淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

摘要

细胞膜脱落的微颗粒（MPs）是具有生物活性的囊泡，可在多种模型中分离并研究其病理生理学效应。本文介绍一种从T淋巴细胞衍生微颗粒（LMPs）的制备方法，并展示其对气道上皮细胞的促凋亡作用。

摘要

近年来，人们对细胞膜来源囊泡在细胞间通讯中的生物学作用日益关注。微囊泡（microparticles, MPs）是其中一类囊泡，直径范围为0.1 μm至1 μm，通常由处于激活或凋亡状态的真核细胞质膜脱落而产生。本文描述了利用放线菌素D诱导CEM T细胞凋亡，从而生成T淋巴细胞来源的微囊泡（LMPs）的方法。LMPs通过多步差速离心法进行分离，并采用流式细胞术进行表征。本方案还介绍了 原位 用于证明LMPs对源自小鼠原代呼吸性支气管组织外植体的支气管上皮细胞促凋亡作用的细胞死亡检测方法。本文所述方法提供了一种可重复的程序，用于从凋亡淋巴细胞中分离出大量LMPs 体外以这种方式获得的LMPs可用于评估各种疾病模型的特征，以及用于药理学和毒理学测试。鉴于气道上皮在外部环境与深层组织之间提供了保护性的物理和功能性屏障，使用支气管组织外植体而非永生化上皮细胞系，可为需要气道组织的研究提供有效的模型。

引言

微粒（MPs）是细胞活化或凋亡后释放的具有生物活性的亚微米级膜囊泡。MPs来源于正常和受损细胞，参与多种生理和病理过程。¹ 微颗粒（MPs）不仅在人血浆中被检测到，也在炎症和凋亡组织中被发现。细胞膜来源的微颗粒在多种情境下已显示出其生物学用途，包括在细胞信号传导模型中以及作为药理学工具的应用。^2,3 我们先前已证实，经放线菌素D（诱导细胞凋亡）刺激后T淋巴细胞产生的微颗粒（LMPs）可抑制血管生成，并抑制内皮细胞的存活与增殖。^4,5 LMPs 的抗血管生成作用可能因激活 T 淋巴细胞所用刺激物的不同而存在显著差异 体外.⁶

气道上皮发挥着保护性的物理和功能屏障作用。气道中T淋巴细胞数量增加可导致细胞损伤和气道炎症。⁷ 我们已证明LMPs可诱导人支气管上皮细胞发生凋亡，⁸ 这表明LMPs可能改变支气管上皮的屏障功能 体内. 可通过TUNEL法鉴定凋亡细胞，该方法可检测 原位 DNA片段化

本实验方案的总体目标是阐述 体外 从T淋巴细胞系制备LMPs，并证明其对气道上皮细胞的促凋亡作用。 原位 细胞死亡检测表明，LMPs 能强烈诱导气道支气管上皮细胞死亡，提示 LMPs 介导的气道上皮损伤可能影响受损上皮的屏障功能。

方案

注意：雄性C57BL/6小鼠（5–7周龄）购自查尔斯河实验室国际公司（Charles River Laboratories International, Inc.，加拿大魁北克省圣康斯坦）。所有操作均依照圣心大学医院动物护理委员会批准的方案进行。小鼠支气管组织外植体是研究LMPs对上皮细胞促凋亡作用的原代支气管上皮细胞的良好来源。本方案描述了 体外 LMPs 的生成，以及在经 LMPs 处理的支气管组织外植体上检测凋亡上皮细胞的方法。本方案包含 3 个部分。

1. LMPs 的制备与表征

注意：为防止污染，确保本实验中使用的所有材料均为无菌或经过高压灭菌。除非另有说明，所有步骤均须在生物安全柜中的无菌条件下于室温（RT）进行。

1.1）微囊泡（MPs）的刺激与收集⁹

1. 在37 °C水浴中解冻一份含1000万CEM T细胞的分装样品。用10 ml预热的无血清造血细胞培养基（如X-VIVO）稀释，转移至15 ml无菌离心管中，以200 g离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 ml预热的培养基中。
2. 将细胞转移至T75组织培养瓶（适用于悬浮细胞），加入15 ml预热的造血细胞培养基（如X-VIVO），在37 °C、5% CO₂的湿润培养箱中培养4天。
3. 4天后，将全部培养基和细胞转移至含有100 ml新鲜培养基的T175组织培养瓶中，在相同条件下继续培养约72小时，直至细胞密度达到200万个细胞/ml。
4. 将细胞均匀分至四个T175培养瓶中，每瓶含150 ml新鲜培养基，继续培养至细胞生长至约200万个细胞/ml（约需48小时培养）。
5. 通过200 × g离心5分钟收集各瓶细胞，将300 × 10⁶个细胞重悬于含150 ml新鲜培养基的新T175培养瓶中，以维持200万个细胞/ml的密度。
6. 向培养基中加入放线菌素D（以DMSO溶解，浓度为2 mg/ml），终浓度为0.5 µg/ml，继续培养24小时。
7. 将全部培养基转移至50 ml锥形离心管中，以750 × g离心5分钟。将上清液转移至新的50 ml锥形离心管中，以1,500 × g离心15分钟，以去除较大的细胞碎片。
8. 将上清液转移至250 ml离心瓶中，以12,000 × g超速离心50分钟。弃去上清液，收集沉淀。
9. 在50 ml离心管中，用40 ml无菌PBS洗涤富含LMPs的沉淀，以12,000 × g离心50分钟。重复此步骤两次。
10. 收集最后一次洗涤的上清液，作为溶剂对照。将LMPs沉淀重悬于1 ml PBS中，转移至1.5 ml无菌微量离心管中。分装后于-80 °C保存分离的LMPs（避免反复冻融）。

1.2）通过流式细胞术分析表征微囊泡 ⁴

1. 准备两份annexin缓冲液，一份含CaCl₂，另一份不含：Hepes 10 mM，NaCl 140 mM，加或不加5 mM CaCl₂。
2. 使用0.22 µm滤膜过滤annexin缓冲液和FACS流动鞘液，以去除颗粒物。
3. 将1 µl LMPs加入含5 mM CaCl₂的44 µl annexin缓冲液中，置于FACS管内。另准备一管，将1 µl LMPs加入不含CaCl₂的44 µl annexin缓冲液中（阴性对照）。
4. 每管加入5 µl annexinV-Cy5，充分混匀。室温避光孵育15分钟。每管加入400 µl FACS流动鞘液稀释反应体系，终止反应。
5. 每管加入10 µl（200,000个微球）7 µm计数微球悬液作为内参标准，用于获得绝对计数。
6. 在流式细胞仪上，使用1 µm的尺寸校准荧光微球（门控1）和7 µm的计数微球（门控2），建立相对大小（FSC-H，PMT E00，对数尺度）和相对颗粒度（SSC-H，PMT 325，对数尺度）的散点图门控。
7. 在FSC-H/SSC-H散点图上分析LMPs样本，并结合FL-4通道（annexin检测，PMT 765，对数尺度）的散点图，采集信号直至门控2中达到20,000个计数微球。
8. 确定在含CaCl₂的annexin缓冲液中LMPs的annexinV阳性事件数，再减去不含CaCl₂的annexin缓冲液中LMPs的事件数（阴性对照）。
9. 根据以下公式计算微囊泡（MPs）的绝对数量：
   

1.3）MP 蛋白浓度测定（Bradford 法）

1. 配制浓度为 1.25 至 20 µg/ml 的蛋白质标准品的 5 个连续稀释梯度。将每种标准品和样品溶液各 800 µl 重复加入洁净的试管中。向每支试管中加入 200 µl Bradford 染料试剂。充分混匀后，在室温下孵育 5 分钟。
2. 在 595 nm 处测定吸光度。利用标准曲线的线性回归方程确定 LMPs 的蛋白质浓度。

2. 支气管组织外植体及LMPs处理

注意：请特别注意无菌工作环境，并以无菌操作方式配制后续实验中使用的所有溶液和培养基。配制完全愈合培养基时，将1 ml组织愈合培养基补充剂（含血清，于冰上解冻）加入100 ml组织愈合培养基中，充分混匀。

2.1）支气管组织外植体的制备

1. 培养前，在6个区域各划出1 cm的划痕² 用手术刀片在每个100 mm组织培养皿表面的边缘进行划痕。每个划痕后的100 mm组织培养皿中加入2 ml培养皿包被液，随后将培养皿置于湿润的CO₂孵箱中孵育₂ 37 °C 过夜培养。用真空抽吸除去多余溶液，向培养皿中加入 15 ml 组织洗涤液。
2. 通过 CO₂ 处死 5 至 7 周龄的 C57BL/6 小鼠₂ 根据动物护理伦理委员会批准的方案进行吸入给药。
3. 无菌条件下使用解剖刀、Dumont超细镊子和手术剪解剖肺组织。小心去除肺实质和血管。如需转运至实验室，将肺组织置于冰上预冷的组织洗涤液中。
4. 将浸没在组织洗涤液中的支气管进一步解剖，分离出直径为1至2.5 mm的支气管，并去除周围肺组织。用手术刀将支气管组织切成约5 mm厚的支气管环。
5. 使用无菌弯头显微解剖镊，以刮取动作拾起支气管片段，并将其放置于培养皿的划痕区域。
6. 移除组织洗涤液，将组织碎片在室温下孵育约5分钟，使其贴附于培养皿表面。
7. 向每皿中加入 10 ml 完全愈合培养基，将培养皿放入受控气氛的模块化培养箱中。用高浓度 O₂ 气体混合物（70% O₂）₂，25% N₂ 和5% CO₂₂将培养室置于台式轨道摇床中，于37 °C振荡培养。以每分钟10个循环的速度振荡24小时，使培养基间歇性流过组织碎片。
8. 24小时孵育后，在倒置相差显微镜下观察组织外植块。选择具有完整、细微纤毛运动和活跃支气管上皮的支气管外植块用于后续LMPs处理。

2.2）LMPs 处理

1. 配制完全生长培养基：将含血清和成纤维细胞抑制剂的生长培养基补充物置于冰上解冻。向100 ml生长培养基中加入1 ml含血清的生长培养基补充物和200 μl成纤维细胞抑制剂，充分混匀。使用前将完全生长培养基在37 °C预热10分钟。
2. 用PBS在新的无菌离心管中稀释分离得到的LMPs，制备浓度为800 µg/ml的LMPs储备液。
3. 向12孔组织培养板的每孔中加入0.5 ml完全生长培养基。
4. 用弯头显微解剖镊子将前一步骤（第2.1节）中选定的支气管组织块转移至组织培养板的各孔中。
5. 正确标记培养板以区分LMPs处理孔和对照孔。向每个LMPs处理孔中加入25 µl LMPs储备液（终浓度为40 μg/ml），向对照孔中加入25 µl对照溶剂（参见LMPs制备方法）。
6. 将培养板置于可控气氛的模块化培养箱中，在37 °C下轻轻振荡继续孵育。
7. 孵育24小时后，用PBS洗涤组织块3次，随后进行下一步操作（4%多聚甲醛[PFA]固定）。

3. 组织病理学检查

3.1）在进行下一步之前，准备以下溶液

1. 通过混合 137 mM NaCl、2.7 mM KCl、10 mM Na₂HPO₄、1.76 mM KH₂PO₄ 配制 1× PBS 缓冲液，调节 pH 至 7.4。
2. 配制 4% PFA：将 20 g PFA 溶于 400 ml 水中，在 60 °C 下加热搅拌溶解；加入数滴 10 M NaOH 使溶液澄清。随后加入 1× PBS 缓冲液，定容至 500 ml，并调节 pH 至 7.4。过滤后分装，于 -20 °C 保存。
3. 配制以下脱水或复水试剂：100%、90%、70%、50% 乙醇及二甲苯。

3.2）外植体固定与组织切片脱蜡

1. 将每个外植体放入含有1.5 ml 4%多聚甲醛的已标记微量离心管中，4 °C过夜孵育。用1×PBS将外植体清洗两次。
2. 通过酒精梯度进行外植体脱水（70%乙醇：每次30分钟，重复3次；90%乙醇：每次30分钟，重复2次；100%乙醇：每次30分钟，重复3次；然后二甲苯：每次20分钟，重复3次）。所有步骤均在室温下通风橱内进行。
3. 将组织外植体置于58 °C烘箱中进行石蜡包埋。使用旋转式切片机制备5 µm厚的组织切片。
4. 将切片漂浮于56 °C水浴中，随后转移至已标记的组织学载玻片上。将载玻片置于手动染色架中，65 °C烘干1小时。随后在室温下冷却载玻片。
5. 将染色架依次浸入4个盛有二甲苯的染色缸中，每个10分钟，以去除石蜡。再将染色架浸入乙醇梯度中以去除二甲苯：依次为100%、95%、80%、70%、50%乙醇（每步5分钟）。最后用自来水冲洗染色架5分钟，以去除乙醇。

3.3）苏木精和伊红（H&E）染色

1. 继续处理固定的组织切片；将切片架放入盛有 Mayer 苏木精染液的染色缸中染色 15 分钟。用自来水冲洗切片架 20 分钟，以去除苏木精染液。
2. 将切片架依次浸入蒸馏水中 30 秒，再放入 95% 乙醇中 30 秒。随后放入伊红 Y 溶液染色缸中染色 1 分钟。依次通过两次 95% 乙醇、100% 乙醇和二甲苯进行脱水，每次 2 分钟。
3. 在显微镜下快速检查，确保过量的伊红已被去除。在每张载玻片上滴加 2 至 3 滴封片介质（Fisher SP15-100），然后加盖盖玻片。

3.4) 原位 细胞死亡检测：TUNEL 法

1. 开始前，配制蛋白酶K工作液：将蛋白酶K溶于10 mM Tris/HCl（pH 7.4）中，终浓度为20 µg/ml。
2. 重复第3.2节的步骤1至5（组织块固定与组织切片脱蜡）。用去离子H₂O冲洗载玻片。
3. 将载玻片浸入1x PBS中孵育10分钟。吸去多余PBS。在室温下用蛋白酶K工作液孵育组织切片30分钟。用1x PBS冲洗载玻片两次。
4. 按照细胞死亡检测试剂盒说明书进行TUNEL检测。使用封片剂封片，并手动加盖玻璃盖玻片。
5. 在光学显微镜下观察样本。使用Image Pro 4.5软件分析呈棕褐色的凋亡细胞。

结果

使用膜联蛋白V染色¹⁰结合荧光激活细胞分选（FACS）分析对LMPs进行表征，并利用1 µm微球进行门控，其中97%的微颗粒（MPs，≤1 µm）呈膜联蛋白V-Cy5阳性（图1A和1B）。通常，采用本方案可获得约2.5 mg的LMPs。将C57BL/6小鼠的支气管组织外植体分别用载体对照和LMPs处理。对支气管切片进行组织病理学分析，以评估LMPs对支气管上皮结构完整性的效应。在对照组外植体中，支气管上皮基本未受损（图2A）；而在LMPs处理的外植体中，表层上皮细胞层出现损伤或缺失，且上皮细胞的高度和密度显著降低（图2B）。与对照组相比，LMPs处理组的支气管上皮中TUNEL阳性染色（凋亡标志物）更为明显（图3）。

讨论

微囊泡（MPs）是细胞间相互作用的活性介质，其研究在科学的多个领域具有广阔前景。¹¹ 本研究提供了一项详细的实验方案 体外 大规模制备源自凋亡T细胞系的淋巴细胞微颗粒（LMPs）。这些微颗粒表达多种淋巴细胞分子，在细胞和组织稳态的调节中具有重要的生物学功能。然而，来源于不同来源的LMPs在生物学特性上可能存在差异。^4,9,12,13

LMPs 的特性随生成时所用刺激因素的不同而有所差异 体外 以及它们所来源的细胞。因此，对所获得数据的外推 体外 使用永生化细胞系衍生的LMPs与由LMPs生成的数据 体内 应谨慎操作。

本方案描述了分离微粒体（MPs）所需的多个离心步骤，因此需要谨慎操作以尽量减少此过程中MPs的损失。建议将分离得到的LMPs在-70 °C条件下进行速冻保存；我们观察到，在此条件下LMPs的生物活性可保持长达2年（未发表数据）。

迄今为止，流式...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LMP 生产和表征
CEM T 细胞	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 培养基	Cambrex， Walkersville	04-744Q
培养瓶 T75	Sarstedt	83.1813.502
培养瓶 T175	Sarstedt	83.1812.502
放线菌素 D	Sigma Chemical Co. 西格玛化工公司	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 &微量;m 过滤器	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen
FACS 流式解决方案	BD Bio-sciences 342003
荧光微珠 （1 µm）	分子探针	T8880
聚苯乙烯计数微珠（7 µm）	Bangs laboratories	PS06N/6994
聚丙烯 FACS 管	Falcon	352058
1 ml 移液管	Fisher	13-678-11B
5 ml 移液管	Falcon	357543
25 ml 移液管	Ultident	DL-357551
1.5 ml 锥形聚丙烯微管	Sarstedt	72.690
15 ml 锥形聚丙烯管	Sarstedt	62.554.205
50 ml 锥形聚丙烯管	Sarstedt	62.547.205
50 ml 高速聚丙烯共聚物管	Nalgene	3119-0050
250 ml 高速聚丙烯瓶	贝克曼	356011
蛋白质测定（Bradford 测定）	Bio-Rad Laboratories	500-0006
蛋白质检测标准 II	Bio-Rad Laboratories	500-0007
试管 16 x 100	VWR	47729-576
试管 12 x 75	Ultident	170-14100005B
细胞培养箱	Mandel	Heracell 150
低速离心机	IEC	Centra8R
高速离心机	Beckman	Avanti J8
250ml 瓶高速转子	Beckman	JLA16.250
50ml 管高速转子	Beckman	JA30.50
Fow 流式细胞仪	BD Bio-sciences	FACS Callibur
分光光度计	Beckman	系列 600
支气管组织外植体和切片
C57BL/6 小鼠 （5-7 周龄）	Charles River Laboratories， Inc.
小鼠气道 PrimaCell™系统名称：	CHI Scientific， Inc.	2-82001
Rib-Back 碳钢手术刀刀片	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
手术刀手柄	Fine Science Tools Inc.	10003-12	#7
相差倒置显微镜	奥林巴斯光学有限公司	CK2
高 O2 混合气体	VitalAire Canada Inc. 公司
模块化培养箱	Billups-Rothenberg Inc.	MIC-101
MaxQ 4000 孵育轨道摇床	Barnstead Lab-Line，	SHKA4000-7
12 孔组织培养板	Becton Dickinson and Company	353043
塑料组织培养皿 （100 mm）	Sarstedt， Inc.	83.1802
手术剪刀	Fine Science Tools Inc.	14060-09	直、尖、长 9 厘米
半弯 Graefe 镊子	Fine Science Tools Inc.	11052-10
加湿 CO2 培养箱	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
组织病理学检查
福尔马林甲醛	Sigma-Aldrich， Inc.	HT5011
石蜡	Fisher Scientific 国际公司	T555
乙醇	Merck KGaA， Darmstadt	EX0278-1
戊二醛	Sigma-Aldrich， Inc.	G6403
二甲胂酸盐	Sigma-Aldrich， Inc.	31533
显微镜载玻片	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
二甲苯	费舍尔科学 国际公司	X5-4
Mayer's 苏木精	Sigma-Aldrich， Inc.	MHS16	带滤纸漏斗
盐酸盐	费舍尔科学 国际公司	A144s-500
伊红	Sigma-Aldrich， Inc.	HT110116	带滤纸的漏斗
Permount™封固剂	Thermo Fisher Scientific Inc.	SP15-100
玻璃盖玻片	surgipath medical industries， Inc.	84503	24&次24 #1
TUNEL 检测试剂盒	原位细胞死亡检测，POD	11 684 817 910
烘箱	Despatch Industries Inc.	LEB-1-20
轮转切片机	Leica Microsystems Inc.	RM2145
滤纸	Whatman International Ltd.	1003150	#3
显微镜	Nikon Imaging Japan Inc.	E800
染色皿完整	版 Wheaton Industries， Inc.	900200	包括培养皿、架子、盖
1.5 ml eppendorf 管	Sarstedt Inc.	72.69	39x10 mm
轨道和往复式水浴	ExpotechUSA	ORS200
磷酸盐缓冲盐水	GIBCO	14190-144
通风柜	Nicram RD 服务	3707E