淋巴细胞微颗粒的制备及其对气道上皮细胞促凋亡效应的检测

摘要

细胞膜脱落的微颗粒（MPs）是具有生物活性的囊泡，可在多种模型中分离并研究其病理生理学效应。本文介绍一种从T淋巴细胞衍生微颗粒（LMPs）的制备方法，并展示其对气道上皮细胞的促凋亡作用。

摘要

近年来，人们对细胞膜来源囊泡在细胞间通讯中的生物学作用日益关注。微囊泡（microparticles, MPs）是其中一类囊泡，直径范围为0.1 μm至1 μm，通常由处于激活或凋亡状态的真核细胞质膜脱落而产生。本文描述了利用放线菌素D诱导CEM T细胞凋亡，从而生成T淋巴细胞来源的微囊泡（LMPs）的方法。LMPs通过多步差速离心法进行分离，并采用流式细胞术进行表征。本方案还介绍了 原位 用于证明LMPs对源自小鼠原代呼吸性支气管组织外植体的支气管上皮细胞促凋亡作用的细胞死亡检测方法。本文所述方法提供了一种可重复的程序，用于从凋亡淋巴细胞中分离出大量LMPs 体外以这种方式获得的LMPs可用于评估各种疾病模型的特征，并用于药理学和毒理学检测。由于气道上皮在外部环境与下层组织之间提供了保护性的物理和功能屏障，因此相较于永生化上皮细胞系，使用支气管组织外植体可为需要气道组织的研究提供更为有效的模型。

引言

微粒（MPs）是细胞活化或凋亡后释放的具有生物活性的亚微米级膜囊泡。MPs来源于正常和受损细胞，参与多种生理和病理过程。¹ 微囊泡（MPs）不仅在人血浆中被检测到，也在炎性组织和凋亡组织中被发现。细胞膜来源的微囊泡在多种情境下已展现出其生物学用途，包括细胞信号传导模型以及作为药理学工具的应用。^2,3 我们先前已证实，经放线菌素D（actinomycin D）刺激（以诱导凋亡）的T淋巴细胞所释放的淋巴细胞微颗粒（LMPs）可抑制血管生成，并抑制内皮细胞的存活与增殖。^4,5 LMPs 的抗血管生成作用可能因用于激活 T 淋巴细胞的刺激物不同而存在显著差异 体外.⁶

气道上皮发挥着保护性的物理和功能屏障作用。气道中T淋巴细胞数量增加可导致细胞损伤和气道炎症。⁷ 我们已证明LMPs可诱导人支气管上皮细胞发生凋亡，⁸ 这表明LMPs可能改变支气管上皮的屏障功能 体内. 凋亡细胞可利用TUNEL法进行鉴定，该方法可检测DNA断裂末端 原位 DNA片段化

本实验方案的总体目标是阐明 体外 从T淋巴细胞系制备LMPs，并证明其对气道上皮细胞的促凋亡作用。 原位 细胞死亡检测表明，LMPs 能强烈诱导气道支气管上皮细胞....

方案

注意：雄性C57BL/6小鼠（5–7周龄）购自查尔斯河实验室国际公司（Charles River Laboratories International, Inc.，加拿大魁北克省圣康斯坦）。所有操作均依照圣心医院（CHU Sainte-Justine）动物护理委员会批准的方案进行。小鼠支气管组织外植体是获取原代支气管上皮细胞的良好来源，可用于研究LMPs对上皮细胞的促凋亡作用。本方案描述了 体外 LMPs 的生成，以及在经 LMPs 处理的支气管组织外植体上检测凋亡上皮细胞的方法。本方案包含 3 个部分。

1. LMPs 的制备与表征

注意：为防止污染，确保本实验中使用的所有材料均为无菌或经过高压灭菌处理。除非另有说明，所有步骤均须在室温下于生物安全柜内的无菌条件下进行。

1.1）微囊泡（MPs）的刺激与收集⁹

1. 在37 °C水浴中解冻一份含有1000万CEM T细胞的分装样品。将其加入含有10 ml预热的无血清造血细胞培养基（如X-VIVO）的15 ml无菌离心管中，于200 g条件下离心5分钟。吸除上清液，将细胞重悬于5 ml预热的培养基中。
2. 将细胞转移至一个T75组织培养瓶（适用于悬浮细胞），加入15 ml预热的造血细胞培养基（如X-VIVO），在37 °C、5% CO₂

结果

通过荧光激活细胞分选（FACS）分析结合膜联蛋白V染色¹⁰对LMPs进行表征，并使用1 µm微珠设门，其中97%的微囊泡（MPs，≤1 µm）呈膜联蛋白V-Cy5阳性（图1A和1B）。通常，按照本方案可获得约2.5 mg的LMPs。将C57BL/6小鼠的支气管组织外植体分别用载体对照和LMPs处理。支气管切片的组织病理学分析揭示了LMPs对支气管上皮结构完整性的效应。在对照组外植体中，支气管上皮基本未受损（图2A）；而在LMPs处理的外植体中，表层上皮细胞层出现损伤或缺失，且上皮细胞高度和密度显著降低（图2B）。与对照组相比，LMPs处理的支气管上皮中TUNEL阳性染色（凋亡标志物）更为明显（图3）。

讨论

微囊泡（MPs）是细胞间相互作用的活性介质，其研究在科学的多个领域具有广阔前景。¹¹ 本研究提供了一项详细的实验方案 体外 大规模制备源自凋亡T细胞系的淋巴细胞微粒（LMPs）。这些微粒表达多种淋巴细胞分子，在细胞和组织稳态的调控中具有重要的生物学功能。然而，来源于不同来源的LMPs在生物学特性上可能存在差异。^4,9,12,13

LMPs 的特性随生成其所用刺激因素的不同而有所差异 体外 以及它们所来源的细胞。因此，对所获得数据的外推 体外 使用永生化细胞系衍生的LMPs与由LMPs生成的数据 体内 应谨慎操作。

本方案描述了分离微粒体（MPs）所需的多个离心步骤；因此，需谨慎操作以尽量减少此过程中MPs的损失。建议将分离得到的LMPs在-70 °C下快速冷冻；我们观察到，在此条件下LMPs的生物活性可保持长达2年（未发表数据）。

迄今为止，流式细胞术被认为.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LMPs 的制备与表征
CEM T细胞	ATCC	CCL-119
X-VIVO 15 培养基	Cambrex，沃克维尔	04-744Q
T75 培养瓶	Sarstedt	83.1813.502
T175 培养瓶	Sarstedt	83.1812.502
放线菌素 D	Sigma化学公司	A9415-2mg
PBS	Lifetechnologies	14190-144
0.22 µm 滤膜	Sarstedt	83.1826.001
Annexin-VCy5	BD Pharmagen	559933
FACS 流式溶液	BD 生物科学	342003
荧光微珠（1 µm)	分子探针	T8880
聚苯乙烯计数微球（7 µm)	邦斯实验室	PS06N/6994
聚丙烯FACS管	Falcon	352058
1 ml 移液管	Fisher	13-678-11B
5 ml 移液管	Falcon	357543
25 ml 移液管	Ultident	DL-357551
1.5 ml 锥形聚丙烯微量离心管	Sarstedt	72.690
15 ml 锥形聚丙烯管	Sarstedt	62.554.205
50 ml 锥形聚丙烯管	Sarstedt	62.547.205
50 ml 高速聚丙烯共聚物管	Nalgene	3119-0050
250 ml 高速聚丙烯瓶	贝克曼	356011
蛋白质定量分析（Bradford 法）	伯乐生命科学公司	500-0006
蛋白测定标准品 II	伯乐生命科学公司	500-0007
试管 16 x 100	VWR	47729-576
试管 12 x 75	Ultident	170-14100005B
细胞培养箱	Mandel	Heracell 150
低速离心机	IEC	Centra8R
高速离心机	贝克曼	Avanti J8
适用于250 ml瓶的高速转子	贝克曼	JLA16.250
适用于50 ml离心管的高速转子	贝克曼	JA30.50
流式细胞术	BD 生物科学	FACS Calibur
分光光度计	贝克曼	600 系列
支气管组织外植体与切片
C57BL/6小鼠（5-7周龄）	查尔斯河实验室公司
小鼠气道原代细胞™ 系统：	CHI Scientific, Inc.	2-82001
肋纹背碳钢手术刀片	Becton Dickinson AcuteCare	371310	#10
手术刀柄	Fine Science Tools 公司	10003-12	#7
倒置相差显微镜	奥林巴斯光学株式会社	CK2
高氧2 气体混合物	VitalAire Canada Inc.
模块化培养箱室	Billups-Rothenberg 公司	MIC-101
MaxQ 4000 恒温轨道摇床	Barnstead Lab-Line，	SHKA4000-7
12孔细胞培养板	Becton Dickinson and Company	353043
塑料细胞培养皿（100 mm）	Sarstedt, Inc.	83.1802
手术剪刀	Fine Science Tools 公司	14060-09	直、锋利、9 cm长
半弯式格雷费镊	Fine Science Tools 公司	11052-10
加湿CO2培养箱	Mandel Scientific Company Inc.	SVH-51023421
组织病理学检查
甲醛 甲醛	Sigma-Aldrich, Inc.	HT5011
石蜡	Fisher Scientific  国际有限公司	T555
乙醇	默克股份公司，达姆施塔特	EX0278-1
戊二醛	Sigma-Aldrich, Inc.	G6403
卡考基酸盐	Sigma-Aldrich, Inc.	31533
显微镜载玻片	VWR Scientific Inc.	48300-025	25x75 mm
二甲苯	Fisher Scientific  国际有限公司	X5-4
Mayer's 苏木精	Sigma-Aldrich公司	MHS16	带滤纸的漏斗
HCl	Fisher Scientific  国际有限公司	A144s-500
伊红	Sigma-Aldrich公司	HT110116	带滤纸的漏斗
佩尔蒙特™ 封片剂	赛默飞世尔科技公司	SP15-100
玻璃盖玻片	Surgipath Medical Industries, Inc.	84503	24×24 #1
TUNEL 检测试剂盒	原位细胞死亡检测，POD	11 684 817 910
烤箱	德斯帕奇工业公司	LEB-1-20
旋转式切片机	徕卡显微系统公司	RM2145
滤纸	Whatman International Ltd.	1003150	#3
显微镜	尼康影像日本有限公司	E800
染色皿完整	Wheaton Industries, Inc.	900200	包括培养皿、支架、盖子
1.5 ml 离心管	Sarstedt 公司	72.69	39x10 mm
振荡式与往复式水浴箱	ExpotechUSA	ORS200
磷酸盐缓冲液	GIBCO	14190-144
通风橱	Nicram RD 服务	3707E