确性受限于所使用的引物和探针，且很可能没有一种引物组合能够检测出某一病毒组内的所有变异株。选择肠道病毒引物组是因为其靶向保守的5’非编码区20,21，可检测多种肠道病毒血清型，且由该引物组检测出的病毒与饮用未经处理的地下水后产生的健康效应相关1。对于基因型I组诺如病毒的检测使用两对引物22,23。第一对引物的选择基于其检测到的病毒与幼儿健康效应之间存在强相关性1。第二对基因型I组引物以及用于基因型II组诺如病毒的引物组则因其可检测最广泛的病毒株系而被选用24,25。

尽管qPCR和RT-qPCR方法在检测水中病毒RNA方面具有显著优势，但仍存在若干局限性。首先，这些方法可扩增具有感染性和无感染性的病毒颗粒，包括被消毒剂灭活的病毒颗粒。Borchardt的研究结果表明，与经过消毒处理的地表水相比，这一问题在研究地区类似含水层的未处理地下水中影响较小1。对于可培养的病毒，可通过将PCR与病毒培养相结合的方法来克服此问题26,27。针对某些病毒，也可采用核酸交联剂来解决该问题28-30。后一种方法对次氯酸盐灭活的病毒较为有效，但对紫外线（UV）灭活的病毒无效。

这些分子检测方法的第二个局限性在于，可用于检测的浓缩样品体积通常远小于培养方法所使用的体积6,31。这一问题通常通过以下方式解决：使用基于聚乙二醇的浓缩步骤替代标准的有机絮凝二次浓缩方法，从而使样品可在更小体积中重悬；或增加一个三级样品浓缩步骤6,32,33。方法1615采用离心式超滤技术实现三级浓缩。离心式超滤可去除水及分子量小于30,000道尔顿的组分，从而既浓缩了待测样品中可能存在的病毒，又减少了对分子检测具有抑制作用的小分子物质。该三级浓缩步骤可使水中存在的任何病毒总体浓缩倍数达到>105倍。

第三个局限性是环境样品中存在抑制分子检测过程的物质。尽管已开发出多种去除抑制物的方法，但尚无一种方法对所有水质基质和病毒类型均有效6,34,35，因此必须使用内标来评估抑制程度。本方法中使用的庚型肝炎病毒试剂满足这一要求，可在所有反应中提供恒定量的病毒RNA，并通过反转录定量PCR（RT-qPCR）检测来评估抑制作用。当最优的去除抑制物方法仍无法完全消除抑制时，只要病毒浓度高于抑制物浓度，即可对样品浓缩液进行稀释处理14,15。

本文所述的标准曲线操作方法具有若干优点和一个主要局限性。其优点在于，所用试剂将所有必要组分整合于单一试剂中，从而可使用单一对照进行所有检测。该试剂对诺如病毒检测尤为重要，因为诺如病毒颗粒只能从感染者体内获取，难以获得用于标准品的病毒颗粒。更为重要的优点是，该试剂可为所有靶向的RNA病毒提供一种RNA标准品，而RNA标准品对于RNA的准确定量至关重要36。然而，该方法在病毒准确定量方面存在局限性，即未考虑基质效应的影响。这意味着基因组拷贝数的测定值不能视为绝对值，仅可作为相对值参考。建议制备足够数量的标准曲线工作液分装 aliquot（步骤1.2），以覆盖整个研究过程。例如，每份250 µl的分装液足以支持6块RT板的检测。若已知某项研究需分析500个样本，则至少需要12份分装液（500个样本 ÷ 每块RT板7个样本 ÷ 每份分装液支持6块RT板）。

EPA 方法 1615 是一种基于性能的方法。许多制造商生产的试剂与本文所述试剂等效，只要满足性能标准，这些试剂均可替代使用。标准曲线不仅作为阳性 RT-qPCR 对照，在排查性能问题时也具有重要价值。性能下降可能由 RNA 降解、试剂保质期、冰箱故障、仪器校准或技术误差引起。如果标准曲线与图 4所示不符，或未达到标准曲线的性能要求，则应怀疑存在性能问题。RT-qPCR 检测具有较强的稳健性；完全失败通常源于 RNA 操作不当或技术错误（例如，遗漏某种试剂）。在核酸提取至 RT 步骤之间的 RNA 样本操作过程中，应格外小心，以减少核糖核酸酶导致的 RNA 降解。

脊髓灰质炎病毒从地下水和试剂级水中以及小鼠诺如病毒从地下水中的回收率均达到了美国环保局方法1615的性能验收标准（表11），且结果与其他研究者的报告相似33,37,38。小鼠诺如病毒从LFB样品中的回收率远低于脊髓灰质炎病毒，未能达到针对脊髓灰质炎病毒设定的验收标准。目前尚不清楚小鼠诺如病毒在试剂级水中回收率较低的原因。与本研究结果类似，Karim及其同事报告了诺如病毒GI.1在自来水中的回收率为4%39。Lee 等37报告了使用滤膜过滤法从小鼠诺如病毒和人诺如病毒GII.4在蒸馏水中的平均回收率分别为18%和26%。Kim和Ko在与Lee等人相似的实验条件下，分别观察到这两种病毒的回收率为46%和43%38。Gibbons 等40在海水中获得了约100%的人诺如病毒GII.4回收率，但Kim和Ko38发现，当向蒸馏水中添加与海水相近或更高浓度的盐时，小鼠诺如病毒的回收率显著降低，同时GII.4的回收率也下降了约两倍。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者感谢 Eric Rhodes 博士为标准曲线试剂开发过程中所用克隆的制备工作，感谢 Brian McMinn 在样品处理方面的协助，感谢 Larry Wymer 提供统计分析支持，感谢美国农业部（威斯康星州马什菲尔德）的 Mark Borchardt 博士提供本研究中使用的萨宾脊髓灰质炎病毒 3 型，以及感谢华盛顿大学（密苏里州圣路易斯）的 H. W. Virgin 博士提供小鼠诺如病毒。作者还感谢 Gretchen Sullivan 在实验室储备试剂配制方面的协助，感谢 Mohammad Karim 博士进行小鼠诺如病毒储备液的扩增，以及感谢当地私人井主和公用事业机构允许我们采集水样。尽管本研究工作已通过美国环保局审查并获准发表，但其内容不一定反映该机构的官方政策。提及商业名称或产品并不构成对其使用之认可或推荐。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1.5 ml 离心管腔室Diversified BiotechCHAM-3000
1 °C 冷却砖Diversified BiotechBRIK-2501
10x PCR 缓冲液 II 和 25-mM MgCl2Life TechnologiesN8080130
-20 °C 冰箱VWR97043-346必须为手动除霜冰箱
-70 °C 或更低温度的冰箱Thermo ScientificMBF700LSAO-E
96 孔板腔室Diversified BiotechCHAM-1000
无水乙醇Fisher ScientificBP2818-100
Armored RNA EPA-1615Asuragen定制订购用于定量 RT-qPCR 检测
Armored RNA 丙型肝炎 G 病毒Asuragen42024
高压灭菌器SterisAmsco Lab Series
生物安全柜NuAir Laboratory Equipment SupplyLabgard 437 ES
牛血清白蛋白（BSA）Affymetrix10856结晶级或更高级别
Buffer AVEQiagen1026956载体 RNA 稀释缓冲液
Buffer AVLQiagen19073提取缓冲液
载体 RNAQiagen不适用使用随 Buffer AVL 提供的载体 RNA
离心瓶Fisher Scientific05-562-23 或 05-562-26
离心机转子Beckman Coulter339080, 336380
低温安全盒Diversified BiotechCSF-BOX
二硫苏糖醇（DTT）PromegaP1171
LightCycler® 480 Probes Master 试剂盒Roche Diagnostics4707494001
微量离心管Fisher Scientific02-682-550使用无 RNase 和 DNase 的带卡扣盖离心管
Microcide IIIFitzgerald99R-103
Microseal 'A' 膜Bio-Rad LaboratoriesHSA5001耐高温
Microseal 'F' 膜Bio-Rad LaboratoriesMSA1001耐低温
微型板旋转器Labnet InternationalMPS1000
多通道移液器RaininL8-20
多管腔室Diversified BiotechCHAM-5000
光学反应板Life Technologies4314320
PCR 核苷酸混合液PromegaU1515
PCR 板Bio-Rad LaboratoriesHSS9601
PCR 级水Roche3315932001
磷酸盐缓冲液（PBS）U.S. BiologicalD9820
板式混匀仪Scientific IndustriesMicroPlate Genie
Prionex 明胶Sigma AldrichG0411
QIAamp DNA Blood Mini 试剂盒Qiagen51104包含缓冲液 AW1（第一洗涤缓冲液）、AW2（第二洗涤缓冲液）和 AE（洗脱缓冲液）；使用前需向缓冲液 AW1 和 AW2 中加入乙醇；不要使用试剂盒中提供的 Buffer AL
定量 PCR 热循环仪Life Technologies4351405
随机引物PromegaC1181
试剂储液槽Fisher Scientific21-381-27E
冷冻离心机Beckman Coulter367501
RNase 抑制剂PromegaN2515 或 N2615
ROX 参比染料Life Technologies12223
SuperScript II 或 III 逆转录酶Life Technologies18064-022 或 18080044
外科手套Fisher Scientific19-058-800
热循环仪Life Technologies4314879
Trisma 碱基Sigma AldrichT1503
Vivaspin 20 离心浓缩装置Sartorius-StedimVS2022

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EPA 方法 1615. 通过培养法和反转录定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测水中肠道病毒和诺如病毒的存在情况。第三部分：通过 RT-qPCR 检测病毒
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