人类多发性骨髓瘤（MM）细胞的存活和增殖需要间充质细胞和细胞外基质成分所提供的支持性微环境。我们建立了一种将人类骨髓瘤细胞和间充质细胞移植入鸡胚的体内模型，用于研究抗癌药物对肿瘤生长、侵袭和血管生成的影响。
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方法文章
建立人多发性骨髓瘤鸡异种移植模型以研究肿瘤生长、侵袭和血管生成
* These authors contributed equally
本文内容
摘要
摘要
多发性骨髓瘤（MM）是一种恶性浆细胞疾病，目前仍无法治愈，亟需开发新型药物以改善患者的预后。由于缺乏骨髓微环境以及自身/旁分泌生长因子，人源多发性骨髓瘤细胞难以体外培养。因此，迫切需要建立合适的 体外 和 体内 用于研究新型治疗药物对人类多发性骨髓瘤细胞作用的培养系统。本文介绍了一种在复杂三维环境中培养人类多发性骨髓瘤细胞的模型 体外 和 体内人多发性骨髓瘤细胞系 OPM-2 和 RPMI-8226 被转染以表达外源基因 GFP，并在人源间充质细胞和 I 型胶原基质存在条件下培养，形成三维球状体。此外，将球状体移植至鸡胚尿囊膜（CAM）上，通过体视荧光显微镜监测肿瘤生长。这两种模型均能在复杂的三维环境中用于研究新型治疗药物，并可通过将移植物匀浆后进行 GFP 特异性 ELISA 检测，定量肿瘤细胞质量。同时，可每日利用体视显微镜观察宿主的血管生成反应及肿瘤细胞向下方宿主组织的侵袭情况，并通过免疫组织化学染色分析人源肿瘤细胞（Ki-67、CD138、波形蛋白）或覆盖血管的宿主壁细胞（desmin/ASMA）的表达。
综上所述，onplant 系统能够在复杂的三维环境中研究多发性骨髓瘤（MM）细胞的生长和血管生成，并可用于筛选靶向 MM 细胞存活与增殖的新型治疗化合物。
引言
多发性骨髓瘤（MM）的特征是骨髓中恶性浆细胞增殖、骨损害以及免疫缺陷1。尽管目前已有多项新的治疗手段，例如蛋白酶体抑制剂（硼替佐米）和免疫调节药物（泊马度胺和来那度胺），但MM仍是一种无法治愈的恶性肿瘤，预后极差2。不良预后可能归因于MM细胞克隆具有极高的异质性，这种异质性导致对治疗的反应各异，尤其是在长期治疗及MM克隆受到选择压力的情况下尤为明显3。
新药及其联合用药的临床前测试 体外 和 体内 是未来药物开发中一个关键且耗时的步骤。因此，有用的 体内 为了更好地理解多发性骨髓瘤（MM）的疾病生物学并推动新药研发，需要建立相应的MM模型。事实上，目前用于血液系统恶性肿瘤及其治疗研究的最佳异种移植模型是免疫缺陷小鼠，例如重度联合免疫缺陷（SCID）小鼠。 4-7非肥胖糖尿病/重症联合免疫缺陷（NOD/SCID）小鼠 8,9 或 β-微球蛋白基因敲除的NOD/SCID小鼠 10,11.
尽管在某些方面，小鼠的人类多发性骨髓瘤（MM）模型可以模拟人类疾病的表型，但免疫缺陷小鼠为近交系，因此仅能模拟个体对药物的单一反应，且饲养成本非常高。由于需要免疫抑制，实验动物必须在特殊条件下维持培养，而将人类多发性骨髓瘤细胞移植到小鼠体内....
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方案
根据奥地利法律以及美国公共卫生服务部实验室动物福利办公室的规定，鸟类胚胎在孵化之前不被视为活体脊椎动物。美国国立卫生研究院（NIH）实验室动物福利办公室已就此领域提供了书面指导（http://www.grants.nih.gov/grants/olaw/references/ilar91.htm 和 NIH 出版物编号：06-4515）。
1. 细胞培养与慢病毒转染
- 在37°C、5% CO2条件下，使用添加10%胎牛血清、100 IU/ml青霉素、100 μg/ml链霉素和2 mM谷氨酰胺的RPMI1640培养基培养骨髓来源的MM细胞系OPM-2、RPMI-8226及人间充质干细胞。
- 使用30 µl脂质体转染试剂和10 ml转染培养基，将9 µg病毒包装混合DNA和3 µg pLenti6/V5 dest eGFP载体共转染5 × 106个HEK 293FT细胞。12小时后移除转染培养基，加入含10%胎牛血清和1%非必需氨基酸（NEAA）的10 ml DMEM培养基。
- 5天后，收集HEK293FT细胞的上清液，通过离心去除悬浮细胞（1,000 × g，5分钟）。按文献所述方法28采用实时PCR测定病毒滴度。
- 在24孔板中，使用含eGFP慢病毒颗粒（1 × 105个颗粒）的完全生长培养基转染1 × 106个MM细胞。3天后，向培....
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结果
体外三维多发性骨髓瘤球体实验中靶向化合物的分析
由于原代人多发性骨髓瘤细胞培养的局限性 体外 我们建立了新的3D 体外 利用骨髓来源的原代人类间充质细胞和细胞外生长基质培养人类多发性骨髓瘤细胞系的培养模型图1A，B）。EGFP转基因多发性骨髓瘤（MM）细胞系可在三维球状体生长后实现MM肿瘤团块的可视化与定量分析。两种MM细胞系OPM-2eGFP 和RPMI-8226eGFP 在含有不同浓度（1–100 nM）硼替佐米的条件下培养3天，然后通过体视荧光显微镜观察GFP表达以可视化肿瘤图1C）。在将类球体均质化后，通过eGFP-ELISA检测eGFP含量，定量肿瘤细胞量。图1D).
体内分析鸡胚中多发.......
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讨论
开发针对难治性多发性骨髓瘤（MM）的新治疗药物，需要耗时更短、成本更低的体内系统来评估人源MM细胞对药物的敏感性。迄今为止，可用于新型抗骨髓瘤疗法临床前评价的体内系统仍然有限，且均存在难以大规模筛选化合物文库的不足29.
目前最理想的人源MM细胞模型为重度免疫缺陷小鼠7,13,30和火鸡胚胎29。SCID小鼠和禽类胚胎异种移植模型均可用于研究MM的生物学特性以及测试新型治疗化合物。然而，小鼠模型存在多种局限性，包括近交系基因型、技术操作复杂、观察周期长以及高成本。
本研究提出了一种新型的三维（3D）类球体与禽类异种移植模型，用于研究人源MM细胞生物学，该模型包含人源间充质干细胞和细胞外基质作为支持性组分。MM细胞的存活与增殖高度依赖其特定的微环境，即基质来源的生长因子、细胞因子及细胞外基质（ECM）成分的存在31-33。此外，当骨髓瘤细胞受到局部微环境的保护时，药物可能无效或活性发生改变31,34。
与小鼠模型相比，本文所述的3D体外与体内.......
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披露
作者无竞争性财务利益
致谢
作者感谢 Cornelia Heis 女士在免疫组织化学及鸡胚制备方面提供的出色技术协助。本研究工作由奥地利科学基金（FWF 资助号：P19552）和欧洲联盟（欧盟第七框架计划项目 Optatio，编号：278570）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI-8226 细胞 | DSMZ | ACC 9 | STR 分型 |
| OPM-2 细胞 | DSMZ | ACC 50 | STR 分型 |
| 人骨髓间充质干细胞 | PromoCell | PC-C-12974 | |
| HEK293FT 细胞 | Invitrogen | R700-07 | |
| RPMI1640 培养基 | Sigma Aldrich | R0883 | |
| 胎牛血清 HyClone | ThermoScientific | SH30070.03 | |
| L-谷氨酰胺-青霉素-链霉素溶液 | Sigma | G6784 | |
| DMEM 培养基 | Gibco | 31966 | |
| 非必需氨基酸（NEAA） | Sigma Life Sciences | M7145 | |
| 转染培养基/Opti-MEM | Gibco | 51985 | |
| eGFP 慢病毒颗粒 | GeneCopoeia | LPP-EGFP-LV105 | 即用型病毒颗粒 |
| pLenti6/V5Dest6 eGFP 载体 | Invitrogen | PN 35-1271 | 由作者提供 |
| ViralpowerTM 包装混合物 | Invitrogen | P/N 35-1275 | |
| 转染试剂/Lipofectamin 2000 | Invitrogen | 11668-027 | |
| 杀稻瘟菌素（Blasticidin） | Invitrogen | R210-01 | |
| 新霉素（Neomycin） | Biochrom | A2912 | |
| Ⅰ型胶原蛋白 大鼠尾来源 | BD Biosciences | 354236 | |
| DMEM 干粉 | Life Technologies | Art.Nr. 10338582 | |
| plitidepsin | Pharmamar | ||
| 硼替佐米（bortezomib） | LKT Lab., Inc. | B5871 | |
| SPF 级白壳鸡受精蛋 | Charles River | 受精 白来航 鸡蛋 | |
| 塑料称量皿 | neoLab | Art.Nr. 1-1125 | 用于离壳培养 |
| 方形培养皿（带盖） | Simport | D210-16 | 用于离壳培养 |
| RIPA 缓冲液（10×） | Cell Signaling | #9806 | |
| 蛋白酶抑制剂片剂 | Roche | 11 836 170 001 | |
| Complete Mini 无 EDTA | |||
| GFP ELISA 试剂盒 | Cell Biolabs, Inc. | AKR-121 | |
| Histocette II 组织包埋盒 | Simport | M493-6 | |
| 多聚甲醛 37% | Roth | 7398.1 | |
| DPBS | Lonza | BE17-512F | |
| 无水乙醇 | Normapur | 20,821,321 | |
| Roti-Histol 透明剂 | Roth | Art.Nr.6640.4 | |
| Paraplast 包埋蜡 | Sigma | A6330 | |
| SuperFrost 显微镜载玻片 | R. Langenbrinck | Art.-Nr. | |
| 实验室与医疗技术 | 03-0060 | ||
| DakoCytomation 洗涤缓冲液 10× | DakoCytomation | Code-Nr. | |
| S 3006 | |||
| 抗原修复液（10×） pH 6.1 | DAKO | Code-Nr. | |
| S 1699 | |||
| H2O2 | Merck | ||
| 鼠抗人 ASMA 单克隆抗体，克隆号 1A4 | DAKO | M0851 | |
| 鼠抗人 CD138 单克隆抗体，克隆号 MI15 | DAKO | M7228 | |
| 鼠抗人波形蛋白（Vimentin）单克隆抗体，克隆号 V9 | DAKO | M0725 | |
| 鼠抗人结蛋白（Desmin）单克隆抗体，克隆号 D33 | DAKO | M0760 | |
| 鼠抗人 Ki67 单克隆抗体，克隆号 MIB-1 | DAKO | M7240 | |
| 生物素标记的山羊抗小鼠 IgG | Vector Laboratories Inc. | BA-9200 | |
| Vectastain Elite ABC 试剂盒 | Vector Laboratories Inc. | # PK-6100 | |
| FAST DAB 显色试剂片剂套装 | Sigma Biochemicals | # D4293 | |
| Mayer’s 苏木精溶液 | Merck | 1,092,490,500 | |
| Roti Histokitt 封片剂 | Roth | Art.Nr.6638.2 | |
| 台式旋转切片机 | Thermo Electron, Shandon Finesse ME+ | ||
| 组织包埋工作站 | Leica, TP1020 | ||
| 孵蛋器 | Grumbach | BSS160 | |
| 配备数字相机（Olympus E410）和柔性冷光源的体视荧光显微镜 | Olympus, SZX10 | ||
| Ultra Turrax | IKA T10 | 匀浆器 |
参考文献
- Kuehl, W. M., Bergsagel, P. L. Multiple myeloma: evolving genetic events and host interactions. Nat.Rev.Cancer. 2 (3), 175-187 (2002).
- Kumar, S. K., Gertz, M. A. Risk adapted therapy for multiple myeloma: back to basics. Leuk.Lymphoma. , (2014).
- Prideaux, S. M., Conwa....
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