利用3'LIFE检测法高通量检测miRNA靶标

摘要

3'非翻译区功能元件的发光鉴定法（3'LIFE）是一种用于鉴定miRNA或其他调控因子在3'非翻译区（3'UTR）中功能调控作用的技术。本方案采用高通量方法，如96孔转染和荧光素酶检测，以筛选数百种潜在相互作用中的功能性抑制效应。

摘要

3’非翻译区发光功能元件鉴定法（3’LIFE）可快速鉴定在数百个待测3’非翻译区（3’UTR）中特定miRNA的作用靶点。该方法基于双荧光素酶报告基因检测系统，通过检测mRNA水平上的结合情况来衡量翻译输出，从而对miRNA靶向作用提供功能性读数。3’LIFE采用非专有缓冲液和试剂，以及公开可用的报告基因文库，使全基因组范围的筛选具有可行性且成本较低。3’LIFE既可在常规实验室条件下进行，也可利用液体处理机器人及其他高通量设备实现规模化操作。我们以克隆于96孔板中的人类3’UTR数据集以及两个测试用miRNA（let-7c 和 miR-10b）为例，说明如何执行DNA制备、转染、细胞培养及96孔板格式的荧光素酶检测，并提供数据分析工具。总之，3’LIFE具有高度可重复性、快速、系统性强，并能识别高置信度的靶标。

引言

本方法的总体目标是高通量地检测并精确定位微小RNA（miRNA）的靶标。miRNA是一类内源性非编码RNA，长度约为22个核苷酸。在转录和加工后，成熟的miRNA会整合到一种称为RNA诱导沉默复合物（RISC）的蛋白质复合体中。每种miRNA可引导RISC结合至信使RNA（mRNA）主要位于3'非翻译区（3'UTR）的靶序列，从而导致翻译抑制或mRNA切割¹。miRNA通过标准的沃森-克里克碱基配对以及G:U摆动配对识别靶位点，其配对具有简并性，常包含多个错配碱基对和凸起区域。许多miRNA在从植物到人类的物种中高度保守^2,3，并在多种生物学过程中发挥重要作用。在后生动物中，miRNA可影响多种生物学过程，包括细胞命运决定⁴、发育时序调控⁵，并常表现出组织特异性表达模式^6,7。miRNA的异常表达可能导致基因调控紊乱，仅基于靶基因的功能即可对细胞行为产生显著影响。因此，miRNA与多种疾病相关，包括神经退行性疾病^8,9、糖尿病¹⁰和癌症¹¹。生物信息学和湿实验方法均表明，每个miRNA可能能够靶向数百至数千个不同的mRNA^12-14，这表明需要采用高通量或全基因组范围的方法来研究这一庞大的潜在相互作用网络。

确定靶基因是机制性定义miRNA功能的关键环节，为此研究人员必须能够在大规....

方案

1. 细胞培养（24–48 小时） 转染前

1. 转染前24-48小时，根据拟转染的96孔板数量，接种足量的HEK293T细胞。
   注意：为确保转染效果一致，接种细胞时密度应适宜，以促进细胞快速分裂，但在转染时细胞融合度不应超过70-90%。
2. 每块96孔板需要9 × 10⁶个细胞（每孔75,000个细胞，每板共120孔，以满足储液槽和多通道移液器的使用需求）。根据HEK293细胞的倍增时间（通常约为20小时），计算并接种适量细胞，确保转染时至少获得9 × 10⁶个细胞。当培养至约90%融合度时，一个145 mm的圆形培养皿通常足以支持3块96孔板的转染实验，并剩余约10%的细胞用于传代接种新培养皿。

2. 转染前的准备工作

注意：由于这些试剂的制备可能耗时较长，步骤 2.0-2.2 中缓冲液和质粒 DNA 的准备应于转染前数天完成。

1. 与3'LIFE检测兼容的人类3'非翻译区（3'UTR）克隆可通过公共质粒库获取³⁰。可手动或使用液体处理机器人纯化质粒DNA。采用转染级碱裂解法质粒小量提取96孔试剂盒，并按照制造商说明书操作。将纯化的载体重悬至每孔约100 ng/μl。
   注意：若质粒浓度低于40 ng/μl，将导致荧光素酶信号不足。
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结果

光度计输出文件包含萤火虫荧光素酶和Renilla荧光素酶蛋白的原始测量数据。该原始格式可与Mangone实验室网站（www.mangonelab.com）提供的“3'LIFE – 单板分析”和“3'LIFE – 多板分析”电子表格兼容。单板分析电子表格可自动计算萤火虫/Renilla荧光素酶比值，将每个miRNA相对于相应的阴性对照进行归一化，并对整块板的抑制值进行归一化处理。该电子表格可自动识别Renilla荧光素酶信号较低的孔，高亮显示相对于阴性对照出现抑制效应的孔，并提供整块板的抑制程度评估指标（图2）。有关统计分析的详细说明，请参见²⁴。

可以使用“多孔板分析”电子表格分析多个重复样本。每个重复样本将并排进行比较，数据的统计指标将自动计算（图3）。除了通过“归一化抑制”列比较重复样本外，用户还可以在“miRNA#1/miRNA#2”列下比较两种miRNA.......

讨论

3’LIFE检测可高通量地鉴定3’UTR中具有功能的miRNA靶点。该检测适用于希望实验性鉴定其目标miRNA大量潜在靶基因的研究人员。3’LIFE检测是一种强大的方法，可用于探究由3’UTR介导的调控作用，因为该检测能够提供miRNA靶向功能的实验证据，且通过单一报告基因::3’UTR与单一miRNA的二元检测，即可可靠地判断特定基因的靶向状态。为验证该方法的有效性，我们对一组包含275个3’UTR的文库，针对两种miRNA进行了筛选。 let-7c 和 miR-10b，并在该文库中包含了10个先前已验证的靶基因。这十个基因中有八个表现出抑制效应 ²⁴我们还观察到，在我们的高分结果中，存在大量未经验证的、通过生物信息学预测的靶点，以及含有经典种子元件但未被预测到的3’UTR，这表明3’LIFE能够识别这些靶点 真正有效的 miRNA 靶点

高通量筛选灵敏度的一个关键指标是假阳性率和假阴性率。尽管本实验的假阳性率需要通过其他替代方法进一步验证以确认阳性结果，但在我们原理验证实验中包含的十个阳性对照中有八个表.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
glycylglycine	Sigma	G1127-25G
Kx PO4	Sigma	P2222
EGTA	Sigma	E3889
ATP	Sigma	FLAAS
DTT	Sigma	D0632
MgSO4	Sigma	M7506
CoA	Sigma	C4282
luciferin	Sigma	L9504
NaCl	Sigma	S7653
Na2EDTA	Sigma	E0399
K H2 P O4	Sigma	1551139
BSA	Sigma	A2153
NaN3	Sigma	S2002
Coelenterazine	Sigma	C3230
PBS/HEPES	Corning	21-040-CV
DMEM	Sigma	D5546
FBS	Sigma	F2442
Pennicilin/Streptomicin	Sigma	P4333
Trypsin		T2600000
耗材
MaxiPrep Kit	Promega	A2392
96孔微量制备板	Pall	8032
96孔穿梭板	Lonza	V4SP-2096
5x Lysis Buffer	Promega	E1941
仪器
96孔GloMax酶标仪	Promega	E9032
Biomech FX液体处理机器人	Beckmann	A31842
4D-Nucleofector核心单元	Lonza	AAF-1001
96孔Shuttle系统	Lonza	AAM-1001
Countess细胞计数仪	Invitrogen	C10227