完整上皮组织中嗅觉感觉神经元的穿孔膜片钳记录：表达特定嗅觉受体神经元的功能分析

摘要

分析嗅觉感觉神经元的生理特性仍面临技术上的局限。本文通过在基因靶向小鼠的完整嗅觉上皮组织制备中采用穿孔式膜片钳技术记录这些神经元的活动。该技术可用于表征表达特定嗅觉受体的神经元的膜特性及其对特异性配体的反应。

摘要

分析嗅觉感觉神经元（OSN）在特定配体刺激下的生理反应，对于理解嗅觉驱动行为及其调控机制的基础至关重要。这些编码特性在很大程度上取决于气味分子与OSN中表达的嗅觉受体（OR）之间的初始相互作用。所表达OR的身份、特异性及其配体谱系至关重要。在嗅觉上皮中随机选取一个OSN，找到其表达OR的配体的概率极低。为应对这一挑战，本方案采用基因标记的小鼠模型，其在特定OR启动子的控制下表达荧光蛋白GFP。OSN位于鼻腔内壁排列紧密且有序的嗅觉上皮中，邻近细胞对其成熟与功能具有影响。本文描述了一种分离完整嗅觉上皮的方法，并通过膜片钳记录技术，研究表达特定气味受体的OSN的电生理特性。该方案可在保留邻近组织影响的前提下，表征OSN的膜特性。对膜片钳记录结果的分析可 精确量化配体/OR相互作用、信号转导通路与药理学特性、OSN的编码属性及其在膜水平上的调控机制。 

引言

嗅觉感觉神经元（OSN）是嗅觉感知的第一步。在啮齿类动物中，它们位于鼻腔内衬的嗅觉上皮中，能够将气味分子的化学信息转化为动作电位，并通过轴突传递至大脑。为了更好地理解嗅觉编码机制，有必要对OSN的转导过程及其膜特性进行表征。直到最近，大多数用于研究哺乳动物OSN特性的技术都是在分离的OSN上进行的^1-4。分离过程采用多种机械和化学方法（例如，酶解）使OSN从其原有环境中释放出来。这些操作导致可用于记录的细胞数量较少。对于表达GFP标记的细胞而言，这一数量可能更加有限。此外，分离过程还消除了OSN与嗅觉上皮中其他细胞之间的局部细胞间相互作用，而这些相互作用可能有助于OSN的存活及其特性的调节。为避免分离步骤带来的问题，研究人员已开发出一种完整的组织制备方法⁵。

每个嗅觉感觉神经元（OSN）表达一种从大型多基因家族中选择的嗅觉受体（OR）⁶。小鼠主嗅上皮中约有 1,000 种 OR 表达。由于野生型动物中 OR 数量众多，记录表达相同 OR 的 OSN 的概率极低。为克服这些限制，目前已开发出基因靶向小鼠 ，其中所有表达特定 OR 的 OSN 均被标记上荧光蛋白^7-9。这些标记的 OSN 已被用于离体分离制备的功能分析^7,10,11，但存在前述的局限性。因此，利用遗传标记小鼠制备完整的上皮组织⁵可规避这些问题，能够在尽可能接近体内（in vivo）的环境中，监测表达特定定义 OR 的 OSN 的活动。此外，对 OSN 进行膜片钳记录还可实现对膜特性、转导通路药理学以及配体/受体相互作用的精确分析。而这些研究内容几乎无法通过细胞外记录实现。我们已利用该技术监测表达气味受体 SR1 和 MOR23 的 OSN 的反应^12,13。其他研究团队也已在表达 MOR23 的 OSN¹⁴以及其他表达特定 OR 的神经元^15,16中验证了该技术的可行性。对特定 OSN 群体的监测，可促进在多种不同背景下对其特性进行分析，例如发育过程¹⁴、衰老¹⁷、气味诱导的可塑性¹⁸，以及气味受体序列变异在气味编码中的作用¹⁵。因此，本实验方案为在膜电位水平上监测特定 OSN 的功能特性提供了一种强有力的工具。

方案

本方案遵循勃艮第大学的动物护理指南，并已获得勃艮第大学伦理委员会的批准。

1. 动物

1. 使用杰克逊实验室提供的基因工程改造的 OR-IRES-tauGFP 小鼠。这些小鼠由 Peter Mombaerts 博士实验室开发，用于分析嗅觉系统中轴突投向及发育过程¹⁹。例如，MOR23-IRES-tauGFP 品系，货号 006643，其正式品系名称为 B6;129P2-Olfr16^tm2Mom/MomJ；同样，SR1-IRES-tauGFP 品系，货号 6717，其正式名称为 B6;129P2-Olfr124^tm1Mom/MomJ。
2. 关于动物年龄：为获得更佳的实验结果，建议使用 2 至 4 周龄的动物。在此年龄段，解剖操作更为便利（骨骼较软，嗅上皮更坚韧），且树突结节较年长动物更大。

2. 电极和溶液的制备

1. 对于刺激电极：购买预拉制的刺激电极，否则需手动制备。
   1. 使用火焰将六根1 mm玻璃移液管在距尖端约1 cm处弯曲。将这六根弯曲的移液管以及一根直的7^th 使用1.5 cm热缩管并通过金属环加固。
   2. 使用热缩管将桶体固定在一起。在桶体的另一端连接一段额外的热缩管。使用多通道拉制仪拉制该刺激电极。
   3. 在孔眼周围添加一些白色乳胶以加固弯曲的末端，室温静置过夜晾干。
2. 配制1或2 L的正常Ringer氏细胞外液（单位：mM：NaCl 124，KCl 3，MgSO₄ 2，CaCl₂ 2，NaHCO₃ 26，NaH₂PO₄ 1.25，葡萄糖10）₄ 1.3, CaCl₂ 2, NaHCO₃₃ 26, NaH₂PO₄ 1.25，葡萄糖 15；pH 7.6，305 mOsm）。置于 4 °C 保存，待用。
3. 配制细胞内储存液（单位：mM）：KCl 70，KOH 53，甲磺酸 30，EGTA 5，HEPES 10，蔗糖 70；用 KOH 调节 pH 至 7.2，渗透压为 310 mOsm。4 °C 保存，可使用数周。
4. 实验前即刻新鲜配制含制霉菌素的细胞内记录液。
   1. 称取3 mg制霉菌素，加入50 µl DMSO；涡旋20秒，然后超声2-3分钟，直至完全溶解。
   2. 加入20 µl DMSO-制霉菌素溶液至5 ml中 细胞内储备液。涡旋20秒，然后超声3分钟。将此溶液置于4 °C保存，并避免直接光照，因制霉菌素对光敏感。该溶液可使用数小时，需每日更换。
   3. 将嗅上皮组织置于显微镜下后，取1 ml该溶液 使用火焰拉制的黄色尖端注射器填充电极；避免直接光照。一旦达到室温，制霉菌素溶液不稳定；每小时更换1 ml注射器中的溶液，或将其置于冰中保存。
5. 使用拉制仪制备记录电极，使其具有长颈和小尖端（约 2 µm），并在内液含制霉菌素溶液中达到 15–20 MΩ 的电阻。
6. 在通风橱内用DMSO配制0.5 M的气味剂溶液；分装后于-20 °C保存备用。用Ringer溶液将气味剂稀释至所需浓度。填充刺激用移液管。

3. 嗅觉上皮的制备

注意：OR-IRES-tauGFP 小鼠在 OR 启动子的调控下表达 tauGFP。在这类小鼠中，所有表达目标 OR 的神经元均被 GFP 标记。本方案适用于在所有区域表达的 OR，但对于在背侧区域表达的 OR，解剖和记录操作更为简便。

1. 通过注射氯胺酮和赛拉嗪混合物（剂量分别为150 mg/kg和10 mg/kg体重）对动物进行麻醉。 对于幼鼠可使用锋利的剪刀断头，而对于成年鼠则应使用维护良好的啮齿类动物断头器。
   1. 使用环形解剖剪沿背部正中线纵向剪开皮肤，并将皮肤向两侧拉开。用剪刀在下颌关节处剪断下颌骨，再通过与牙齿平行的冠状面切割去除上门齿。
   2. 在眼睛后方对头部进行冠状面切割，仅保留头部前段。将其浸入冰浴Ringer溶液中，以备在显微镜下进行解剖。
2. 在显微镜下进行解剖：于腹侧沿上颌/牙齿纵向剪开。沿鼻腔背外侧方向纵向剪开背侧骨骼。去除大部分骨组织和腭部；将鼻中隔及其附着的上皮转移至室温含氧Ringer溶液中。
3. 最终解剖步骤：在开始记录前，用镊子将上皮从下方的鼻中隔上剥离。在鼻中隔前部黏附较牢固的区域，使用镊子配合两处4-5 mm的剪切（使用显微剪刀），将上皮完全分离。
   1. 沿犁鼻器与鼻中隔上皮的背侧连接处小心剪除犁鼻器。将上皮转移至记录室，使黏液层朝上，并用网格固定装置保持其平整。
4. 将记录室安装在配备荧光光学系统和高灵敏度相机的直立显微镜下。通过40倍水浸物镜（数值孔径0.8）以及额外2倍或4倍的放大透镜，在计算机屏幕上以高倍放大观察标本。持续以室温含氧Ringer溶液灌流（1-2 ml/min）。

4. 记录过程

1. 寻找荧光细胞：在480 nm波长下激发EGFP，其发射光范围为530-550 nm；选择一个在荧光和明场下均清晰可见的树突结。
2. 用含制霉菌素的细胞内溶液填充电极；通过轻轻敲击电极去除气泡。
3. 将电极插入电极夹持器，向移液管施加正压；电阻应为15-20 MΩ。
4. 将电极靠近细胞；当电阻达到约40 MΩ时，释放正压并施加轻微负压以形成吉欧封接（gigaseal）。
5. 封接形成后，将膜电位设定在约-75 mV；
6. 细胞破膜后，开始刺激程序或药理处理。为测量单次气味刺激的反应，先记录200-500毫秒的自发活动，随后进行500毫秒的刺激，并持续记录细胞反应达10秒 ¹³。进行药理处理时，以所需浓度灌注药理试剂²⁰。

5. 数据分析

1. 分析气味刺激所诱发的电流，包括：最大振幅、上升时间（达到最大振幅90%所需的时间，单位为毫秒）、总电流量（曲线下面积，单位为皮安·秒）以及50%时间（反应从起始到结束在最大振幅50%处的时间间隔，单位为毫秒）。
   1. 利用不同浓度下的峰值转导电流（达到的最大振幅），使用Hill方程绘制并拟合剂量-反应曲线：I  = Imax/(1 + (K_1/2/Cⁿ），其中 I 代表峰值电流，Imax 代表在饱和浓度下的最大反应，K1/2 代表达到最大反应一半时的浓度，C 代表气味物质的浓度，n 代表 Hill 系数。
2. 在电流钳模式下分析膜电位记录，检测最大去极化程度以及诱发的总电位（曲线下面积，单位为 mV·sec）；记录30秒至1分钟内的自发性放电活动；通过注入电流（5–10 pA）诱发的动作电位记录细胞兴奋性。

结果

该方案的结果取决于解剖的质量。解剖步骤必须简短（少于10至15分钟）且精确即， 以避免上皮损伤）。 图1 展示了理想样本在不同放大倍数下的形态特征。在明场低倍镜下，可区分不同类型的细胞（如嗅觉神经元的结状突起、支持细胞等）。图1A）。在明场下最高放大倍数（通常为80X至160X）时，嗅觉神经元的树突 knob 应能清晰地区别于支持细胞（图1B）。在荧光灯下，仅可见GFP标记细胞的树突 knobs 和纤毛（图1C）。通过比较这两幅图像，可用记录电极接近标记的细胞（图1D).

解剖液的温度以及解剖操作的时间至关重要。解剖的第一部分，即隔膜的制备（第3.1.1至3.2节），应在冰浴条件下于5至10分钟内完成。最终解剖步骤（3.3）应在室温下持续少于5分钟。若解剖操作耗时过长，或在过热的解剖液中进行，则组织样本通常会迅速出现损伤表现：树突状小结浮于上皮表面，形态类似死亡细胞。

讨论

该方案能否准确监测健康嗅觉神经元（OSN）的特性，在很大程度上取决于制备的质量。因此，解剖步骤至关重要。首先，必须注意解剖液的质量（pH值、渗透压）、氧合状态和温度（冰上预冷但未结冰）。其次，使用解剖工具操作上皮组织时应尽可能轻柔，以避免造成损伤。最后，获得尽可能平坦的组织制备物至关重要，以便能够接触到最大数量的OSN群体。

解剖质量是获得健康组织样本的基础。然而，解剖方法可以有多种选择：本文介绍的是从腹侧向背侧进行解剖，但部分操作者可能更倾向于从背侧开始解剖，以快速打开鼻腔并迅速暴露嗅上皮的鼻中隔隐窝区域。因此，每位操作者可根据自身情况调整方案，采用最有效的策略以获得目标区域的健康组织样本。

一旦将样本置于显微镜下，就必须持续永久地监测样本的健康状态。事实上，不健康的样本会导致形成吉欧欧姆密封（gigaseal）的概率降低。若获得吉欧欧姆密封的效率较低，可通过更换样本上的观察区域以寻找更健康的嗅觉神经元（OSNs）来改善情况。更为彻底的解决方案是完全更换为新的样本。一旦形成密封，仍可能出现难以进入“开放”状态的情况。这可能是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
带法拉第笼的振动台	TMC	63-500 系列	要求：将记录系统与环境中产生的振动隔离开（如实验人员移动、计算机散热风扇等设备的振动）；可选购带法拉第笼的型号，或自行配备定制的法拉第笼；建议使用该笼以避免环境中电噪声的干扰
光学
显微镜	Olympus	BX51WI	配备落射荧光装置的直立显微镜；固定或移动载物台，可根据用户偏好选择
目标	奥林巴斯	LUMPLFL40XW	至少需要两个物镜：一个 4X 或 10X 物镜，用于细胞的粗调定位；另一个为 40X 浸液长工作距离物镜，例如 Olympus LUMPLFL40XW / IR /0.8 / WD:3.3 MM
放大镜	Olympus	U-TVCAC	绝对必要：置于物镜与相机之间的光路中；可放大屏幕上的图像，以便精确对准记录电极的旋钮
相机	Olympus	DP72	需要一台性能良好的相机，以便在荧光和明场下观察神经元；控制软件操作简单，可拍摄图像并进行实时摄像监控，以观察电极接近细胞的过程。无需使用超灵敏相机。
过滤器	Olympus/Chroma		根据小鼠所用的荧光蛋白而定；以GFP为例：激发：BP460-490；发射：HQ530/50m
放大器	HEKA	EPC10 USB	监测记录电极中的电流流动，并通过向喷液装置发送TTL信号来控制给药；EPC10系统由计算机控制
软件	HEKA	Patchmaster	在实验过程中控制放大器
显微操作仪	Sutter	MP225	精密显微操作器，可实现低至十分之一微米的精确移动；该型号非常稳定；避免使用可能产生漂移的液压操作器
电极拉制仪	Sutter	P97	采用 FT345-B 宽槽灯丝；  准备约2的记录电极µ微米直径，带有长尖端以接触细胞；使用穿孔膜片钳溶液时，电阻应为15至20 MΩ
玻璃	Sutter	BF120-69-10	在我们的记录条件下，这种玻璃是制作记录电极的理想材料
记录室	Warner Instruments	RC-26G	需要一个腔室，以便将样本置于显微镜下。为使样本保持在腔室中央，应使用网状固定器/锚定装置。
刺激
玻璃	WPI	TW100F-4	以每组7支成捆附着，这些移液管用于制备预拉制的刺激移液管
多通道拉制仪	MDI	PMP-107-Z	通过拉伸与扭转的联合作用，该拉制仪使我们能够制备具有7个管腔的灌注电极
精密压力注射器	图伊公司	P/N T25-1-900 单通道	该精密压力注射器  控制多管拉制仪中施加的压力；可通过手动或由放大器通过5V电压进行控制  TTLs
显微操作仪	Narishige	YOU-1	粗调操纵器足以将喷射电极移近记录位点
管路	N/A		使用Tygon管将压力从加压装置传导至微注射移液管
解决方案/灌流/化学品
真空泵	gardner denver	300 系列	振动膜片泵比其他类型的泵更安静且效率更高
灌注系统	N/A	N/A	使用聚乙烯管路的重力灌流系统，用于向记录室输入和输出外部溶液
制霉菌素	Sigma-Aldrich	N3503	制备穿孔膜片钳实验所需的内液是必需的
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D5879	用于溶解制霉菌素以配制穿孔膜片记录的胞内溶液
氯化钠	Sigma-Aldrich	S9625	细胞外溶液
氯化钾	Sigma-Aldrich	P4504	细胞内/细胞外溶液
二水合氯化钙	Sigma-Aldrich	C7902	细胞外液
磷酸二氢钠一水合物（NaH2PO4)	Sigma-Aldrich	S9638	细胞外液
七水合硫酸镁（MgSO₄·7H₂O）4 7H2O	Sigma-Aldrich	63140	细胞外液
葡萄糖	Sigma-Aldrich	G8270	细胞外液
碳酸氢钠	Sigma-Aldrich	S6297	细胞外液
EGTA（乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸）′，N′四乙酸	Sigma-Aldrich	E3889	内液
氢氧化钾	Sigma-Aldrich	P1767	内液
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	W387509	细胞内液
Hepes-Na	Sigma-Aldrich	H7006	细胞内液
蔗糖	Sigma-Aldrich	S0389	细胞内溶液