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方法文章

利用抗原衣壳整合策略开发腺病毒5型载体疫苗方法

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DOI：

10.3791/52655

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2015年5月6日

 ,  ,  , 
1Department of Medicine, University of Alabama at Birmingham, 2Center for AIDS Research, University of Alabama at Birmingham

本文内容

摘要

在此，我们介绍一种用于构建原理验证型二价腺病毒5型（Ad5）载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的实验方案。6 通过利用抗原衣壳整合策略，该载体被证明具有良好的适应性，并能够逃逸Ad5阳性血清的中和作用 体外以及所载抗原的抗原性和免疫原性。

摘要

5型腺病毒（Ad5）在疫苗开发中已通过传统转基因方法进行了广泛改造。这些传统改造的Ad5载体在临床试验中效果降低，主要与大多数人群中存在的Ad5预存免疫（PEI）相关。为解决Ad5预存免疫问题，推动Ad5载体疫苗的研发，研究人员采用了创新的抗原衣壳整合策略。基于该策略，我们首先构建了六邻体穿梭质粒HVR1-KWAS-HVR5-His6通过将六邻体蛋白（hexon）的高变区（HVR）1 克隆至先前构建的穿梭质粒 HVR5-His 中，获得 /pH5S6/pH5S，含有 His6 将带有HIV表位ELDKWAS的HVR1 DNA片段合成，并插入HVR5区域。HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S 随后被线性化，并与线性化的骨架质粒 pAd5/∆H5 (GL) 共转化，以进行同源重组。该重组质粒为 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 转染至细胞中以生成病毒载体 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6该载体通过病毒物理滴度（VP/ml）、感染性滴度（IP/ml）及相应的VP/IP比值验证了其定性适配性。HIV表位和His6 标签在Ad5衣壳表面暴露，并保持了其表位特异性的抗原性。中和实验表明，这种双价载体能够逃避Ad5阳性血清的中和作用 体外小鼠免疫结果显示，针对HIV表位和His产生了强烈的特异性体液免疫反应6这项原理验证研究表明，通过修饰不同的衣壳蛋白，与抗原衣壳整合策略相关的方案可被可行地用于制备Ad5载体疫苗。该方案甚至可进一步改进，用于制备罕见血清型腺病毒载体疫苗。

引言

人腺病毒（Ad）是一种中等大小、无包膜的病毒，具有二十面体核衣壳，内含双链DNA基因组。腺病毒属于腺病毒科（Adenoviridae），可分为七个组（A至G），每组包含不同血清型的病毒。其中，C组的人腺病毒血清型5（Ad5）是研究最深入、应用最广泛的类型，常用于基因治疗和疫苗开发等载体技术。

传统的转基因策略已开发并应用于Ad5的改造，其特点是用目的基因替换病毒的早期基因，并在宿主中实现目的基因的特异性表达。例如，通过用猴免疫缺陷病毒的rev基因替换早期基因3（E3）构建pENV9/Ad5hr∆E31，通过用人类免疫缺陷病毒（HIV）的gag基因替换早期基因1（E1）构建AdCMVGag2，以及通过用lacZ基因替换E1构建AdlacZ3。传统转基因策略在Ad5上的广泛应用依赖于以下优点：Ad5具有广泛的宿主范围、可行的病毒基因工程操作与病毒扩增能力、对外源基因插入较大的容纳能力以及良好的安全性4,5。然而，采用该策略的Ad5载体临床治疗效果有所降低，已成为主要瓶颈，这主要与Ad5的预存免疫（PEI）有关，因为Ad5在大多数儿童和成人中普遍存在4,6。

为了克服Ad5的主要瓶颈，首要目标是开发一种绕过Ad5预存免疫（PEI）的替代策略。已有研究表明，针对Ad5的先天免疫7、适应性免疫（如中和抗体（NAbs）8-10）以及CD8+ T细胞应答10均会促成Ad5的预存免疫，其中Ad5中和抗体在Ad5 PEI的形成中起主导作用10,11。此外，Ad5中和抗体所识别的表位位于衣壳蛋白上，包括主要蛋白六邻体（hexon）、纤维蛋白（fiber）和五邻体基底蛋白（penton base）。其中，六邻体是Ad5中和抗体最主要的作用靶点8,11-13。基于这些发现，已提出一种创新性的抗原衣壳整合策略。该新策略强调将目的蛋白替换或整合至Ad5衣壳蛋白中，从而改变或屏蔽Ad5的中和表位，降低中和抗体的识别能力，实现高效的Ad5载体给药。值得注意的是，该策略具有竞争优势，因为它还能通过将目的抗原直接呈递给免疫系统，帮助宿主产生强烈的体液免疫和有效的细胞免疫4,14,15。基于该策略，分子克隆与重组腺病毒载体的拯救在结构上可分为四个主要步骤：（a）通过聚合酶链式反应（PCR）或基因合成方法制备目的基因片段；（b）将目的基因片段连接至穿梭质粒，该质粒包含目的基因片段及与腺病毒骨架同源的同源臂；（c）通过将含有目的基因片段的穿梭质粒与线性化的骨架质粒pAd5/∆H5（GL）16共转化，实现同源重组；（d）转染线性化的重组腺病毒质粒，以拯救整合了目的抗原的重组Ad载体。

我们的研究团队及其他一些团队已将这种替代性腺病毒（Ad）整合策略拓展应用于针对不同传染性病原体的腺病毒载体疫苗开发。我们报道了重组腺病毒载体Ad-HVR1-lgs-His的构建6通过将带有His标签的HIV-1抗原V3插入Ad5六邻体（hexon5）的HVR1区域，构建了V3嵌合载体。该载体可诱导针对V3表位的强烈体液免疫反应。4我们还报道了通过将HIV-1膜近端外结构域区（MPER）插入六邻体5的HVR2区域，开发出Ad5/HVR2-MPER-L15∆E1。2此外，周博士的团队已利用这种腺病毒载体整合策略的优势，开发出腺病毒3型（Ad3）载体疫苗， 即将肠道病毒71型的中和性表位SP70插入Ad3六邻体蛋白（hexon3）的HVR1区域，从而构建病毒载体R1SP70A3。R1SP70A3可诱导产生针对SP70表位的强效中和抗体和特异性IFN-γ，从而在肠道病毒71型攻击实验中提供高度保护作用15.

为提供技术参考，本研究采用了定性抗原衣壳整合策略，通过将一种HIV-1抗原插入六邻体蛋白（hexon5）的HVR1区，同时将His标签插入HVR5区，重点构建了一种二价腺病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。所构建的病毒载体亦进行了免疫学评价。该抗原衣壳整合策略可用于开发针对不同传染病的Ad5载体疫苗方法。

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方案

根据批准的协议编号101109272，阿拉巴马大学伯明翰分校机构动物使用与护理委员会已批准本研究中所述小鼠的使用。

1. 采用抗原衣壳整合策略构建修饰质粒 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6

  1. 穿梭质粒 HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S 的构建
    1. 订购一个质粒，其中包含在六邻体5基因（hexon5 gene）的 AgeI 至 AccI 限制性酶切位点之间的合成 DNA 序列 HVR1-KWAS。
    2. 将 6 µg 合成片段（HVR1-KWAS）用 AgeI（6 单位）和 AccI（6 单位）酶在 37 °C 条件下消化 3 小时。通过电泳在 2% 琼脂糖凝胶中分离消化后的片段，并根据制造商说明书使用 DNA 凝胶回收试剂盒纯化该片段。
    3. 根据插入片段与载体的摩尔比为 3 : 1，使用 T4 DNA 连接酶及其缓冲液，在 10 µl 体系中于室温（RT）连接 12 ng 片段（HVR1-KWAS）至 100 ng 已构建的穿梭质粒 HVR5-His6/pH5S17 中，连接时间为 2 小时，通过 AgeI 和 AccI 位点完成连接。
    4. 取 10 µl 连接产物中的 1 µl，转入 50 µl 电转感受态 DH5α 细胞中，在电穿孔仪中（1800 V）进行转化。向转化后的 DH5α 细胞中加入 950 µl SOC 培养基，于 37 °C、300 rpm 条件下孵育 1 小时。取 1 ml 混合液中的 100–200 µl 涂布于含卡那霉素的 Luria-Bertani（LB）琼脂平板上，37 °C 过夜（O/N）培养。
      1. 通过针对 HVR1-KWAS 片段的 PCR 方法筛选约 10 个菌落：将正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）、反向引物（GGAGGCCCACTTGTCCAGCTC）和单个 DH5α 菌落加入 PCR 预混液中（按制造商说明书配制）。参照 PCR 预混液提供的手册，在热循环仪上运行样品。
      2. 使用正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）对 1.1.4.1 节中筛选出的克隆进行 HVR1-KWAS 片段的测序。
  2. 质粒 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 的构建
    1. 将 6 µg HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S 质粒用 EcoRI（6 单位）和 PmeI（6 单位）酶在 37 °C 条件下消化 3 小时，并如步骤 1.1.2 所述纯化含有同源重组臂及双修饰六邻体5基因的片段。用 SwaI 酶线性化骨架质粒 pAd5/∆H5（GL）16。
    2. 将来自穿梭质粒的 100 ng 目标片段与 100 ng 线性化的 pAd5/∆H5（GL）骨架质粒共转化至 50 µl 电转感受态 BJ5183 细胞中，在电穿孔仪中（1800 V）进行同源重组。向转化后的细胞中加入 950 µl SOC 培养基，于 37 °C、300 rpm 条件下孵育 1 小时。取 1 ml 混合液中的 100–200 µl 涂布于含卡那霉素（终浓度 50 µg/ml）的 LB 琼脂平板上，37 °C 过夜培养。
      1. 挑取约 10 个微小菌落接种至含卡那霉素（终浓度 50 µg/ml）的 3 ml 液体 LB 培养基中，在摇床（250 rpm，37 °C）中过夜培养。从培养物中提取质粒。使用 PCR 分析针对 HVR1-KWAS 片段筛选这 10 个菌落，方法如步骤 1.1.4.1 所示。
      2. 使用 PCR 分析针对骨架基因组的 pIX 片段对相同菌落进行筛选：将正向引物（AGCTGTTGGATCTGCGCCAGCAGGTT）、反向引物（CCAAACAGAGTCTGGTTTTTTATTTAT）和单个 BJ5183 菌落加入 PCR 预混液中（按制造商说明书配制）。参照 PCR 预混液提供的手册，在热循环仪上运行样品。
      3. 将 PCR 双阳性菌落命名为 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。
    3. 将 100 ng 质粒 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 转化至 DH5α 细胞中，操作如步骤 1.1.4 所示。
      1. 使用 PCR 分析针对 HVR1-KWAS 片段筛选约 10 个菌落，方法如步骤 1.1.4.1 所示。
      2. 使用 PCR 分析针对骨架基因组的 pIX 片段对相同菌落进行筛选，方法如步骤 1.2.2.2 所示。
      3. 使用正向引物（TATGTGTGTCATGTATGCGT）对 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 中的 HVR1-KWAS 片段进行测序。

2. 修饰型 Ad5 病毒载体 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 的制备

  1. 通过向高糖DMEM中添加胎牛血清（FBS，终浓度10%）、100倍非必需氨基酸溶液（终浓度0.1 mM）、200 mM L-谷氨酰胺（终浓度2 mM）和青霉素/链霉素溶液（终浓度1%），配制完全培养基。在培养箱（37 °C，5% CO₂，85%湿度）中，用完全培养基培养人胚胎肾（HEK293）细胞。
  2. 病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His的拯救6
    1. 种子 3.0 × 106 在含5 ml完全培养基的一个T-25培养瓶中接种HEK293细胞，过夜培养至形成汇合度为80%的单层细胞。
    2. 线性化15 µg的pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 在100 µl体系中，加入限制性内切酶PacI（15单位），37 °C反应3小时。
      1. 提取线性化的 pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6 在通风橱中，先加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（25 : 24 : 1），离心两次（10,000 × g，1 min）；随后依次加入混合液（300 µl 100%乙醇和10 µl乙酸钠）离心（10,000 × g，10 min），再加入700 µl 70%乙醇离心（10,000 × g，10 min）。每次离心后弃去上清液。
    3. 将纯化的质粒重悬于约 40 µl 的蒸馏水或 Tris-EDTA（TE）缓冲液中。通过测量 260 nm 处的光密度（OD）来定量质粒 DNA。
    4. 在T-25培养瓶中，按照生产商说明书，使用商用脂质体转染试剂转染3 µg线性化质粒。转染后6小时，更换为完全培养基，并继续在培养箱中孵育。每两至三天更换一次完全培养基，维持转染细胞培养，直至形成单个病毒蚀斑。
    5. 当噬斑出现完全的细胞病变效应（CPE）时，在无菌操作台中将剩余细胞从培养瓶上刮下，通过在4 °C下以300 × g离心10分钟收集细胞裂解液。将细胞沉淀重悬于约1 ml含2% FBS的培养基中，反复冻融四次以裂解细胞。在4 °C下以10,000 × g离心10分钟，收集上清液，其中含有拯救出的病毒。
  3. 大规模扩增病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6
    1. 在生物安全柜中，用T-25培养瓶的1/3至全部裂解物感染含有HEK293细胞的T-75培养瓶以扩增病毒。将培养物置于细胞培养箱中孵育2至3天，直至完全出现细胞病变效应（CPE）。按步骤2.2.5所述方法收集裂解物上清液。
    2. 在生物安全柜中，根据病毒增殖条件，使用T-75培养瓶的1/2至全量裂解物感染一至三个T-175培养瓶以扩增病毒。在培养箱中培养两至三天，直至完全细胞病变效应（CPE）出现。按照步骤2.2.5所述方法收集裂解物上清液。
    3. 在无菌操作台中，使用前一批T-175培养瓶的½至全量裂解液感染一打或更多T-175培养瓶以扩增病毒。根据病毒扩增条件及所需病毒量确定培养瓶使用数量。当培养箱中培养物在两至三天内出现完全细胞病变效应（CPE）时，按照步骤2.2.5所述收集裂解上清液。
  4. Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His 纯化6 通过氯化铯
    1. 在5 mM HEPES中配制两种密度的CsCl溶液：1.33 g/ml和1.45 g/ml，配制过程中避免接触CsCl。
    2. 在无菌超速离心管中加入4 ml CsCl（1.33 g/ml），然后轻轻沿管底加入4 ml CsCl（1.45 g/ml）。在无菌操作台中，将4 ml裂解液上清缓慢加于梯度液上方。
    3. 在4 °C条件下，以110,000 × g离心3小时，使成熟病毒（下层病毒带）与缺陷病毒（上层病毒带）分离。使用装有33 G针头的3 ml注射器收集下层病毒带，并在无菌操作台中用5 mM HEPES稀释至终体积4 ml。
    4. 另取一根离心管，按步骤2.4.2所述加入两种密度的CsCl溶液及稀释后的病毒条带。在4 °C条件下，以110,000 x g离心过夜。按步骤2.4.3所述收集病毒条带。
    5. 在超净工作台中，使用装有33 G针头的3 ml注射器将收集的病毒溶液注入透析盒中。
    6. 将胶盒置于700 ml 1×透析缓冲液中（1 L 配方：100 ml 10倍浓缩 PBS、100 ml 100% 甘油和 800 ml 蒸馏水；用 0.22 µm 滤膜过滤缓冲液，每 3 小时更换透析缓冲液一次，共更换 4 次。使用带针头的注射器吸出透析后的病毒溶液。

3. 拯救病毒载体的验证

  1. 病毒载体滴定
    1. 对于病毒物理滴度，将病毒和透析缓冲液（背景对照）分别用病毒裂解缓冲液（Tris-EDTA 中含 10% SDS）按 1 : 10 和 1 : 20 稀释至小管中，并将所有管在 56 °C 下孵育 10 分钟。
    2. 打开生物分光光度计，将吸光度模式设置为 OD 260 nm。使用稀释后的透析缓冲液（1 : 10）点击“空白”按钮以平衡背景信号。在生物分光光度计屏幕上输入"10 + 90"，然后读取稀释病毒（1 : 10）的信号。
    3. 按照步骤 3.1.2 的方法读取稀释病毒（1 : 20）的信号，但在生物分光光度计屏幕上输入"5 + 95"。将两次病毒读数乘以 1.1×1012，并根据两个稀释度所得的独立滴度计算平均滴度，单位为 VP/ml。
    4. 对于病毒感染性滴度（IP/ml），采用 KARBER 统计学 TCID50 方法14 测定感染后 10 天（d.p.i.）HEK293 细胞上的感染程度。
  2. 评估病毒载体表面抗原暴露情况
    1. 将病毒载体包被于 ELISA 板中，并按照标准 ELISA 方法14 进行后续步骤。使用人源抗 gp41（2F5）单克隆抗体（mAb）和鼠源抗 His 标签单克隆抗体（mAb）检测相应整合的抗原14。
    2. 通过变性蛋白凝胶电泳（SDS-PAGE）分离病毒载体，并按照标准 Western 印迹方法14 进行后续步骤。使用人源抗 gp41（2F5）单克隆抗体（mAb）和鼠源抗 His 标签单克隆抗体（mAb）检测相应整合的抗原14。
  3. 体外 评估载体逃避 Ad5 阳性血清的能力
    1. 在培养箱（37 °C、5% CO2、85% 湿度条件）中，使用完全培养基培养 HeLa 细胞。通过向 Eagle 最低必需培养基（MEME）中添加 FBS（终浓度 10%）、200 mM L-谷氨酰胺（终浓度 2 mM）和青霉素/链霉素溶液（终浓度 1%）配制完全培养基。
    2. 以每孔 1×106 个细胞的密度将 HeLa 细胞接种至 6 孔板中，在培养箱（37 °C、5% CO2、85% 湿度条件）中孵育 2 小时。在加入含细胞的 6 孔板前，先将 Ad5 阳性血清（0.1 µl 或 0 µl）与每细胞 5 IP 的病毒载体（Ad5 或 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6）在培养箱中孵育 1 小时。
    3. 感染后 24 小时（h.p.i.），用 PBS 洗涤细胞一次，加入 0.5 ml 裂解缓冲液裂解细胞。以 15,000 × g 离心 5 分钟，收集上清液。由于病毒含有荧光素酶基因，取 20 µl 上清液与 100 µl 荧光素酶底物混合，用于检测荧光素酶信号。

4. 拯救病毒载体的免疫学评估

  1. 准备两个免疫组：Ad5 和 Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。
    1. 以同源“初免-加强”免疫程序，对小鼠（每组 n = 8）进行肌肉注射，每只小鼠接种剂量为 1×1010 VP，两次免疫间隔 2 周。
    2. 每次注射后 2 周，使用动物采血针（针尖长度 5 mm）通过脸颊采血法在无麻醉状态下采集小鼠血液，收集至 1.5 ml 离心管中。
  2. 将采集的血液在离心管中上下颠倒混匀，室温孵育 30 分钟。在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟，吸取上层血清转移至新的 1.5 ml 离心管中。
    1. 将新离心管在 4 °C 条件下以 10,000 × g 离心 5 分钟，再次转移血清至新标记的 1.5 ml 离心管中，于 -80 °C 保存。
  3. 通过基于血清的 ELISA 评估抗原特异性体液免疫反应
    1. 分别将 His 肽段（储存浓度 1 mM）和 HIV-1 肽段（储存浓度 1 mM）用 100 mM 碳酸盐缓冲液（pH 9.5）稀释，使包被浓度达到 10 µM。
    2. 向 ELISA 板每孔加入 100 µl 稀释后的肽段溶液，4 °C 过夜孵育以完成包被。
    3. 用 PBST 每孔 200 µl 洗涤 4 次，加入含 5% BSA 的 PBST 封闭液封闭 1 小时。将小鼠血清用封闭液按 1:100 稀释，每孔加入 100 µl，室温孵育 2 小时。
    4. 用 PBST 每孔 200 µl 洗涤 4 次。每孔加入 100 µl 封闭液，室温孵育 30 分钟进行再封闭 。
    5. 将辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠 IgG 抗体（用封闭液按 1:5000 稀释）分别加入至包被 His 肽段和 HIV-1 肽段的 ELISA 板中，每孔 100 µl，室温孵育 2 小时，随后用 PBST 洗涤。
    6. 加入 HRP 底物孵育 30 分钟后，在 OD450 nm 波长下读取吸光度值。

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结果

抗原衣壳整合策略（图1A）被用于构建二价Ad5病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6。首先，通过将HVR1-KWAS片段亚克隆至先前构建的穿梭质粒HVR5-His6/pH5S17中，构建穿梭质粒HVR1-KWAS-HVR5-His6/pH5S。其次，通过“EcoRI-HVR1-KWAS-HVR5-His6-PmeI”片段与SwaI线性化的pAd5/∆H5 (GL)16之间的同源重组，构建质粒pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His614（图1B）。将PacI酶切的pAd5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6转染至T-25培养瓶中，从而获得病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His614。随后，对该拯救出的病毒载体进行大规模扩增，并通过两次CsCl梯度超速离心进行纯化。

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讨论

传统的转基因策略在Ad5修饰用于疫苗开发方面的应用已显著减少，主要原因是Ad5的PEI存在瓶颈4,6。这一瓶颈可通过采用替代性的抗原衣壳整合策略在一定程度上缓解（图1A），因为该策略可通过用目标抗原替换Ad5的中和表位，从而逃逸Ad5中和抗体（NAbs）的中和作用，并促进对整合的目标抗原产生强效免疫应答。本研究中，构建修饰型二价病毒载体Ad5/H5-HVR1-KWAS-HVR5-His6被作为概念性示例予以介绍（图1B）。对应于方案第1.1.1节，订购质粒中合成的片段包含在六邻体5（hexon5）HVR1区域插入的HIV-1 gp41短基因片段。该部分gp41基因编码一个表位ELDKWAS，取代了hexon5氨基酸139至144位的部分HVR1序列14。ELDKWAS是HIV-1 gp41中的一个强效中和表位19。

在克隆过程中有两个关键步骤。其中一个步骤是在方案第1.1.1节中合成目的基因片段时选择两种限制性内切酶。这两种酶的...

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披露

作者无任何利益冲突披露。

致谢

本研究部分由美国国立卫生研究院资助，项目编号为 5T32AI7493-20 和 5R01AI089337-03。资助方在研究设计、数据收集与分析、发表决定或稿件撰写过程中均未发挥任何作用。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
1x DPBSThermo ScientificSH30256.01用于细胞传代 
10x DPBSThermo ScientificSH30378.02用于透析缓冲液配制
甘油SIGMAG5516-1L用于透析缓冲液配制
SDSBIO-RAD161-0301用于病毒裂解缓冲液配制
胎牛血清（FBS）Thermo ScientificSH30910.03培养基组分
100x 非必需氨基酸 Thermo ScientificSH30238.01培养基组分
200 mM L-谷氨酰胺Cellgro25-005-CI培养基组分
青霉素/链霉素溶液 Cellgro30-002-CI培养基组分
高糖DMEMThermo ScientificSH30081.01用于HEK293细胞培养
最低必需培养基EagleSIGMAM5650用于HeLa细胞培养
苯酚:氯仿:异戊醇 SIGMAP3803-100ML用于大量DNA纯化
氯化铯 Research Products International Corp.C68050用于病毒纯化
HEPESCellgro25-060-CI用于CsCl溶液配制
HEK293ATCC51-0036用于病毒拯救与扩增
HeLaATCCCCL-2用于中和试验
T-25培养瓶Thermo Scientific156367用于细胞培养 
T-75培养瓶CORNING430641用于细胞培养 
T-175培养瓶Thermo Scientific159910用于细胞培养 
超速离心机BECKMANNA用于病毒纯化
超速离心管BECKMAN344059用于病毒纯化
透析夹 Thermo Scientific66380用于病毒透析
ELISA板Thermo Scientific442404用于ELISA
人抗gp41（2F5）单克隆抗体NIH AIDS试剂计划1475用于免疫学检测
小鼠抗His标签单克隆抗体GenScriptA00186用于免疫学检测
SOC培养基CORNING46-003-CR用于转化
PCR预混液QIAGEN201445用于PCR
动物采血针（针尖长度5 mm）MEDIpoint用于小鼠采血 
生物分光光度计Eppendorf用于病毒物理滴度测定

参考文献

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