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方法文章

利用3'LIFE检测法高通量检测miRNA靶标

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⸱

DOI：

10.3791/52647

⸱

2015年5月25日

 ,  ,  , 
1School of Life Sciences, Arizona State University, 2Biodesign Institute, Arizona State University

本文内容

摘要

3'非翻译区功能元件的发光鉴定法（3'LIFE）是一种用于鉴定miRNA或其他调控因子在3'非翻译区（3'UTR）中功能调控作用的技术。本方案采用高通量方法，如96孔转染和荧光素酶检测，以筛选数百种潜在相互作用中的功能性抑制效应。

摘要

3’非翻译区发光功能元件鉴定法（3’LIFE）可快速鉴定在数百个待测3’非翻译区（3’UTR）中特定miRNA的作用靶点。该方法基于双荧光素酶报告基因检测系统，通过检测mRNA水平上的结合情况来衡量翻译输出，从而对miRNA靶向作用提供功能性读数。3’LIFE采用非专有缓冲液和试剂，以及公开可用的报告基因文库，使全基因组范围的筛选具有可行性且成本较低。3’LIFE既可在常规实验室条件下进行，也可利用液体处理机器人及其他高通量设备实现规模化操作。我们以克隆于96孔板中的人类3’UTR数据集以及两个测试用miRNA（let-7c 和 miR-10b）为例，说明如何执行DNA制备、转染、细胞培养及96孔板格式的荧光素酶检测，并提供数据分析工具。总之，3’LIFE具有高度可重复性、快速、系统性强，并能识别高置信度的靶标。

引言

本方法的总体目标是高通量地检测并精确定位微小RNA（miRNA）的靶标。miRNA是一类内源性非编码RNA，长度约为22个核苷酸。在转录和加工后，成熟的miRNA会整合到一种称为RNA诱导沉默复合物（RISC）的蛋白质复合体中。每种miRNA可引导RISC结合至信使RNA（mRNA）主要位于3'非翻译区（3'UTR）的靶序列，从而导致翻译抑制或mRNA切割1。miRNA通过标准的沃森-克里克碱基配对以及G:U摆动配对识别靶位点，其配对具有简并性，常包含多个错配碱基对和凸起区域。许多miRNA在从植物到人类的物种中高度保守2,3，并在多种生物学过程中发挥重要作用。在后生动物中，miRNA可影响多种生物学过程，包括细胞命运决定4、发育时序调控5，并常表现出组织特异性表达模式6,7。miRNA的异常表达可能导致基因调控紊乱，仅基于靶基因的功能即可对细胞行为产生显著影响。因此，miRNA与多种疾病相关，包括神经退行性疾病8,9、糖尿病10和癌症11。生物信息学和湿实验方法均表明，每个miRNA可能能够靶向数百至数千个不同的mRNA12-14，这表明需要采用高通量或全基因组范围的方法来研究这一庞大的潜在相互作用网络。

确定靶基因是机制性定义miRNA功能的关键环节，为此研究人员必须能够在大规模上揭示靶基因。目前已开发出多种方法用于鉴定miRNA靶点，包括生物信息学预测算法、靶向mRNA的高通量测序以及基于报告基因的检测方法。这些方法各有其固有的优势与局限性。由于miRNA的靶向作用依赖于序列特异性，尤其是miRNA第2至第6位核苷酸（称为“种子区”），因此已开发出多种算法用于预测多种生物基因组中的miRNA靶点。这些算法通过已验证的miRNA靶点中观察到的碱基配对模式进行训练，通常采用严格种子区配对、位点保守性及/或热力学稳定性等参数15。尽管这些筛选条件可将具有足够互补性的大量假定靶点缩小至高置信度靶点，但可能排除物种特异性和非经典miRNA靶位点，而近期证据表明这些位点广泛存在16-24。此外，这些预测未考虑可排除miRNA靶位点的mRNA加工机制，例如可变多聚腺苷酸化25、RNA编辑26、RNA甲基化27以及协同结合效应。因此，许多算法已被报道存在较高的假阳性率和假阴性率22,24,28。尽管这些算法有助于识别候选miRNA靶点以供后续实验验证，但其较高的错误率限制了生物信息学方法在系统性miRNA靶点检测中的有效性。

为了系统性地探究特定miRNA与潜在靶向3’非翻译区（3’UTR）之间的相互作用，我们开发了一种高通量检测方法，称为“3’UTR功能元件的发光鉴定法”（Luminescent Identification of Functional Elements in 3’UTRs, 3’LIFE）24。该方法利用双荧光素酶报告系统，检测查询miRNA对测试3’UTR的直接相互作用及其翻译抑制效应。在此系统中，将目的基因的3’UTR克隆至萤火虫荧光素酶（fluc）报告基因阅读框的下游。将报告质粒与待检测的miRNA共转染入HEK293T细胞中。通过测量测试fluc::3’UTR报告基因与第二个非特异性Renilla荧光素酶报告基因之间的相对变化，判断miRNA的靶向作用。重要的是，荧光素酶检测能够识别影响报告基因翻译输出的功能性miRNA/mRNA相互作用。相较于传统的miRNA调控检测方法（如RT-qPCR和Western印迹），该方法具有关键优势：它可绕过mRNA降解与翻译抑制之间的差异，以及独立于3’UTR调控的蛋白质丰度变化。

由于荧光素酶检测具有相对简单和灵敏度高的优点，因此被广泛用于验证miRNA的直接靶点。然而，由于耗材试剂成本较高、缺乏公共来源的3’非翻译区（3’UTR）文库，以及缺少标准化的荧光素酶实验方案，导致在多个数据集之间比较功能抑制效果存在困难，限制了其在高通量筛选中的应用。为了促进3’LIFE检测的应用，我们着重简化实验设计，采用非商业化的转染24和荧光素酶试剂29，并构建了一个定期更新和扩展的3’UTR文库，该文库可通过公共质粒库获取30。

3’LIFE 检测方法的可扩展性使其能够在无偏向性筛选给定 miRNA 靶向的大规模 3’非翻译区（3’UTR）文库时，无需依赖生物信息学预测的基因。除了验证经典的和预测的相互作用外，这种系统性方法还能识别由非经典和/或物种特异性相互作用介导的新靶标。重要的是，miRNA 靶向对蛋白质生成的影响通常被认为主要导致轻度的翻译抑制15,31，这表明 miRNA 调控的主要功能在于精细调节蛋白质表达水平、防止基因表达异常，并增强细胞特异性程序的稳定性32,33。荧光素酶检测的高灵敏度，结合 3’LIFE 筛选中固有的大量阴性 miRNA/mRNA 相互作用，使得能够检测 miRNA 靶向对大量基因产生的微弱效应，并识别出受特定 miRNA 调控的基因网络中的多个组分24。

本文介绍了3'LIFE实验方案，并通过筛选两个已有明确特征的miRNA——miR-10b和let-7c，针对包含275个人类3'非翻译区（3'UTR）的文库进行验证，证明了该方法的可行性（图1）。

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方案

1. 细胞培养（24–48 小时） 转染前

  1. 转染前24-48小时，根据拟转染的96孔板数量，接种足量的HEK293T细胞。
    注意：为确保转染效果一致，接种细胞时密度应适宜，以促进细胞快速分裂，但在转染时细胞融合度不应超过70-90%。
  2. 每块96孔板需要9 × 106个细胞（每孔75,000个细胞，每板共120孔，以满足储液槽和多通道移液器的使用需求）。根据HEK293细胞的倍增时间（通常约为20小时），计算并接种适量细胞，确保转染时至少获得9 × 106个细胞。当培养至约90%融合度时，一个145 mm的圆形培养皿通常足以支持3块96孔板的转染实验，并剩余约10%的细胞用于传代接种新培养皿。

2. 转染前的准备工作

注意：由于这些试剂的制备可能耗时较长，步骤 2.0-2.2 中缓冲液和质粒 DNA 的准备应于转染前数天完成。

  1. 与3'LIFE检测兼容的人类3'非翻译区（3'UTR）克隆可通过公共质粒库获取30。可手动或使用液体处理机器人纯化质粒DNA。采用转染级碱裂解法质粒小量提取96孔试剂盒，并按照制造商说明书操作。将纯化的载体重悬至每孔约100 ng/μl。
    注意：若质粒浓度低于40 ng/μl，将导致荧光素酶信号不足。
  2. 获取pLIFE-miRNA载体30，或按照图1B所示流程进行克隆24。将每种miRNA及空白对照质粒的载体重悬至500 ng/μl的浓度。
  3. 由于核转染缓冲液条件较为敏感，需确保转染物总体积（包括细胞和质粒）不超过96孔转染板每孔总液体体积的10%。为此，应将pLIFE-miRNA质粒储备液浓缩至至少500 ng/μl的浓度。
  4. 配制10倍浓度的萤火虫荧光素酶缓冲液试剂（表1）以及1倍浓度的海肾荧光素酶缓冲液试剂（表2），上述试剂可保存长达6个月。
    注意：萤火虫荧光素酶缓冲液中的DTT必须分装成单次使用小份，溶于溶液后于-20 oC保存。

3. 转染前立即准备以下物品

  1. 配制含有 PBS 和 1.5% HEPES（pH 7.0）的转染缓冲液。建议新鲜配制，但该缓冲液在 4 °C 下保存最多 1 个月也不会明显降低转染效率。在计算缓冲液和质粒 DNA 体积时，按每块 96 孔板 120 个反应量进行准备，以充分补偿移液过程中的误差以及使用液体储液槽和多通道移液器时的体积损耗。每孔分装 18 μl 转染缓冲液（120 孔/96 孔板 = 每板 2.16 ml），置于一旁备用。
    注意：细胞电穿孔设备对用于转染细胞的缓冲液条件极为敏感。准确配制缓冲液可确保设备性能的一致性。进行实验时必须格外小心，防止缓冲液蒸发，特别是应尽量减少缓冲液在微量离心管、96 孔板、储液槽和电极板中暴露于空气中的时间。
  2. 预留四个孔用于以下对照：无 pLIFE-3’UTR（用于测定荧光素酶检测的背景值）、pLIFE-SV40 3’UTR（阴性靶标对照）、miRNA #1 的阳性对照、miRNA #2 的阳性对照。
    注意：这些载体为公开可用资源30。此外，任何先前已验证的靶标均可作为阳性对照使用。
  3. 将培养基和胰蛋白酶（0.25%）预热至 37 °C。
  4. 向 96 孔细胞培养板的每孔中加入 200 μl DMEM，该培养基需添加 10% 胎牛血清（FBS）和 1% 青霉素-链霉素（Pen/Strep），随后将培养板置于 37 °C 培养箱中，待转染后使用。
  5. 开启所有细胞电穿孔设备及其配套软件。针对 HEK293T 细胞及 PBS/HEPES 缓冲液，使用脉冲程序代码 FF120。

4. 质粒DNA与细胞混合物的制备

注意：以下实验方案假设在一次实验中转染三块 96 孔板，用于包含两种 miRNA（miRNA-#1 和 miRNA-#2）的筛选。每块板将对应相同的 96 孔板 pLIFE-3’UTR 质粒，并分别用 pLIFE-miRNA-空白、pLIFE-miRNA-#1 或 pLIFE-miRNA-#2 处理三次。

  1. 为每种miRNA配制3份pLIFE-miRNA与转染缓冲液的混合物。每份混合物的体积应占每孔总体积的50%（10 μl），乘以120孔。因此，每份混合物应包含1.08 ml缓冲液 + 120 μl质粒DNA（pLIFE-miRNA）。
  2. 从145 mm培养皿中收集细胞：吸除培养基，用PBS轻轻洗涤，然后在37 °C下加入约5 ml 0.25%胰蛋白酶消化5分钟。加入等体积的培养基中和胰蛋白酶，于300 x g离心5分钟收集细胞。
  3. 去除胰蛋白酶/培养基，将细胞沉淀重悬于约5–10 ml培养基中（根据细胞密度和细胞计数仪的准确检测范围调整体积）。
  4. 使用细胞计数仪进行细胞计数。确保细胞活力>95%，且细胞浓度处于仪器的准确检测范围内。
    注意：细胞浓度过高（>6.0x 106/ml）可能导致计数不准确。细胞数量过多会因降低质粒与细胞的比例和/或降低转染效率，从而显著影响miRNA的靶向效率。
  5. 将细胞分装为三管，每管含9 x 106个细胞，对应一张96孔板转染所需的细胞量。于300 x g离心3分钟。
  6. 去除上清液。尽可能彻底去除培养基，同时尽量减少对细胞沉淀的扰动，因为残留过多培养基会影响转染效率。
  7. 将细胞沉淀重悬于1.2 ml转染缓冲液与miRNA质粒的混合液中，置于一旁备用。
  8. 以下步骤详述将pLIFE-3’UTR质粒重悬于转染缓冲液中的操作。由于该步骤在96孔板中进行，需始终覆盖板子以避免缓冲液蒸发。
    1. 使用多通道移液器，向96孔PCR板的每孔加入32.4 μl转染缓冲液（9 μl [每转染] × 3 [板数] × 1.2 [用于补偿移液误差]）。
    2. 向每孔加入3.6 μl（约100 ng/μl）的质粒小提产物pLIFE-3’UTR，并充分混匀。
    3. 将10 μl该混合液加入96孔转染板的每孔中，并盖上盖子。

5. 转染

  1. 将1.2 ml的第一份细胞/缓冲液/pLIFE-miRNA质粒混合物转移至电转杯中，充分混匀。
  2. 取10 μl该混合物加入已含有10 μl转染缓冲液/pLIFE-3’UTR的96孔转染板第一孔中，通过反复吹打数次充分混匀。
    注意：细胞在缓冲液中均匀悬浮可确保电流在电转杯中均匀、充分通过，从而提高转染效率。
  3. 将96孔转染板置于细胞电穿孔装置上，启动转染程序。
  4. 转染完成后，向96孔转染板的每孔中加入100 μl来自96孔培养板的预温培养基，充分混匀，再从每孔中转移100 μl至96孔培养板中。
  5. 用移液器在培养板各孔中央垂直吹打混匀细胞，因为若混匀不充分，细胞易在孔壁边缘聚集。
  6. 对剩余的两个培养板重复步骤5.1–5.5。
  7. 96孔转染板的清洗
    1. 可通过70%乙醇清洗96孔转染板以实现重复使用，防止不同实验间核酸残留。使用喷瓶对每孔进行两次70%乙醇清洗，确保完全充满各孔，随后擦干电极条（底面）上多余的乙醇，并将转染板置于生物安全柜中彻底晾干。
      注意：我们通过以下实验检测了DNA残留污染：在12个孔中分别使用2 μg pmaxGFP质粒转染HEK293T细胞，随后仅用70%乙醇清洗一次，再进行无质粒DNA的第二次转染。即使在质粒浓度极高、报告基因荧光极强、且仅进行一次清洗的极端条件下，12个重复孔中均未观察到荧光信号。
  8. 在37 °C下培养细胞48–72小时，随后进行双荧光素酶检测。

6. 荧光素酶检测用细胞裂解物的制备

  1. 在储液槽中将裂解缓冲液按4份水加1份5×被动裂解缓冲液的比例稀释。按每孔26 μl计算，并额外增加约20个体积以补偿储液槽中的损耗。
    注意：缓冲液储存于-20 ºC，可能极为黏稠，因此在使用前应使5×缓冲液升至室温，以提高移液准确性。
  2. 使用荧光显微镜分析每孔的转染效率。记录转染效率低（>90%）的孔中出现的不一致情况，或红色荧光蛋白（RFP）表达水平较低的孔，后者提示细胞过度生长或培养基耗尽。将这些孔从分析中剔除。
  3. 完全移除细胞中的培养基，操作时需小心，避免移除过快导致细胞脱落。
    注意：残留的培养基会稀释裂解液，导致不同实验间数据波动。
  4. 向每孔加入26 μl裂解缓冲液，置于平板摇床/振荡器上以低至中等速度振荡约20–30分钟。利用此时间准备荧光素酶缓冲液，清洗并预热发光仪，并将裂解液转移至不透光的检测板中。

7. 双荧光素酶报告基因检测

注意：如果在一台光度计上连续测量多个孔板，请配制除ATP和底物以外的所有成分的缓冲液主混合液，并在每次使用每个孔板前立即加入这些试剂，然后调节pH值。ATP和底物可能随时间降解；保持这些试剂在缓冲液中停留时间的一致性，有助于提高多个孔板之间结果的一致性。

  1. 配制1×荧光素酶缓冲液（表1）：
    1. 用铝箔包裹两个试管（通常为15/50 ml离心管），分别装有萤火虫荧光素酶和Renilla缓冲液，因为底物可能对光敏感。
    2. 配制1×萤火虫荧光素酶缓冲液。将五种10×萤火虫荧光素酶试剂各取1 ml（最后加入EGTA），加入5 ml H2O中，终浓度为1×。
      1. 向10 ml 1×萤火虫缓冲液中加入0.025 g ATP。通过反复倒置混匀。ATP需始终置于冰上。ATP易降解，因此若需连续检测多个酶标板，则每块新板都必须从该步骤开始重新配制缓冲液。
      2. 向缓冲液中加入100 μl 100倍浓度的甲虫荧光素（底物）（表1）。缓冲液颜色应随pH变化呈淡黄色。
    3. 1× Renilla荧光素酶缓冲液的重悬：每块96孔板，分装10 ml的1דRenilla缓冲液”。
      1. 加入100 μl BSA（44 mg/ml储存液）。
      2. 若需检测多块酶标板，将主混合液分装为每份10 ml  的等份。
      3. 向缓冲液中加入100 μl腔肠素（预先分装并以100倍浓度储存）。
    4. 使用NaOH和HCl将1×萤火虫缓冲液的pH调节至8.0，随后将1×Renilla缓冲液的pH调节至5.0。
      注意：每种缓冲液的活性以及Renilla缓冲液淬灭萤火虫荧光素酶活性的能力高度依赖于pH。为获得一致结果，此步骤中pH调节必须极为精确。
    5. 将每种缓冲液的体积补至10.5 ml（对应一块96孔板），以满足发光仪的灌注需求。
  2. 将裂解液转移至不透明白色酶标板：此时细胞应在裂解缓冲液中裂解约20分钟。使用多通道移液器从每个孔中吸取25 μl裂解液，务必充分吹打混匀，以打散细胞团块并均质化裂解液。
  3. 准备发光仪。打开发光仪，选择DLR文件夹中的“DLR with two injections”程序。其他格式与后续数据分析流程（见下文）不兼容。
    1. 选择待检测的孔（默认为全部孔）。
    2. 将“测量前延迟时间”设置延长至5秒，测量时间为10秒（解释见29）。
    3. 毛细管清洗步骤：水洗3次，乙醇洗3次，水洗3次，干燥3次。先将缓冲液各灌注一次至废液管，再第二次反向灌注回缓冲液管中，以确保充分混合。首先注入萤火虫缓冲液，并将其灌注至左侧毛细管，随后将Renilla缓冲液灌注至右侧毛细管。
  4. 启动荧光素酶检测。每块酶标板读数时间约为48分钟。完成后请先保存文件，然后重复清洗步骤并关闭发光仪。
    注意：可连续读取多块酶标板并将数据存储在同一Excel文件中，但多次读板时可能出现发光仪程序崩溃的情况。务必在每次测量之间保存所有数据，并在程序崩溃且无法保存前截取屏幕图像。
    1. 更换旧缓冲液为新缓冲液，开始新板检测前确保使用新缓冲液至少灌注两次。

8. 数据分析

  1. 使用来自 www.mangonelab.com 的 Excel 表格“3’LIFE - single plate analysis”和“3’LIFE – multiplate analysis”。将荧光素酶检测仪输出文件中的萤光素酶和Renilla荧光素酶原始数据复制到“3’LIFE – single plate analysis”工作表中对应的阴性对照、miRNA #1 和 miRNA #2 的位置。
  2. 该工作表将自动计算萤光素酶/Renilla 荧光素酶比值，并将每个 miRNA 相对于相应的阴性对照进行归一化，同时对每块板的数据进行板间归一化。
    注意：该工作表将自动识别荧光信号较低的孔，高亮显示显著抑制的孔，并提供整块板的抑制程度测量值。有关统计分析的详细说明，请参见24。
    1. 将“归一化 RI 指数”框中的数值复制到“3’LIFE – multiplate analysis”工作表中对应每个测试 miRNA 的第1次重复的位置。对不同日期进行的所有生物学重复实验重复此步骤。
  3. 如有需要，可在 B 列和 D 列分别插入基因名称和靶点预测状态。
    1. 让工作表自动计算所有板的平均值。以热图形式查看 96 孔板格式的数据（图 2）。该文件还将数据以列表形式排列（图 2）。
      注意：抑制指数是用于识别潜在 miRNA 靶标的指标。可根据个人偏好使用不同的严格性参数。通常我们认为抑制指数低于 0.8 的为可能的阳性结果，并通过 t 检验达到统计学显著性（p 值 <0.05）。如 图 3 所示，符合这些标准的潜在靶标将以红色高亮显示。

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结果

光度计输出文件包含萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶蛋白的原始测量数据。该原始格式可与Mangone实验室网站（www.mangonelab.com）提供的“3'LIFE – 单板分析”和“3'LIFE – 多板分析”电子表格兼容。单板分析电子表格可自动计算萤火虫/Renilla荧光素酶比值，将每个miRNA相对于相应的阴性对照进行归一化，并对整块板的抑制值进行归一化处理。该电子表格可自动识别Renilla荧光素酶信号较低的孔，高亮显示相对于阴性对照出现抑制效应的孔，并提供整块板的抑制程度评估指标（图2）。有关统计分析的详细说明，请参见24。

可以使用“多孔板分析”电子表格分析多个重复样本。每个重复样本将并排进行比较，数据的统计指标将自动计算（图3）。除了通过“归一化抑制”列比较重复样本外，用户还可以在“miRNA#1/miRNA#2”列下比较两种miRNA...

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讨论

3’LIFE检测可高通量地鉴定3’UTR中具有功能的miRNA靶点。该检测适用于希望实验性鉴定其目标miRNA大量潜在靶基因的研究人员。3’LIFE检测是一种强大的方法，可用于探究由3’UTR介导的调控作用，因为该检测能够提供miRNA靶向功能的实验证据，且通过单一报告基因::3’UTR与单一miRNA的二元检测，即可可靠地判断特定基因的靶向状态。为验证该方法的有效性，我们对一组包含275个3’UTR的文库，针对两种miRNA进行了筛选。 let-7c 和 miR-10b，并在该文库中包含了10个先前已验证的靶基因。这十个基因中有八个表现出抑制效应 24我们还观察到，在我们的高分结果中，存在大量未经验证的、通过生物信息学预测的靶点，以及含有经典种子元件但未被预测到的3’UTR，这表明3’LIFE能够识别这些靶点 真正有效的 miRNA 靶点

高通量筛选灵敏度的一个关键指标是假阳性率和假阴性率。尽管本实验的假阳性率需要通过其他替代方法进一步验证以确认阳性结果，但在我们原理验证实验中包含的十个阳性对照中有八个表...

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披露

本工作由亚利桑那州立大学文理学院和生物设计研究所的资金以及美国国立卫生研究院探索性/发展性研究基金 1R21CA179144-01A1 资助。

致谢

感谢 Stephen Blazie、Karen Anderson 和 Josh LaBaer 提供的建议和讨论。感谢 Karen Anderson、John Chaput 和 Josh LaBaer 分享试剂和仪器设备，感谢 Michael Gaskin 和 Andrea Throop 提供的技术指导和实验方案。Justin Wolter 是 Maher 学者，感谢 Maher 家族提供的慷慨支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
试剂
glycylglycineSigmaG1127-25G
Kx PO4SigmaP2222
EGTASigmaE3889
ATPSigmaFLAAS
DTTSigmaD0632
MgSO4SigmaM7506
CoASigmaC4282
luciferinSigmaL9504
NaClSigmaS7653
Na2EDTASigmaE0399
K H2 P O4Sigma1551139
BSASigmaA2153
NaN3SigmaS2002
CoelenterazineSigmaC3230
PBS/HEPESCorning21-040-CV
DMEMSigmaD5546
FBSSigmaF2442
Pennicilin/StreptomicinSigmaP4333
TrypsinT2600000
耗材
MaxiPrep KitPromegaA2392
96孔微量制备板Pall8032
96孔穿梭板LonzaV4SP-2096
5x Lysis BufferPromegaE1941 
仪器
96孔GloMax酶标仪PromegaE9032
Biomech FX液体处理机器人BeckmannA31842
4D-Nucleofector核心单元LonzaAAF-1001
96孔Shuttle系统LonzaAAM-1001
Countess细胞计数仪InvitrogenC10227

参考文献

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