方法文章

利用衣壳抗原掺入战略的腺病毒血清型5载体疫苗方法的发展

DOI：

10.3791/52655

⸱

2015年5月6日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们提出了一个协议，以产生证明性的原则，二价5型腺病毒（Ad5的）载体的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6通过利用衣壳抗原掺入策略。此载体被证明表现出定性的健身，能力逃脱的Ad5阳性血清在体外 ，和抗原性以及免疫原性的结合抗原。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

腺病毒血清型5（Ad5的）已被广泛地修改传统的转基因方法，所述疫苗开发。在临床试验中，这些传统改性Ad5载体的疗效降低可能主要与相关Ad5的预存免疫性（PEI）的大多数人口中。要通过解决的Ad5 PEI的担忧推动的Ad5载体疫苗的开发，创新的衣壳抗原掺入战略已经就业。通过这一战略的优点，的Ad5向量，我们首先构建了六邻体穿梭质粒HVR1-KWAS-HVR5-他6 / pH5S通过亚克隆高变区（HVR）1六邻体成以前构建穿梭质粒HVR5-他6 / pH5S，其中有他的6标签纳入HVR5。合成这种含有HIV抗原决定簇ELDKWAS HVR1 DNA片段。 HVR1-KWAS-HVR5-他6 / pH5S然后线性化和共转化用线性骨架质粒PAD5 /ΔH5（GL），用于同源重组。此重组质粒PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6转染到细胞中，以产生病毒载体的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6。这个载体被验证，以具有通过病毒物理滴度（VP / ml）的指示的定性健身，感染滴度（IP / ml）和相应的VP / IP的比率。两者的HIV抗原决定簇和His 6标签进行表面暴露在Ad5的衣壳，并保留其自己的表位特异性的抗原性。一中和试验表明该向量价由Ad5的阳性血清体外规避中和能力。免疫的小鼠表现出强劲的体液免疫特定的生成艾滋病毒抗原表位和他的6。证明型原理这项研究表明，与衣壳抗原掺入战略相关联的协议，可以切实通过改变不同的衣壳蛋白用于中的Ad5载体疫苗的产生。这个协议甚至可以为further修改为稀土血清型腺病毒载体疫苗的产生。

引言

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人腺病毒（AD）是一种中型，无包膜病毒含有双链DNA基因组的二十面体衣壳。广告属于腺病毒家族，与分类分为七组（A至G）。每个组都包含不同的血清型病毒。其中，腺病毒血清型5（Ad5的）从C组一直是最广泛研究和应用最广泛的用于矢量化方法，如基因治疗和疫苗接种。

传统的转基因策略已经被开发并应用于Ad5的修改，它的特点是由该病毒早期基因与基因的感兴趣的位移，并在宿主中的感兴趣基因的聚焦表达。例子是pENV9 /Ad5hrΔE3通过与猴免疫缺陷病毒1转基因替换早期基因3（E3）的建设，AdCMVGag通过与人类免疫缺陷的gag基因替换早期基因1（E1）的建设病毒（HIV）2，和广告LAC的Z用紫胶 ž基因3 E1更换施工。对Ad5的传统的转基因战略的广泛应用取决于以下优点:广泛用于Ad5的，对病毒和病毒传播的可行的基因工程，外源基因插入大量的住宿和4,5的Ad5的安全主机。然而，的Ad5向量临床治疗通过使用这种策略的功效降低一直是主要瓶颈，已经映射到主要与Ad5的PEI有关，因为Ad5的是广大儿童和成人4,6中如此普遍。

为了克服的Ad5的主要瓶颈，首要目标是开发一种替代策略规避的Ad5 PEI。先天免疫7，适应性免疫诸如中和抗体（NAb的）8-10和CD8 + T细胞应答10对Ad5的已示出的共同ntribute与Ad5 PEI，与Ad5的出现的NAb发挥贡献的主导作用与Ad5 PEI 10,11。此外，Ad5的NABS位于衣壳蛋白靶表位，包括主要的蛋白质六邻体，纤维和五邻体基底。其中，六邻体是的Ad5的NAbs 8,11-13的主要对象。基于这些发现，一个创新的衣壳抗原掺入战略已经出台。这种新颖的策略突出蛋白的感兴趣上的Ad5衣壳蛋白，其移位或屏蔽的Ad5中和表位的置换或掺入，导致降低识别由所述的NAb高效Ad5载体给药。值得注意的是，这一战略是有竞争力的，因为它也可以帮助主机引起强大的体液免疫和有效的细胞免疫功能通过直接抗原呈递的感兴趣的免疫系统4,14,15。基于这一战略，分子克隆和重组广告病毒载体抢救可分为结构分为四个主要步骤:（a）由任一聚合酶链式反应（PCR）或合成制备的基因的感兴趣的片段; （b）基因片段的连接到包含基因的感兴趣的片段和同源臂到腺病毒主链的穿梭质粒; （c）该同源重组通过共转化含基因的感兴趣的片段与线性化骨架质粒PAD5 /ΔH5（GL）16穿梭质粒; （四）线性化重组腺病毒质粒的转染营救与抗原的感兴趣并入重组Ad载体。

我们的团队和其他一些人已经扩展这种替代广告纳入战略针对不同传染病病原体广告载体疫苗的开发。我们报道了重组腺病毒载体的新一代广告-HVR1-LGS-他6 -V3通过将他标记的HIV-1抗原V3成的Ad5六邻体（hexon5）的HVR1区域。这个生成的载体引发STR具体到V3表位4翁体液免疫应答。我们还报道的Ad5 / HVR2-MPER-L15ΔE1的发展通过将HIV-1的近膜胞外区（MPER）到hexon5 2的HVR2区域。此外，周博士的研究小组已经使用这种广告策略结合的优势，开发广告3型（Ad3的）载体疫苗， 即 ，病毒载体R1SP70A3的通过将肠道病毒71型的中和表位SP70到Ad3的的HVR1的一代六邻体（hexon3）。 R1SP70A3产生了浓厚的NAbs和IFN-γ生产特定的抗原表位SP70，从而导致对肠病毒71型的挑战15率高保护。

对于技术参考的目的，我们的研究采取了定性衣壳抗原掺入战略的优势，专注于二价Ad5载体的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6的产生通过将一种HIV-1抗原进入HVR1一个DA他的标签为hexon5的HVR5。生成的病毒载体也被免疫评价。该衣壳抗原掺入策略可以被用来实现对不同传染病的Ad5疫苗向量方法的制定。

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方案

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阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物使用及护理委员会批准使用小鼠作为下批准的协议号101109272描述。

1.遗传结构改良质粒PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6与衣壳抗原掺入战略

  1. 穿梭质粒的构建HVR1-KWAS-HVR5-他6 / pH5S
    1. 交货含有合成的DNA序列HVR1-KWAS的限制酶位点AGEI之间hexon5基因的AccI质粒。
    2. 消化6微克的合成片段（HVR1-KWAS）与酶AGEI（6单位）和的AccI（6单位）3小时，在37℃。解决在通过电泳在2％琼脂糖凝胶的消化片段，并根据制造商的方案用DNA凝胶提取试剂盒纯化该片段。
    3. 根据插入的摩尔比为矢量在3:1，用T4 DNA连接酶和连接酶buffer结扎12纳克的片段（HVR1-KWAS）到100纳克先前构建的穿梭质粒的HVR5-他在一个10微升体积于室温2小时6 / pH5S 17，经由AGEI和AccI位的位点。
    4. 变换1μl的总分10微升连接产物向50微升电感受态的DH5α细胞在电穿孔（在1800Ⅴ）。添加950微升SOC培养基，以转化DH5α细胞，并培育1小时，混合物在37℃下，以300转。传播100-200微升含有卡那霉素的卢里亚BERTANI（LB）琼脂1ml的混合物和孵化O / N在37℃。
      1. 筛选〜10个菌落通过PCR靶向片段HVR1-KWAS，混合的正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT），反向引物（GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC）和单个DH5α菌落成PCR主混合物溶液（根据制造商的协议）。通过参照设置有PCR主混合物溶液手动运行在热循环样本。
      2. 使用正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）的测序片段HVR1-KWAS中筛选部分1.1.4.1克隆。
  2. 质粒PAD5 /构建H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6
    1. 消化6微克HVR1-KWAS-HVR5-他6 / pH5S用酶EcoRI位（6单位）和PmeI位（6单位）3小时，在37℃，并净化含有同源重组臂和双改性hexon5基因的片段，如在步骤1.1.2说明。线性化骨架质粒PAD5 /ΔH5（GL）16用SwaI。
    2. 共转化100纳克从穿梭质粒的目的片段和100毫微克的线性PAD5 /ΔH5（GL）骨干到50微升电感受态细胞BJ5183为在电穿孔的同源重组（1800 V）。添加950微升SOC培养基，以转化细胞，并培育1小时，混合物在37℃，300转。传播100 - 200微升1ml的混合物在含卡那霉素（终50微克/毫升）对O / N培养在37℃的LB琼脂。
      1. 挑〜10微小菌落于3ml含有卡那霉素（最终50微克/毫升）对O / N培养在摇动器（250转，37℃）的液体LB。提取从培养质粒。使用PCR分析通过靶向片段HVR1-KWAS筛选的10个菌落，如图步骤1.1.4.1。
      2. 筛选通过靶向骨干基因组的的pIX片段PCR分析相同的菌落，混合的正向引物（AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT），反向引物（CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT）和单个BJ5183菌落成PCR主混合物溶液（根据制造商的协议）。通过参照设置有PCR主混合物溶液手动运行样品上的热循环。
      3. 指定PCR双阳性菌落作为PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6。
    3. 改造100毫微克质粒PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6中如图步骤1.1.4至DH5α细胞。
      1. 使用PCR分析来筛选〜10个菌落通过靶向片段HVR1-KWAS，如图步骤1.1.4.1。
      2. 使用PCR分析通过靶向骨干基因组的pIX片段来筛选相同的菌落，如图步骤1.2.2.2。
      3. 使用正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）的测序片段HVR1-KWAS在PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6。

2:改性Ad5的病毒载体的Ad5 / H5的-HVR1-KWAS-HVR5-他6

  1. 通过添加FBS（最后10％），100X非必需氨基酸（最终0.1mM的），200mM的L-谷氨酰胺（最终为2mM）和青霉素/链霉素溶液（最终1％）到DMEM高糖构成的完全培养基。保持人胚肾（HEK293）细胞在完全培养基中培养培养箱中（37℃和5％CO 2下85％湿度条件下）。
  2. 病毒已经救援构造函数的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6
    1. 种子3.0×10 6的HEK293细胞在含有5ml完全培养基，并培养O / N中的一个的T-25烧瓶中，以达到与80％汇合的单层。
    2. 线性15微克的PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6在100微升体积用限制性酶PacI位（15个单位），在37℃3小时。
      1. 提取线性PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6通过离心反应两次（10,000 xg离心1分钟）苯酚等体积的氯仿:异戊醇（比在25:24:1）在通风橱，并通过连续离心分离（10,000×g离心10分钟）的混合溶液（300微升的100％乙醇和10μl的乙酸钠）和700微升70％乙醇。弃上清在每个离心步骤。
    3. 重悬纯化的质粒在〜40微升蒸馏水或的Tris-EDTA（TE）缓冲液。通过测量光学德定量质粒DNAnsity（OD）在260nm处。
    4. 染3微克线性化的质粒与在T-25烧瓶商用脂质体转染试剂，根据制造商的手册。在6小时后转染和随后的孵化，在孵化器的文化与变化完全培养基转染培养基。通过替换完全培养基每两至三天，直到单个病毒噬斑形式维持转染的细胞。
    5. 当斑块发展到充分的细胞致病效应（CPE），刮去烧瓶中剩余的细胞在无菌罩，并收获细胞裂解物在4℃下离心分离介质，在300×g离心10分钟。暂停〜1ml含有2％FBS的培养基中的细胞沉淀，并通过冻融四次破细胞。收集含在4℃下离心裂解物以10,000rpm离心10分钟后获救病毒上清。
  3. 该病毒载体的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6大规模传播
    1. 第传播病毒在一个T-75烧瓶中含有HEK293细胞在无菌罩通过用1/3感染到从T-25烧瓶中充分溶胞产物。允许完全CPE在培养培养箱内两到三天开发。收获裂解物上清液作为在步骤2.2.5说明。
    2. 通过用1/2感染完整裂解物从T-75烧瓶中，根据不同的病毒传播条件传播在一到三颗T-175烧瓶中无菌罩病毒。允许完全CPE在培养培养箱内两到三天开发。收获裂解物上清液作为在步骤2.2.5说明。
    3. 通过与感染的1/2，从以前的T-175瓶（S）全裂解液传播病毒在一打以上的T-175瓶的无菌罩。确定基于所述病毒传播条件和病毒的有需要的量烧瓶使用量。收获上清裂解当全CPE发生在两到三天的培养孵化器在步骤2.2.5规定。
  4. PURIF中的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6氯化铯ication
    1. 准备两个密度在5毫米的HEPES的CsCl溶液的:1.33克/毫升1.45克/毫升，而避免了与氯化铯接触。
    2. 负载4毫升氯化铯（1.33微克/毫升）在无菌超速离心管，并轻轻装入4毫升氯化铯（1.45微克/毫升）对所述管的底部。负载4毫升裂解上清液慢慢在无菌罩梯度的顶部。
    3. 离心管中，在110000×g离心3小时，在4℃至成熟/低病毒带从有缺陷的/更高的病毒带分开。使用3毫升注射器手持33克针收集低频段和5毫米的HEPES稀释乐队4ml的体积在无菌罩。
    4. 载入另一个管的CsCl溶液的两种密度和病毒的稀释频带如步骤2.4.2中描述。离心管中，在11万XG O / N在4℃。如步骤2.4.3所述收集病毒带。
    5. 注入的dialys收集病毒解决方案是由卡带3毫升注射器手持33克针在无菌罩。
    6. 放置700毫升的1×透析缓冲液的盒（1L配方:100毫升10×PBS中，加入100毫升100％甘油和800毫升蒸馏水;过滤通过0.22微米的过滤器的缓冲器），并更换透析缓冲液，每3小时进行4次。使用针刺注射器吸出透析病毒解决方案。

3.验证获救病毒载体

  1. 病毒载体滴定
    1. 为病毒物理滴度，稀既病毒和透析缓冲液（背景对照）在1:10和1:20中病毒的裂解缓冲液（10％SDS在Tris-EDTA）中在小管，并孵育所有试管在56℃下为10分钟。
    2. 打开一个BioPhotometer生物分光光度计和设置的吸在OD 260nm的模式。使用稀释透析缓冲液（1:10）通过点击"空白"底部，以平衡背景信号。在BioPhotometer生物分光光度计SCR型"10 + 90"EEN，并读取稀释病毒的（1:10）的信号。
    3. 读的稀释的病毒（1:20）的信号通过以下步骤3.1.2所述的方法，而是在BioPhotometer生物分光光度计屏幕输入"5 + 95"。由1.1×10 12乘两个病毒读出的数字和计算平均滴度用单元为VP /毫升，基于从两个稀释两个单独滴度。
    4. 对于病毒感染滴度（IP / ml）的，使用寇氏统计TCID 50方法14，以确定在后10天感染对HEK293细胞的感染深度（dpi）的
  2. 抗原曝光显示评价的病毒载体
    1. 大衣的病毒载体在ELISA板并继续在标准ELISA法14的其余步骤。使用人抗gp41的（2F5）单克隆抗体（mAb）和小鼠抗His标签单抗对应掺入的抗原14的检测。
    2. 解决病毒载体在denatu红蛋白凝胶电泳（SDS-PAGE），并着手步骤一个标准的免疫印迹法14休息。使用人抗gp41的（2F5）单克隆抗体（mAb）和小鼠抗His标签单抗对应掺入的抗原14的检测。
  3. 在载体上绕过的Ad5-positve血清的能力体外评价
    1. 保持在培养培养箱中（37℃和5％CO 2条件下85％湿度条件下）的HeLa细胞在完全培养基中。构成通过添加FBS（最后10％），200 2mM L-谷氨酰胺（最终为2mM）和青霉素/链霉素溶液（终1％）到最低必需培养基Eagle（MEME）的完全培养基。
    2. 种子HeLa细胞在6孔板以1×10 6个细胞/孔，并孵育在培养培养箱中（37℃和5％CO 2条件下85％湿度条件下）的板2小时。孵育的Ad5阳性血清（0.1微升或0微升）与病毒载体的5 IP /单元（的Ad5或的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6）在培养培养箱1小时之前加入的混合物在含有细胞的6孔平板上。
    3. 在24小时后感染（HPI），在0.5ml裂解缓冲液一次用PBS裂解细胞冲洗细胞。离心以15,000×g离心5分钟，并收集上清。混合20微升用100μl的荧光素酶信号读取荧光素酶底物的上清液中，由于病毒含有荧光素酶基因。

抢救性病毒载体免疫4.评价

  1. 准备两个免疫组的Ad5和的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6。
    1. 注入小鼠（n = 8 /组）肌内病毒以1×10 10 VP /小鼠，在一个同源"初免-加强"免疫方案，以2周的间隔。
    2. 在2周后每注射，小鼠流血无需麻醉由颊带刺血针的动物（5毫摩尖长）出血在1.5ml管中采集血液。
  2. 混合血液在管通过颠倒上下，孵育血液在RT下30分钟。旋管以10,000×g离心5分钟，在4℃和转让血清（顶​​层）至新的1.5 ml微量离心管。
    1. 旋新试管以10,000×g离心5分钟，在4℃和转让血清到新标记的1.5毫升管存储在-80℃。
  3. 由血清基于ELISA法评价的抗原特异性体液免疫
    1. 他的稀释肽（现货1毫米）和HIV-1肽（股票在1毫米）分别在100。
    2. 0mM碳酸盐缓冲液（pH 9.5）中，以实现肽包被浓度为10μM。涂覆ELISA板与稀释的肽分别加入每孔100μl，并培养该板O / N在4℃。
    3. 洗用PBST将板四次以200μl/孔和块1小时在PBST中的5％BSA封闭。适用的小鼠的血清在板1:在阻断的buf 100稀释FER，100μl/孔。孵育2小时在室温下孵育。
    4. 洗用PBST将板四次。通过在RT中以100μl的封闭缓冲液温育30分钟/孔阻断板。
    5. 以100μl/孔到两个涂覆有他的肽和HIV-1肽单独的板:（5000在封闭缓冲液1）应用的山羊抗小鼠IgG-HRP。孵育2小时，在室温。用PBST洗平板。
    6. 读取平板在OD450 nm的HRP底物温育30分钟后。

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结果

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所述抗原衣壳-团策略（ 图1A）被用于生成二价的Ad5病毒载体的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6。首先，穿梭质粒HVR1-KWAS-HVR5-他6 / pH5S被亚克隆HVR1-KWAS片段插入先前构建穿梭质粒HVR5-他6/17 pH5S构建。其次，质粒PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6月 14日通过"的EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-的His6-PmeI位"的片段与SwaI位线性化PAD5 /ΔH5之间的同源重组构建（GL ）16（ 图1B）。有PacI染消化PAD5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他在T-25烧瓶中引到病毒载体的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6 14的救援6。获救病毒载体，然后传播在大规模并通过CsCl梯度超速离心两个周期纯化。

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讨论

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上的Ad5修改为疫苗的发展传统的转基因策略的应用已经被降低主要是由于与Ad5的PEI 4,6相关联的瓶颈。这个瓶颈可以通过应用替代抗原衣壳-团策略（ 图1A）被部分地减小，因为这种策略可以通过的Ad5的NAb逃避中和通过与抗原的感兴趣取代的Ad5的中和表位，以及促进健壮免疫力的产生到结合抗原的感兴趣。在这项研究中，修改后的二价病毒载体的产生的Ad5 / H5-HVR1-KWAS-HVR5-他6是作为一个概念上的例子（ 图1B）。对应于该协议第1.1.1节，在有序质粒合成片段包含在hexon5的HVR1区域的HIV-1 gp41的短基因替换。部分的gp41基因编码的表位ELDKWAS，其取代从氨基酸139至hexon5 14的144部分HVR1。 ELDKWAS是HIV-1 gp41的19强效中和表位。

在克隆，有两个关键步骤。合成基因片段权益的协议1.1.1节时，一个步骤是两个限制性内切酶的选择。两种酶的选择条件取决于广告衣壳的...

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披露

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作者什么都没有透露。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

卫生部授予5T32AI7493-20和5R01AI089337-03部分这项工作是支持国家机构。该资助者在研究设计，数据收集和分析，发布决定，或准备的手稿没有作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01用于细胞分液 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02用于透析缓冲液制备
甘油SIGMAG5516-1L用于透析缓冲液制备
SDSBIO-RAD161-0301用于病毒裂解缓冲液制备
胎牛血清 （FBS）Thermo ScientificSH30910.03培养基成分
100x 非必需氨基酸 Thermo ScientificSH30238.01培养基成分
200 mM L-谷氨酰胺Cellgro25-005-CI培养基
青霉素/链霉素溶液的成分 Cellgro30-002-CI培养基成分
含高葡萄糖的 DMEMScientificSH30081.01用于 HEK293 细胞培养
最低必需培养基 EagleSIGMAM5650用于 HeLa 细胞培养
苯酚：氯仿：异戊醇 SIGMAP3803-100ML用于大尺寸 DNA 氯化铯纯化
 研究产品国际公司C68050用于病毒纯化
HEPESCellgro25-060-CI用于 CsCl 溶液制备
HEK293ATCC51-0036用于病毒拯救和高档
HeLaATCCCCL-2用于中和测定
T-25 培养瓶Thermo Scientific156367细胞培养 
T-75 培养瓶CORNING430641 
Thermo Scientific159910T-175 培养瓶 
病毒纯化的超速离心BECKMANNA
病毒纯化超速离心管BECKMAN344059
盒 Thermo Scientific66380用于病毒透析
ELISA 板Thermo Scientific442404用于 ELISA
人抗 gp41 （2F5） mAbNIH AIDS 试剂计划1475用于免疫学检测
小鼠抗 His 标签 mAb金斯瑞A00186用于免疫学检测
SOC 培养基CORNING46-003-CR
PCR 预混液QIAGEN201445用于 PCR
动物采血针（点长为 5 mm）MEDIpoint，用于小鼠出血 
病毒物理滴度滴定Eppendorf生物光度计
Thermo ， 用于用于细胞培养的 用于细胞培养的 用于机 用于的 透析 用于转化的 用于的

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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