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方法文章

研究乳腺癌细胞定植转移微环境的人类股骨组织外植体培养方法

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DOI：

10.3791/52656

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2015年3月15日

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Pediatrics, Stanford University School of Medicine, 2Department of Orthopaedic Surgery, Stanford University School of Medicine

本文内容

摘要

本文描述了在人骨组织外植体模型系统中研究乳腺癌细胞迁移、增殖和定植的实验方案。

摘要

骨是乳腺癌转移最常见的部位。尽管人们普遍认为微环境会影响癌细胞的行为，但对于乳腺癌细胞在人类骨组织天然微环境中的特性与行为仍知之甚少.我们已开发出一系列方法，用于在源自全髋关节置换术中废弃股骨头的人类骨组织碎片培养微环境中，对人乳腺癌细胞进行追踪、定量和调控。通过使用经基因工程改造、可表达荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的乳腺癌细胞，我们能够利用生物发光成像（BLI）可重复地定量分析细胞迁移与增殖模式，借助荧光显微镜追踪细胞在骨组织碎片内的相互作用，并在癌细胞定植后通过流式细胞术评估其特性。该模型的主要优势包括：1）具有包含相关人类细胞类型的天然、结构完整的组织微环境；2）可直接接触微环境，便于对乳腺癌细胞与骨细胞的特性、行为及其相互作用进行快速的定性和定量监测与干预。目前该模型的主要局限性在于组织碎片的存活时间有限，因而研究窗口局限于短期培养。该模型系统的应用包括研究乳腺癌的基本生物学特性 转移微环境中乳腺癌及其他嗜骨性恶性肿瘤的研究，以及针对骨组织中乳腺癌细胞的有效治疗策略的开发。

引言

肿瘤微环境被广泛认为是乳腺癌进展和转移过程中癌细胞行为的关键决定因素1-3本方法旨在促进在人类骨组织微环境中对乳腺癌细胞的研究，骨组织是乳腺癌转移最常见的部位。4-6骨由矿化部分和骨髓腔室组成7-9，两者均含有与转移进展相关的细胞和分泌因子10,11尽管被广泛使用 体内 小鼠模型有助于对转移过程进行系统性研究12-15，骨骼内部的细胞相互作用难以直接观察和干预。用于研究和培养小鼠骨组织及小鼠骨髓细胞的模型系统提供了更便捷的途径，已帮助揭示了乳腺癌细胞在小鼠骨骼中转移过程中细胞间串扰及其潜在机制的诸多发现。16-22然而，研究表明，不同物种可能存在特定的骨组织嗜性模式23,24这些模式可能反映了骨组织特性上固有的物种特异性差异，或免疫缺陷小鼠骨髓细胞群改变所导致的差异11以及实验中使用的小鼠相对较年轻的年龄，这些因素都可能是骨微环境的决定因素。

体外 在人骨共培养体系中研究乳腺癌细胞的方法通常集中于特定类型的骨细胞，例如骨髓来源的成骨细胞或基质细胞，这些细胞可在单层培养或工程化的三维模型系统中进行培养。25-35尽管二维细胞培养模型一直是 体外 癌症研究方法中，长期以来人们已认识到，单层培养系统会从根本上改变细胞行为18,36,37这促进了模拟三维活体组织复杂性的工程化微环境的发展，包括基于基质或支架的模型，这些模型由胶原等天然材料或合成聚合物构成，并接种特定类型的细胞以构建类似组织的微环境。36-41. 工程化方法还包括使用生物反应器平台来调控并研究微环境中激素环境18,19,41-43尽管仿生模型和生物反应器在受控条件下提供了复杂组织微环境的多种要素，并已成功应用于推动乳腺癌骨转移的研究18,19,35,42,43工程化模型系统通常未包含天然骨环境中存在的全部细胞类型和细胞外基质成分。

直到最近，人们尚未在人类骨骼组织天然、完整且三维的微环境中对乳腺癌细胞进行研究。我们近期报道了一种共培养模型的建立，该模型使用从全髋关节置换术（THR）手术标本中分离的人类骨组织碎片44。这些标本包含矿化组织和骨髓腔室，可用于在短期培养中研究微转移的潜在机制。在先前的研究中，我们已初步证实可利用生物发光成像（BLI）技术监测表达荧光素酶的乳腺癌细胞（MDA-MB-231-fLuc）在与骨碎片共培养条件下的增殖情况44。本文中，我们提供了利用人骨组织外植体在天然微环境背景下研究乳腺癌细胞增殖、定植和迁移的详细实验方案。

首先，我们介绍一种将乳腺癌细胞与骨碎片相邻共培养的方案，以通过生物发光成像（BLI）检测乳腺细胞的增殖。在该部分中，将乳腺细胞悬液以细胞点的形式接种于6孔板中，并置于用骨蜡固定住的骨碎片相邻位置。对照孔中仅含有骨蜡，不含骨碎片。待细胞点贴壁后，加入培养基并继续培养24小时，随后通过BLI测量与细胞数量相关的生物发光信号强度。接下来，我们介绍将乳腺癌细胞直接接种于骨碎片上进行共培养的方法，用于研究细胞定植与增殖。在此方法中，将乳腺细胞悬液直接滴加到骨组织碎片上，并通过BLI和荧光显微镜随时间监测，以追踪细胞定植过程及细胞数量变化。该方法允许在任意时间点冲洗骨碎片中的骨髓腔室，从而通过流式细胞术分析已定植的乳腺癌细胞，或进行骨髓活力检测。

此外，我们描述了两种不同的乳腺癌细胞迁移检测方法。第一种方法的步骤包括检测细胞向骨组织培养上清液的迁移。在该方案中，将乳腺癌细胞接种到Transwell小室膜的内侧上表面，膜孔径为8 µm（如图1A所示）。然后将小室放入接收板中，接收板的孔内含有骨组织上清液或对照培养基。在20小时的孵育过程中，少量乳腺癌细胞穿过小室膜，向下迁移至下层组织培养孔中，并附着于孔底，随后通过生物发光成像（BLI）进行检测。第二种迁移方法是将乳腺癌细胞接种到Transwell小室膜的外侧下表面。将骨组织碎片置于小室腔内，乳腺癌细胞则向上穿过膜迁移，定植于骨组织碎片上（如图1B所示），随后通过生物发光成像（BLI）进行观察。

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方案

股骨头样本采集自斯坦福大学医学院骨科手术科接受择期全髋关节置换术（THR）的患者。所有组织均按照斯坦福大学研究合规办公室的规定，以去标识化标本的形式收集。

​1. 选择乳腺癌细胞系

  1. 获取所需的乳腺癌细胞系，或使用荧光素酶-GFP报告基因构建体转染细胞系。以下实验采用经基因工程改造后稳定表达萤火虫荧光素酶（fLuc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系，其构建方法为使用Sleeping Beauty转座子质粒pKT2/LuBiG和转座酶质粒pK/hUbiC-SB11进行转染45,46。
    注：转染后的细胞系称为MDA-MB-231-fLuc-EGFP和MCF-7-fLuc-EGFP。

2. 从股骨头分离组织碎片

  1. 全髋关节置换术（THR）后，将废弃的股骨头收集至装有生理盐水的无菌容器中。在术后1–3小时内将标本转移至实验室并进行处理。注意：若处理存在延迟，应将标本置于4 °C保存。
  2. 在超净台内的吸水垫上准备操作区域，放置以下物品：无菌手套、咬骨钳、镊子、盛有70%异丙醇的烧杯（用于冲洗器械），以及根据每种实验类型规定所需的组织培养器皿。
  3. 佩戴无菌外科手套，用一只手固定圆形股骨头，另一只手持咬骨钳从暴露的股骨上段获取所需大小的松质骨碎片（约2–5 mm）。根据增殖、定植或迁移实验的类型（见步骤3、4或5），将骨碎片转移至相应的培养器皿（例如，6孔、12孔或24孔组织培养板，或迁移小室）中。
    注意：应在完成每种特定增殖、定植或迁移检测的初始步骤后，按上述方法采集骨组织碎片。骨碎片的大小范围如图2所示。为标准化目的，可在实验前后对骨碎片进行称重。

3. 通过将乳腺癌细胞与骨碎片邻近共培养，利用生物发光成像（BLI）检测乳腺细胞增殖

  1. 实验前，制备含有 2 × 105 个乳腺癌细胞/50 µl 的细胞悬液，并准备骨蜡小块用于在培养过程中固定骨组织碎片。将一支 P200 移液枪头切成三段，使用最大段的细端以“饼干切割器”的方式切取小块骨蜡（约 35 mg）。使用最小段的宽端将骨蜡小柱推出并放入培养皿中储存。
  2. 将一块骨蜡置于每个孔的12点钟位置，并用无菌手套的食指轻轻按压。
  3. 用移液器将 50 µl 含有 1 × 105 个乳腺癌细胞的细胞悬液（溶于 DMEM-10% FBS + 青霉素-链霉素）加入6孔板每个孔的中央。（也可根据需要以分散模式接种细胞。）将培养板放入 37 °C 细胞培养箱中孵育 45 分钟，以促进细胞贴壁。
  4. 为每个实验孔放置一块骨组织碎片于一块骨蜡上，并使用咬骨钳轻轻施压以固定。每个实验组设三个重复孔，即将同一全髋关节置换术（THR）标本的三块骨碎片放入上方三个孔中，而下方三个孔仅含骨蜡作为对照。
  5. 使用 5 ml 移液器，沿每个孔的孔壁缓慢、轻柔地加入 5 ml DMEM-10% FBS，避免冲散乳腺癌细胞或骨碎片。将培养板置于 37 °C 细胞培养箱中孵育 20–24 小时。
  6. 进行生物发光成像（BLI）时，从培养箱中取出培养板，向每孔加入荧光素底物（终浓度为 300 µg/ml）。立即使用 IVIS 成像系统进行成像，参数设置如下：光圈 f-stop 为 1，小 binning 模式，曝光时间为 1 秒，等级 D。以平均辐射通量（光子/秒/平方厘米/球面度）测量每孔的信号强度。
  7. 使用成像软件定义感兴趣区域（ROI），以定量所有实验组和对照组孔的平均辐射通量。将平均辐射通量数值导出至 Excel 表格，用于统计分析和图表绘制。

4. 将乳腺癌细胞直接接种于骨碎片上进行共培养以研究定植及细胞数量

  1. 使用镊子将骨碎片直接放入24孔组织培养板的空孔中（每孔1个碎片）。
  2. 用移液器吸取50 µl含有1 × 103-6个乳腺癌细胞的DMEM-10% FBS细胞悬液，直接滴加在每块骨碎片上方。将培养板置于37 °C组织培养孵育箱中孵育45分钟，以促进细胞贴附。随后沿每孔侧壁轻轻加入1–2 ml DMEM-10% FBS，使骨碎片完全浸没于培养基中。将培养板继续在37 °C组织培养孵育箱中孵育20–24小时。
  3. 孵育结束后，使用镊子将每块骨组织碎片转移至新的24孔板中，每孔预先加入1 ml DMEM-10% FBS。如需进行生物发光成像（BLI），请参照上述步骤3.6–3.7。此外，也可使用荧光显微镜观察碎片，或冲洗骨髓以获取细胞群体，用于分析乳腺癌细胞数量及特性，具体方法见步骤6。
  4. 为在BLI后通过荧光显微镜对完整骨碎片进行定性评估，用移液器向每孔加入5 µl荧光双膦酸盐标记溶液（按制造商说明书配制），以标记骨碎片中的矿化小梁。将培养板在组织培养孵育箱中再孵育24小时。
  5. 在荧光双膦酸盐标记溶液中培养24小时后，使用镊子将骨碎片转移至含有酚红-free培养基的组织培养板中，并使用配置为检测GFP（485 nm）和双膦酸盐标记（680 nm）的荧光显微镜进行观察。

5. 测定乳腺癌细胞向骨组织碎片及培养骨碎片上清液的迁移

  1. 向骨组织培养上清液的迁移。
    注意：实验需设三个重复，即使用同一例全髋关节置换术（THR）标本的3个骨组织碎片制备3份上清液。每次实验中，比较含骨组织上清液的三个孔与仅含对照培养基的三个孔之间的迁移情况。
    1. 通过将骨组织碎片放入12孔板的孔中制备骨组织上清液，每孔加入2.2 ml DMEM-10% FBS。在37 °C组织培养孵箱中培养24小时。24小时后吸出培养基，更换为2.2 ml新鲜DMEM-10% FBS。对照孔（仅含DMEM-10% FBS）以相同方式处理。
      注意：在24小时更换培养基是为了去除因手术创伤而分泌的因子。由于骨组织上清液是在含FBS的培养基中生成的，因此设置仅含FBS培养基的对照孔，以排除FBS对乳腺癌细胞迁移的贡献。
    2. 在48小时时，收集每份上清液或对照培养基0.9 ml，用移液器转移至接收板的孔中，后续将插入式小室放入这些孔中。在接种插入式小室的同时，将接收板置于组织培养孵箱中孵育。注意：剩余上清液（蒸发后约1 ml）可根据需要收集用于分泌组因子分析44。
    3. 接种Transwell插入式小室时，将其放入标准的空24孔组织培养板中。每插入式小室的上层内膜表面加入350 µl细胞悬液（含1 × 105个乳腺癌细胞，溶于DMEM-10% FBS），如图1A所示。将接种后的24孔板放入37 °C组织培养孵箱中孵育45分钟，以促进细胞贴附。
    4. 待细胞贴附后，使用镊子按照制造商说明将插入式小室转移至接收板中。将每个插入式小室以一定角度放入接收孔中，以防止插入膜与接收孔上清液之间形成气泡。将带插入式小室的接收板在37 °C组织培养孵箱中孵育20小时。
      注意：检查接收板底部，观察插入膜与接收孔上清液之间是否存在气泡。若发现气泡，应取出相应插入式小室并重新放置，直至无气泡为止。
    5. 20小时后，使用镊子将插入式小室从接收板中取出。按照步骤3.6–3.7的操作进行生物发光成像（BLI），以检测已迁移至接收板孔底部并贴附的细胞。
  2. 向骨组织碎片的迁移。
    注意：实验需设三个重复，即从同一例THR标本中取3个骨组织碎片分别放入3个独立的插入式小室中，另将3个玻璃珠分别放入3个独立的插入式小室中作为对照。
    1. 通过向接收板的每个孔中加入0.9 ml DMEM-10% FBS来准备接收板。在准备插入式小室期间，将接收板放入组织培养孵箱中。
    2. 接种插入式小室时，将其倒置在带有盖子的塑料微量离心管盒表面。将50 µl细胞悬液（含1 × 105个乳腺癌细胞，溶于DMEM-10% FBS）直接滴加到每个插入式小室膜的外侧底面（倒置时朝上）。将微量离心管盒盖子略微打开，转移至37 °C组织培养孵箱中孵育45分钟，以促进细胞贴附。
    3. 将微量离心管盒转移至组织培养超净台中，用镊子将已接种的插入式小室翻转至正位，并转移至接收板的孔中。向每个插入式小室中加入0.450 ml DMEM-10% FBS。使用镊子将一个骨组织碎片（约3 mm）转移至每个已准备好的插入式小室中。可选地，在额外孔中使用玻璃珠作为阴性对照。将板放入组织培养孵箱中孵育20小时。
    4. 为检测迁移情况，准备一个标准的24孔组织培养板，每孔加入1 ml DMEM-10% FBS。从孵箱中取出接收板，用镊子将各插入式小室中的骨组织碎片和玻璃珠分别转移至标准板的不同孔中。向每孔加入荧光素底物（终浓度为300 µg/ml），并按照步骤3.6–3.7的操作进行生物发光成像（BLI）。

6. 实验前后附加分析

  1. 冲洗骨髓的分析
    1. 将骨碎片转移至置于50 ml锥形管顶部的70 µm细胞筛中。使用带有25 G针头的10 ml注射器，用力以10 ml PBS冲洗该碎片，以在锥形管中获得骨髓细胞悬液。将细胞悬液在300 × g、21 °C条件下离心3分钟，吸除上清液，并将沉淀细胞重悬于PBS或其他所需溶液中，用于流式细胞术分析。
      注意：重悬体积取决于离心后细胞沉淀的大小及具体应用。
    2. 对于活力检测，使用约75–300 µl体积的PBS较为合适，这些悬浮液可根据制造商说明书，采用市售的基于荧光的活力检测试剂盒进行分析，用移液器转移至常规血细胞计数板中，再使用倒置荧光显微镜进行计数。
    3. 对于基于检测GFP阳性乳腺癌细胞的流式细胞术分析或分选，将细胞沉淀重悬于1 ml含有2% FBS、2 mM EDTA和10 mM HEPES的PBS中，使细胞浓度为1 × 10⁶ cells/ml。6 细胞/毫升
  2. H & E 染色与免疫组织化学
    1. 用于苏木精染色的样本处理 & 伊红（H&E) 染色和/或免疫组织化学，将组织碎片放入用2号铅笔标记的塑料包埋盒中，并浸入盛有10%中性缓冲福尔马林的容器中固定24小时。
    2. 采用常规方案对组织进行处理，用于石蜡包埋、切片和染色，流程中需包含脱钙步骤，以去除各组织片段内矿化骨针的钙质。

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结果

分离股骨头组织碎片

股骨头样本取自斯坦福大学医学院骨科手术科接受择期全髋关节置换术的同等数量的男性和女性患者（年龄44至90岁）。每个被弃置的股骨头均包含一小段股骨上端，其中含有由矿化小梁和骨髓组成的松质骨组织。通过外科暴露的骨干横截面，使用骨钳可从此组织中获取小块碎片（图2A）。所提取组织片段的组织学图像见图2B，显示了矿化结构和骨髓成分。不同患者来源的股骨头所提取组织的外观存在差异，颜色从黄色到红色不等，具体取决于骨髓中脂肪细胞的含量，如图2C所示。我们展示了这些骨组织碎片在短期实验中用于检测经基因工程改造表达荧光素酶和EGFP的乳腺癌细胞的动态相互作用。

通过生物发光成像技术检测乳腺癌细胞与骨碎片共培养条件下的乳腺细胞增殖

共培养MDA-MB-231-fLuc-EGFP乳腺癌细胞与固定化的骨碎片以通过生物发光成像（BLI）检测乳腺细胞增殖的培养板设置如

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讨论

Mehra 等 之前已描述了在尸检时采集转移性前列腺癌患者的骨组织样本并进行分析的方法，结果表明可获得高质量的组织，并验证了使用人骨样本研究转移过程的可行性47。本文中，我们介绍了从全髋关节置换术（THR）后废弃的股骨头中获取人骨组织碎片，并在短期共培养系统中对其进行收集、处理和使用的实验方案，以研究乳腺细胞的迁移、定植和增殖。在美国，每年约进行30万例髋关节置换手术（美国骨科医师学会；Orthoinfo.aaos.org），这些手术产生的组织样本通常被丢弃。该手术最常见的适应证之一是髋关节骨关节炎，其导致覆盖股骨头表面的软骨逐渐退化，从而引起关节疼痛。在全髋关节置换术中，股骨头连同部分股骨上段被切除。股骨是乳腺癌转移的常见部位48，而这些样本中含有小梁骨组织，正是转移性乳腺细胞定植的部位。大多数接受髋关节置换术的患者年龄在50至80岁之间，这一年龄段涵盖了乳腺癌发病率最高的时期。因此，这些组织构成了研究乳腺癌骨转移微环境的宝贵资源。

这些技术涉及若干关键步骤和注意事项。首先，一把质量优良的外科咬骨钳对于提取松质骨碎片至...

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披露

无任何披露事项需要报告。

致谢

本研究部分得到了替代研究与发展基金会（107588）、美国国立卫生研究院（1U54CA136465-04S1）以及加州乳腺癌研究计划（201B-0141）资助项目的资助。我们感谢Andrew Wilber博士和R. Scott McIvor博士慷慨捐赠他们的转座子及pK/hUbiC-SB11转座酶质粒。我们衷心感谢John Tamaresis博士在统计学方法方面提供的建议，Timothy Brown在流式细胞术检测中的协助，Georgette Henrich在迁移实验方面的指导，以及Nancy Bellagamba在THR样本收集过程中给予的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM (1X) + GlutaMAX-lLife Technologies10569-010所有DMEM均需添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素
McCoy's 5A 培养基 (1X)Life Technologies16600-082所有McCoy's 培养基均需添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素
胎牛血清Life Technologies16000-044
青霉素-链霉素Life Technologies15140-122
杀稻瘟菌素（Blastocidin，10 mg/ml）InvivoGen ant-bl用于转染细胞系培养基的补充
Falcon® 24孔板用透明PET膜细胞培养小室（孔径8.0 μm）Corning Incorporated353097
Falcon® 24孔TC处理聚苯乙烯细胞培养小室配套板Corning Incorporated353504
LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 *适用于哺乳动物细胞*Invitrogen Detection TechnologiesL-3224
FluoroBrite DMEMLife TechnologiesA18967-01
D-荧光素钾盐（来自萤火虫），5 g（30 mg/ml）Life TechnologiesL-8220
无菌细胞滤网，70 μmFisher Scientific22363548
6孔TC处理细胞培养板Corning Incorporated3516
12孔TC处理细胞培养板Corning Incorporated3513
24孔TC处理细胞培养板Corning Incorporated3526
Friedman-Pearson 骨凿Fine Science Tools16021-14
骨蜡Surgical Specialties Corporation903
IVIS 50 成像系统Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image 软件程序 Caliper Life Sciences/PerkinElmer133026
EVOS FL 成像系统Life TechnologiesVersion 4.2
OsteoSense 680 EXPerkinElmerNEV10020EX
MCF-7 乳腺癌细胞ATCCHTB-22
MDA-MB-231 乳腺癌细胞ATCCHTB-26
单克隆小鼠抗人细胞角蛋白抗体DAKO Cytomation克隆 (AE1/AE3)

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