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方法文章

建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成

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DOI：

10.3791/52665

⸱

2015年5月1日

 ,  ,  , 
1Department of Internal Medicine V, Innsbruck Medical University, 2Oncotyrol GmbH, 3Tyrolean Cancer Research Institute, 4Division of Vascular Biology, Department of Medical Biochemistry and Biophysics, Karolinska Institute

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

人类多发性骨髓瘤（MM）细胞的存活和增殖需要间充质细胞和细胞外基质成分所提供的支持性微环境。我们建立了一种将人类骨髓瘤细胞和间充质细胞移植入鸡胚的体内模型，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。

摘要

多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞疾病，目前仍无法治愈，亟需开发新型药物以改善患者的预后。由于缺乏骨髓微环境以及自身/旁分泌生长因子，人源多发性骨髓瘤细胞难以体外培养。因此，迫切需要建立合适的 体外 和 体内 用于研究新型治疗药物对人类多发性骨髓瘤细胞作用的培养系统。本文介绍了一种在复杂三维环境中培养人类多发性骨髓瘤细胞的模型 体外 和 体内人多发性骨髓瘤细胞系 OPM-2 和 RPMI-8226 被转染以表达外源基因 GFP，并在人源间充质细胞和 I 型胶原基质存在条件下培养，形成三维球状体。此外，将球状体移植至鸡胚尿囊膜（CAM）上，通过体视荧光显微镜监测肿瘤生长。这两种模型均能在复杂的三维环境中用于研究新型治疗药物，并可通过将移植物匀浆后进行 GFP 特异性 ELISA 检测，定量肿瘤细胞质量。同时，可每日利用体视显微镜观察宿主的血管生成反应及肿瘤细胞向下方宿主组织的侵袭情况，并通过免疫组织化学染色分析人源肿瘤细胞（Ki-67、CD138、波形蛋白）或覆盖血管的宿主壁细胞（desmin/ASMA）的表达。

综上所述，onplant 系统能够在复杂的三维环境中研究多发性骨髓瘤（MM）细胞的生长和血管生成，并可用于筛选靶向 MM 细胞存活与增殖的新型治疗化合物。

引言

多发性骨髓瘤（MM）的特征是骨髓中恶性浆细胞增殖、骨损害以及免疫缺陷1。尽管目前已有多项新的治疗手段，例如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）和免疫调节药物（泊马度胺和来那度胺），但MM仍是一种无法治愈的恶性肿瘤，预后极差2。不良预后可能归因于MM细胞克隆具有极高的异质性，这种异质性导致对治疗的反应各异，尤其是在长期治疗及MM克隆受到选择压力的情况下尤为明显3。

新药及其联合用药的临床前测试 体外 和 体内 是未来药物开发中一个关键且耗时的步骤。因此，有用的 体内 为了更好地理解多发性骨髓瘤（MM）的疾病生物学并推动新药研发，需要建立相应的MM模型。事实上，目前用于血液系统恶性肿瘤及其治疗研究的最佳异种移植模型是免疫缺陷小鼠，例如重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠。 4-7非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠 8,9 或 β-微球蛋白基因敲除的NOD/SCID小鼠 10,11.

尽管在某些方面，小鼠的人类多发性骨髓瘤（MM）模型可以模拟人类疾病的表型，但免疫缺陷小鼠为近交系，因此仅能模拟个体对药物的单一反应，且饲养成本非常高。由于需要免疫抑制，实验动物必须在特殊条件下维持培养，而将人类多发性骨髓瘤细胞移植到小鼠体内通常需要6周至2个月9,12；除非采用技术要求较高的直接骨髓移植方法，但该方法的动物存活率较低7,13。因此，目前已建立了若干新方法，包括基于干细胞的类器官模型14、组织工程技术15或复杂的三维细胞培养模型16。这些方法在不久的将来将与传统的动物实验在临床前药物筛选中形成竞争，但仍无法替代在活体生物中进行的系统性毒性测试。

鸡胚在孵化前缺乏适应性免疫反应，因此已被证实是进行人源细胞和组织异种移植的合适模型 organism 17-19此外，由于鸡群存在遗传多样性，每只鸡胚对所施加的药物或肿瘤细胞均表现出个体化的反应。绒毛尿囊膜（CAM）是研究肿瘤相关血管生成的成熟体系。 20-22当实体瘤被移植到绒毛尿囊膜（CAM）时，会表现出多种癌症的特征 体内，包括增殖、侵袭、血管生成和转移 23-27.

基于我们研究团队在CAM异种移植模型方面的既往经验20,26,27，建立了一种人源多发性骨髓瘤模型，该模型结合了人源三维培养系统与模型的优势 体外 发育中的鸡胚。该多发性骨髓瘤模型系统可实现对多发性骨髓瘤生长进程的实时监测、细胞质量的定量分析以及临床前药物测试。

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方案

根据奥地利法律以及美国公共卫生服务部实验室动物福利办公室的规定，鸟类胚胎在孵化之前不被视为活体脊椎动物。美国国立卫生研究院（NIH）实验室动物福利办公室已就此领域提供了书面指导（http://www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 和 NIH 出版物编号：06-4515）。

1. 细胞培养与慢病毒转染

  1. 在37°C、5% CO2条件下，使用添加10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2 mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基培养骨髓来源的MM细胞系OPM-2、RPMI-8226及人间充质干细胞。
  2. 使用30 µl脂质体转染试剂和10 ml转染培养基，将9 µg病毒包装混合DNA和3 µg pLenti6/V5 dest eGFP载体共转染5 × 106个HEK 293FT细胞。12小时后移除转染培养基，加入含10%胎牛血清和1%非必需氨基酸（NEAA）的10 ml DMEM培养基。
  3. 5天后，收集HEK293FT细胞的上清液，通过离心去除悬浮细胞（1,000 × g，5分钟）。按文献所述方法28采用实时PCR测定病毒滴度。
  4. 在24孔板中，使用含eGFP慢病毒颗粒（1 × 105个颗粒）的完全生长培养基转染1 × 106个MM细胞。3天后，向培养基中加入2 µg/ml杀稻瘟菌素开始筛选；若使用市售eGFP慢病毒，则使用500 µg/ml新霉素进行筛选。
  5. 经过2周筛选后，可见表达eGFP的MM细胞克隆集落；通过离心（1,000 × g，5分钟）收集细胞，并扩增为用于实验的OPM-2eGFP和RPMI-8226eGFP亚系（第2和第3节）。

2. 3D-多发性骨髓瘤球体模型

  1. 将 I 型胶原溶液和 10 倍浓度 DMEM 置于冰上冷却。
  2. 将 1/10 体积的 10 倍浓度 DMEM 培养基加入胶原基质中；加入 NaOH（0.2 N）将酸性胶原溶液中和至 pH 7.4；将胶原/培养基混合液置于冰上保存。
  3. 将转基因多发性骨髓瘤细胞系（OPM-2eGFP 或 RPMI-8226 eGFP；每球体 250,000 个细胞）与人源间充质细胞（每球体 50,000 个细胞，即 30 µl 液滴）混合。
  4. 将细胞混合物在 15 ml 离心管中离心（1000 × g，5 分钟），加入预冷的胶原混合液（1 mL）至细胞沉淀中，并用 1000 µl 枪头充分混匀。
  5. 立即用 100 µl 枪头吸取 30 µl 胶原/细胞混合液，滴加至 24 孔板中的无菌石蜡膜上，于 37°C 下静置 30 分钟使细胞/胶原混合物聚合（见 图 1A）。
  6. 在多发性骨髓瘤球体上覆盖 1 mL 含 1、10 和 100 nM 硼替佐米的培养基（见 图 1B）。
  7. 在 37°C 培养 72 小时后，通过荧光体视显微镜记录球体图像（见 图 1C）。
  8. 使用宽平口镊子将每个球体转移至反应管中，用于检测 GFP 表达（见 图 1D）。

3. CAM 中的 3D 多发性骨髓瘤异种移植模型

  1. 将鸡卵置于专用于禽类卵的孵化器中，在37°C、70%湿度条件下孵育三天。
  2. 随后打开卵壳，将胚胎转移至经乙醇消毒的10 cm方形塑料称量皿中，皿内加细胞培养板盖以支撑，于体外（ex ovo）继续孵育六天，使绒毛尿囊膜（CAM）得以发育（见图2A）。
  3. 将I型胶原蛋白溶液和10倍浓度DMEM置于冰上预冷，按体积比1:10将10倍浓度DMEM加入胶原基质中；加入NaOH（0.2 N）将酸性胶原溶液中和至pH 7.4；将胶原/培养基混合液保存在冰上。
  4. 将转基因多发性骨髓瘤细胞系（OPM-2eGFP 或 RPMI-8226eGFP；每球状体250,000个细胞）与人源间充质细胞（50,000个细胞/球状体）混合。
  5. 将细胞在15 mL离心管中离心（1,000 × g，5分钟；每种测试化合物使用1个样品管），向细胞沉淀中加入1 mL含药物（工作浓度按需设定）的预冷胶原混合液，并充分混匀（使用1,000 µL枪头）。
  6. 在6孔板内的Parafilm膜上滴加胶原液滴（每滴30 µL），于37°C放置30分钟，使细胞外基质发生聚合。
  7. 使用镊子将第3.6步制备的“onplants”转移至9日龄鸡胚绒毛尿囊膜（CAM）未处理区域（距胚胎2 cm处，每个鸡胚放置4个onplants，见图2B）。
  8. 在37°C、70%湿度的卵孵化器中进行5天体内（in vivo）生长后，通过荧光体视显微镜记录异种移植瘤的生长情况（见图2C）。将鸡胚置于冰箱4°C环境中低温处理5小时，实施安乐死。
  9. 使用眼科剪刀和宽口平头镊子切除异种移植瘤及其下方的CAM组织。可用于绿色荧光蛋白（GFP）检测（第4节，见图2D），或用于血管和/或侵袭性肿瘤细胞的免疫组织化学分析（第5节）。

4. 通过 ELISA 定量检测 eGFP 蛋白

  1. 将每个 MM 类球体或切除的异种移植组织转移至含有 200 µg/ml 蛋白酶抑制剂的 0.5 ml RIPA 缓冲液中。
  2. 在冰上使用组织匀浆器对类球体/异种移植组织进行匀浆处理。
  3. 在液氮和 37°C 水浴中进行三次冻融循环。
  4. 将匀浆液在 4°C 下以 12,000 g 离心 20 分钟，并收集上清液保存。
  5. 用 ELISA 试剂盒的检测缓冲液（200 µl）将样品按 1:20 稀释。根据生产商说明书，使用商品化的 GFP ELISA 试剂盒及生物素标记的抗 GFP 抗体测定 GFP 水平。

5. 血管及侵袭性肿瘤细胞的免疫组织化学分析

  1. 将带有 CAM 区域的移植瘤组织在 4% 多聚甲醛中 4°C 过夜固定。
  2. 将固定后的移植瘤组织放入包埋盒中，并转移至组织包埋机，依次经过梯度酒精系列（50%、70%、80%、95% 乙醇、二甲苯和石蜡；每步 60 分钟）。
  3. 使用台式旋转式切片机对移植瘤组织进行切片（5 µm），将石蜡切片置于载玻片上，56°C 烘箱中过夜烘烤。
  4. 通过递减梯度酒精系列将切片脱蜡至双蒸水（二甲苯、95%、80%、70%、50% 乙醇、双蒸水；每步 10 分钟）。
  5. 在水浴中（95°C，20 分钟）使用抗原修复液（柠檬酸缓冲液；pH 7.0；体积 100 µl）进行抗原修复。
  6. 用 100 µl 含 3% H2O2/甲醇溶液室温孵育 30 分钟，以阻断内源性过氧化物酶活性。
  7. 在含 10% 胎牛血清的 PBS 中封闭切片 45 分钟（体积 100 µl）。
  8. 室温下用含 1% 胎牛血清的 PBS 稀释的一抗（1 µg/ml）100 µl 孵育 1 小时进行染色。
  9. 在 PBS 中洗涤 3 次后，室温下用含 1% 胎牛血清的 PBS 稀释的生物素化二抗（0.1 µg/ml）100 µl 孵育 1 小时。
  10. 在 PBS 中洗涤 3 次后，根据制造商说明书使用亲和素/生物素复合物（ABC）和二氨基联苯胺（DAB）底物溶液进行显色反应。
  11. 将切片转移至双蒸水中终止反应，苏木素复染，然后用合成封片剂封片。

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结果

体外三维多发性骨髓瘤球体实验中靶向化合物的分析

由于原代人多发性骨髓瘤细胞培养的局限性 体外 我们建立了新的3D 体外 利用骨髓来源的原代人类间充质细胞和细胞外生长基质培养人类多发性骨髓瘤细胞系的培养模型图1A，B）。EGFP转基因多发性骨髓瘤（MM）细胞系可在三维球状体生长后实现MM肿瘤团块的可视化与定量分析。两种MM细胞系OPM-2eGFP 和RPMI-8226eGFP 在含有不同浓度（1–100 nM）硼替佐米的条件下培养3天，然后通过体视荧光显微镜观察GFP表达以可视化肿瘤图1C）。在将类球体均质化后，通过eGFP-ELISA检测eGFP含量，定量肿瘤细胞量。图1D).

体内分析鸡胚中多发...

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讨论

开发针对难治性多发性骨髓瘤（MM）的新治疗药物，需要耗时更短、成本更低的体内系统来评估人源MM细胞对药物的敏感性。迄今为止，可用于新型抗骨髓瘤疗法临床前评价的体内系统仍然有限，且均存在难以大规模筛选化合物文库的不足29. 

目前最理想的人源MM细胞模型为重度免疫缺陷小鼠7,13,30和火鸡胚胎29。SCID小鼠和禽类胚胎异种移植模型均可用于研究MM的生物学特性以及测试新型治疗化合物。然而，小鼠模型存在多种局限性，包括近交系基因型、技术操作复杂、观察周期长以及高成本。

本研究提出了一种新型的三维（3D）类球体与禽类异种移植模型，用于研究人源MM细胞生物学，该模型包含人源间充质干细胞和细胞外基质作为支持性组分。MM细胞的存活与增殖高度依赖其特定的微环境，即基质来源的生长因子、细胞因子及细胞外基质（ECM）成分的存在31-33。此外，当骨髓瘤细胞受到局部微环境的保护时，药物可能无效或活性发生改变31,34。

与小鼠模型相比，本文所述的3D体外与体内...

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披露

作者无竞争性财务利益

致谢

作者感谢 Cornelia Heis 女士在免疫组织化学及鸡胚制备方面提供的出色技术协助。本研究工作由奥地利科学基金（FWF 资助号：P19552）和欧洲联盟（欧盟第七框架计划项目 Optatio，编号：278570）资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RPMI-8226 细胞DSMZACC 9STR 分型
OPM-2 细胞DSMZACC 50STR 分型
人骨髓间充质干细胞 PromoCellPC-C-12974
HEK293FT 细胞 InvitrogenR700-07
RPMI1640 培养基Sigma AldrichR0883
胎牛血清  HyCloneThermoScientificSH30070.03
L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液SigmaG6784
DMEM 培养基Gibco31966
非必需氨基酸（NEAA）Sigma Life SciencesM7145
转染培养基/Opti-MEM Gibco51985
eGFP 慢病毒颗粒GeneCopoeiaLPP-EGFP-LV105即用型病毒颗粒
pLenti6/V5Dest6 eGFP 载体InvitrogenPN 35-1271由作者提供
ViralpowerTM 包装混合物 InvitrogenP/N 35-1275
转染试剂/Lipofectamin 2000Invitrogen11668-027
杀稻瘟菌素（Blasticidin）InvitrogenR210-01
新霉素（Neomycin）BiochromA2912
Ⅰ型胶原蛋白  大鼠尾来源BD Biosciences354236
DMEM 干粉Life TechnologiesArt.Nr. 10338582
plitidepsinPharmamar
硼替佐米（bortezomib）LKT Lab., Inc.B5871
SPF 级白壳鸡受精蛋Charles River受精  白来航  鸡蛋
塑料称量皿neoLabArt.Nr. 1-1125用于离壳培养
方形培养皿（带盖）SimportD210-16用于离壳培养
RIPA 缓冲液（10×）Cell Signaling#9806
蛋白酶抑制剂片剂Roche11 836 170 001
Complete Mini 无 EDTA
GFP ELISA 试剂盒Cell Biolabs, Inc.AKR-121
Histocette II 组织包埋盒SimportM493-6
多聚甲醛  37%Roth7398.1
DPBSLonzaBE17-512F
无水乙醇Normapur20,821,321
Roti-Histol 透明剂RothArt.Nr.6640.4
Paraplast 包埋蜡SigmaA6330
SuperFrost 显微镜载玻片R. Langenbrinck Art.-Nr.
实验室与医疗技术03-0060
DakoCytomation 洗涤缓冲液 10×DakoCytomationCode-Nr.
S 3006
抗原修复液（10×）  pH 6.1DAKOCode-Nr.
S 1699
H2O2Merck
鼠抗人 ASMA 单克隆抗体，克隆号 1A4DAKOM0851
鼠抗人 CD138 单克隆抗体，克隆号 MI15DAKOM7228
鼠抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体，克隆号 V9DAKOM0725
鼠抗人结蛋白（Desmin）单克隆抗体，克隆号 D33DAKO M0760
鼠抗人 Ki67  单克隆抗体，克隆号 MIB-1  DAKO M7240
生物素标记的山羊抗小鼠 IgGVector Laboratories Inc.BA-9200
Vectastain Elite ABC 试剂盒Vector Laboratories Inc.# PK-6100
FAST DAB 显色试剂片剂套装Sigma Biochemicals# D4293
Mayer’s 苏木精溶液Merck1,092,490,500
Roti Histokitt 封片剂RothArt.Nr.6638.2
台式旋转切片机Thermo Electron, Shandon Finesse ME+
组织包埋工作站Leica, TP1020
孵蛋器Grumbach BSS160
配备数字相机（Olympus E410）和柔性冷光源的体视荧光显微镜 Olympus, SZX10
Ultra Turrax IKA T10匀浆器

参考文献

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