本文描述了在人骨组织外植体模型系统中研究乳腺癌细胞迁移、增殖和定植的实验方案。
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本文内容
摘要
摘要
骨是乳腺癌转移最常见的部位。尽管人们普遍认为微环境会影响癌细胞的行为，但对于乳腺癌细胞在人类骨组织天然微环境中的特性与行为仍知之甚少.我们已开发出一系列方法，用于在源自全髋关节置换术中废弃股骨头的人类骨组织碎片培养微环境中，对人乳腺癌细胞进行追踪、定量和调控。通过使用经基因工程改造、可表达荧光素酶和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的乳腺癌细胞，我们能够利用生物发光成像（BLI）可重复地定量分析细胞迁移与增殖模式，借助荧光显微镜追踪细胞在骨组织碎片内的相互作用，并在癌细胞定植后通过流式细胞术评估其特性。该模型的主要优势包括：1）具有包含相关人类细胞类型的天然、结构完整的组织微环境；2）可直接接触微环境，便于对乳腺癌细胞与骨细胞的特性、行为及其相互作用进行快速的定性和定量监测与干预。目前该模型的主要局限性在于组织碎片的存活时间有限，因而研究窗口局限于短期培养。该模型系统的应用包括研究乳腺癌的基本生物学特性 转移微环境中乳腺癌及其他嗜骨性恶性肿瘤的研究，以及针对骨组织中乳腺癌细胞的有效治疗策略的开发。
引言
肿瘤微环境被广泛认为是乳腺癌进展和转移过程中癌细胞行为的关键决定因素1-3本方法旨在促进在人类骨组织微环境中对乳腺癌细胞的研究，骨组织是乳腺癌转移最常见的部位。4-6骨由矿化部分和骨髓腔室组成7-9，两者均含有与转移进展相关的细胞和分泌因子10,11尽管被广泛使用 体内 小鼠模型有助于对转移过程进行系统性研究12-15，骨骼内部的细胞相互作用难以直接观察和干预。用于研究和培养小鼠骨组织及小鼠骨髓细胞的模型系统提供了更便捷的途径，已帮助揭示了乳腺癌细胞在小鼠骨骼中转移过程中细胞间串扰及其潜在机制的诸多发现。16-22然而，研究表明，不同物种可能存在特定的骨组织嗜性模式23,24这些模式可能反映了骨组织特性上固有的物种特异性差异，或免疫缺陷小鼠骨髓细胞群改变所导致的差异11以及实验中使用的小鼠相对较年轻的年龄，这些因素都可能是骨微环境的决定因素。
体外 在人骨共培养体系中研究乳腺癌细胞的方法通常集中于特定类型的骨细胞，例如骨髓来源的成骨细胞或基质细胞，这些细胞可在单层培养或工程化的三维模型系统中进行培养。25-35尽管二维细胞培养模型一直是 体外 癌症研究方法中，长期以来人们已认识到，单层培养系统会从根本上改变细胞行为18....
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方案
股骨头样本采集自斯坦福大学医学院骨科手术科接受择期全髋关节置换术（THR）的患者。所有组织均按照斯坦福大学研究合规办公室的规定，以去标识化标本的形式收集。
1. 选择乳腺癌细胞系
- 获取所需的乳腺癌细胞系，或使用荧光素酶-GFP报告基因构建体转染细胞系。以下实验采用经基因工程改造后稳定表达萤火虫荧光素酶（fLuc）和增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的MDA-MB-231和MCF-7乳腺癌细胞系，其构建方法为使用Sleeping Beauty转座子质粒pKT2/LuBiG和转座酶质粒pK/hUbiC-SB11进行转染45,46。
注：转染后的细胞系称为MDA-MB-231-fLuc-EGFP和MCF-7-fLuc-EGFP。
2. 从股骨头分离组织碎片
- 全髋关节置换术（THR）后，将废弃的股骨头收集至装有生理盐水的无菌容器中。在术后1–3小时内将标本转移至实验室并进行处理。注意：若处理存在延迟，应将标本置于4 °C保存。
- 在超净台内的吸水垫上准备操作区域，放置以下物品：无菌手套、咬骨钳、镊子、盛有70%异丙醇的烧杯（用于冲洗器械），以及根据每种实验类型规定所需的组织培养器皿。
- 佩戴无菌外科手套，用一只手固定圆形股骨头，另一只手持咬骨钳从暴露的股骨上段获取所需大小的松质骨碎片（约2–5 mm）。根据增殖....
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结果
分离股骨头组织碎片
股骨头样本取自斯坦福大学医学院骨科手术科接受择期全髋关节置换术的同等数量的男性和女性患者（年龄44至90岁）。每个被弃置的股骨头均包含一小段股骨上端，其中含有由矿化小梁和骨髓组成的松质骨组织。通过外科暴露的骨干横截面，使用骨钳可从此组织中获取小块碎片（图2A）。所提取组织片段的组织学图像见图2B，显示了矿化结构和骨髓成分。不同患者来源的股骨头所提取组织的外观存在差异，颜色从黄色到红色不等，具体取决于骨髓中脂肪细胞的含量，如图2C所示。我们展示了这些骨组织碎片在短期实验中用于检测经基因工程改造表达荧光素酶和EGFP的乳腺癌细胞的动态相互作用。
通过生物发光成像技术检测乳腺癌细胞与骨碎片共培养条件下的乳腺细胞增殖
共培养MDA-MB-231-fLuc-EGFP乳腺癌细胞与固定化的骨碎片以通过生物发光成像（BLI）检测乳腺细胞增殖的培养板设置如
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讨论
Mehra 等 之前已描述了在尸检时采集转移性前列腺癌患者的骨组织样本并进行分析的方法，结果表明可获得高质量的组织，并验证了使用人骨样本研究转移过程的可行性47。本文中，我们介绍了从全髋关节置换术（THR）后废弃的股骨头中获取人骨组织碎片，并在短期共培养系统中对其进行收集、处理和使用的实验方案，以研究乳腺细胞的迁移、定植和增殖。在美国，每年约进行30万例髋关节置换手术（美国骨科医师学会；Orthoinfo.aaos.org），这些手术产生的组织样本通常被丢弃。该手术最常见的适应证之一是髋关节骨关节炎，其导致覆盖股骨头表面的软骨逐渐退化，从而引起关节疼痛。在全髋关节置换术中，股骨头连同部分股骨上段被切除。股骨是乳腺癌转移的常见部位48，而这些样本中含有小梁骨组织，正是转移性乳腺细胞定植的部位。大多数接受髋关节置换术的患者年龄在50至80岁之间，这一年龄段涵盖了乳腺癌发病率最高的时期。因此，这些组织构成了研究乳腺癌骨转移微环境的宝贵资源。
这些技术涉及若干关键步骤和注意事项。首先，一把质量优良的外科咬骨钳对于提取松质骨碎片至.......
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披露
无任何披露事项需要报告。
致谢
本研究部分得到了替代研究与发展基金会（107588）、美国国立卫生研究院（1U54CA136465-04S1）以及加州乳腺癌研究计划（201B-0141）资助项目的资助。我们感谢Andrew Wilber博士和R. Scott McIvor博士慷慨捐赠他们的转座子及pK/hUbiC-SB11转座酶质粒。我们衷心感谢John Tamaresis博士在统计学方法方面提供的建议，Timothy Brown在流式细胞术检测中的协助，Georgette Henrich在迁移实验方面的指导，以及Nancy Bellagamba在THR样本收集过程中给予的支持。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| DMEM (1X) + GlutaMAX-l | Life Technologies | 10569-010 | 所有DMEM均需添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素 |
| McCoy's 5A 培养基 (1X) | Life Technologies | 16600-082 | 所有McCoy's 培养基均需添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素 |
| 胎牛血清 | Life Technologies | 16000-044 | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| 杀稻瘟菌素（Blastocidin，10 mg/ml） | InvivoGen | ant-bl | 用于转染细胞系培养基的补充 |
| Falcon® 24孔板用透明PET膜细胞培养小室（孔径8.0 μm） | Corning Incorporated | 353097 | |
| Falcon® 24孔TC处理聚苯乙烯细胞培养小室配套板 | Corning Incorporated | 353504 | |
| LIVE/DEAD 细胞活力/细胞毒性检测试剂盒 *适用于哺乳动物细胞* | Invitrogen Detection Technologies | L-3224 | |
| FluoroBrite DMEM | Life Technologies | A18967-01 | |
| D-荧光素钾盐（来自萤火虫），5 g（30 mg/ml） | Life Technologies | L-8220 | |
| 无菌细胞滤网，70 μm | Fisher Scientific | 22363548 | |
| 6孔TC处理细胞培养板 | Corning Incorporated | 3516 | |
| 12孔TC处理细胞培养板 | Corning Incorporated | 3513 | |
| 24孔TC处理细胞培养板 | Corning Incorporated | 3526 | |
| Friedman-Pearson 骨凿 | Fine Science Tools | 16021-14 | |
| 骨蜡 | Surgical Specialties Corporation | 903 | |
| IVIS 50 成像系统 | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | ||
| Living Image 软件程序 | Caliper Life Sciences/PerkinElmer | 133026 | |
| EVOS FL 成像系统 | Life Technologies | Version 4.2 | |
| OsteoSense 680 EX | PerkinElmer | NEV10020EX | |
| MCF-7 乳腺癌细胞 | ATCC | HTB-22 | |
| MDA-MB-231 乳腺癌细胞 | ATCC | HTB-26 | |
| 单克隆小鼠抗人细胞角蛋白抗体 | DAKO Cytomation | 克隆 (AE1/AE3) |
参考文献
- Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227(2011).
- Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9<....
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重印与许可
