重复性缺氧预处理及小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后神经血管保护作用的量化

摘要

本方案描述了重复性缺氧预处理，即短暂暴露于全身性缺氧，可减少小鼠短暂性大脑中动脉闭塞后脑梗死体积及血脑屏障的破坏。同时，本文还详细说明了脑卒中后脑梗死体积与血脑屏障破坏的双重定量方法，以评估神经血管保护作用的疗效。

摘要

脑卒中实验动物模型是研究脑卒中病理机制并开发更有效治疗策略的重要工具。为期两周的重复性缺氧预处理（RHP）方案可在局灶性缺血性脑卒中小鼠模型中诱导对中枢神经系统（CNS）损伤的长期保护作用。RHP包括9次随机暴露于缺氧环境，其持续时间（2或4小时）和强度（8%和11% O₂）均不相同。RHP可在最后一次缺氧暴露后数周内显著减小梗死体积，减轻血脑屏障（BBB）破坏，并抑制卒中后的炎症反应，提示其可长期诱导一种内源性的中枢神经系统保护表型。对梗死体积和血脑屏障破坏进行双重定量的方法，可用于有效评估接受RHP或其他潜在神经保护剂处理小鼠的神经血管保护效果。成年雄性Swiss Webster小鼠接受RHP预处理，或暴露于相同持续时间的21% O₂（即 室内空气）作为对照。在最后一次缺氧暴露后2周，实施60分钟的短暂性大脑中动脉闭塞（tMCAo）。通过经颅激光多普勒血流仪确认闭塞和再灌注过程。再灌注22小时后，经尾静脉注射伊文思蓝（EB）。2小时后，采用异氟烷过量麻醉处死动物，脑组织切片用2,3,5-三苯基氯化四氮唑（TTC）染色，随后对梗死体积进行定量分析。随后，将EB从脑组织中提取48小时，以评估tMCAo后的血脑屏障破坏程度。综上所述，RHP是一种简单、低成本且可重复的实验方案，可在小鼠中诱导对脑卒中损伤的长期内源性神经血管保护作用，并具有向其他中枢神经系统相关及全身性促炎性疾病状态转化的应用潜力。

引言

中风是成人致残的首要原因，也是死亡的第四大原因，是美国成人群体面临的一种最具破坏性的疾病状态。¹ 中风的动物模型可用于实验性研究减少缺血性损伤和改善中风后恢复的新方法。此类转化研究的一个新方向是预处理。预处理是指有意施加一种无害的刺激，以减轻后续更严重损伤所造成的损害。² 研究表明，缺氧预处理可在大脑中引发多效性变化，在体内（in vivo）和体外（in vitro）研究中均对中风具有保护作用。³ 然而，单次缺氧暴露仅能提供短期的神经保护作用，在成年小鼠中诱导的缺血耐受时间少于72小时。⁴ 即使经过四周、每天14小时的低压性缺氧暴露，Lin等人发现神经保护作用也仅持续一周。⁵ 重复性缺氧预处理（RHP）的特点是缺氧暴露的频率、持续时间和强度具有随机性变化。与单次预处理刺激相比，RHP可在小鼠中诱导出持续长达八周的脑保护表型。⁶ 在最后一次缺氧暴露后数周内，RHP可减少梗死体积、血脑屏障（BBB）破坏、血管炎症以及白细胞穿出。RHP特异性地减轻了缺血脑组织中的炎症反应，表现为减少T细胞、单核细胞和巨噬细胞的数量，同时维持缺血半球中B细胞的数量。⁷ 事实上，在任何中枢神经系统（CNS）损伤（包括中风）发生之前，RHP已在小鼠中诱导出一种免疫抑制表型。从经RHP处理的健康小鼠中分离出的B细胞表现出独特的抗炎表型，其抗原呈递和抗体生成均受到下调。总体上....

方案

注意：本方案已获德克萨斯大学西南医学中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）批准，该委员会遵守美国国立卫生研究院（NIH）关于实验动物使用的政策。

1. 重复性缺氧预处理

1. 在气体调节器上定制设计四个流量计，并使用聚氯乙烯管将其连接至标准的15 L诱导室，以允许来自氧气（O₂）的压缩气体₂）储液罐中的液体通过入口端口流入腔室。有关定制设计的更多细节，请参见“设备与材料”部分。
2. 将小鼠分为2组：重复性低氧预处理（RHP）组，接受8%和11% O₂交替暴露；对照组，不进行低氧暴露。₂，以及对照组，接受21% O₂暴露₂ （室温空气）同时进行。参见 表1 对于频率以及强度（8% 和 11% O₂）的变化，₂ 或 21% O₂₂），以及RHP处理的持续时间（2或4小时）。
3. 移除每个笼子的顶部滤网盖，将笼子连同完整的食物和水瓶一起放入与其对应的 O 连接的腔室中₂ 储液罐。关闭并固定好腔室的盖子。
   1. 打开气罐的主阀门，将每个诱导室的初始气体流量设为2升/分钟（LPM），持续暴露前5分钟；随后将流量调低至1 LPM，维持此流速完成后续暴露过程。
   2. 暴露结束后，将流量降至 0 LPM 并关闭气罐的气体阀门。
   ....

结果

本研究纳入25只10周龄的雄性Swiss Webster小鼠，在随机分组时分为RHP组（n = 10）和21% O₂组（n = 15）。在最后一次RHP暴露后两周进行手术操作，各组在不同实验日之间采用盲法并交叉平衡设计。在tMCAo术后，1只小鼠在术后恢复期间死亡，另有1只小鼠因未达到再灌注CBF标准而被排除出研究。这两只被排除的小鼠均来自21% O₂组。根据ARRIVE指南²⁸，表2列出了手术相关参数。间接梗死体积、半球肿胀（即水肿）以及伊文思蓝（EB）外渗结果见图2。所有数据均采用非配对t检验进行分析（显示均值和标准差），并通过错误发现率低于1%的方法（Graphpad Prism）检测异常值，共从EB数据集中剔除了4个异常值（21%组2个，RHP组2个）。

在该队列中，RHP使梗死体积减少了近一半（33.9 ± 23.0 mm³) 与21% O₂相比₂-处理小鼠（62.6 ± 42.6 mm）³.......

讨论

单次全身性缺氧暴露（即小鼠在11% O₂环境中暴露2小时）可“短暂地”保护大脑免受tMCAo损伤²⁹，这意味着缺氧预处理所引发的表观遗传反应持续时间较短，基础表型在数天内即恢复。重复施加缺氧预处理刺激可显著延长神经保护表型的持续时间⁶。大量研究表明，重复刺激的频率、强度和持续时间是决定该反应的关键因素。例如，在2周内每周3次（周一、周三、周五）重复相同强度和持续时间的缺氧处理（2小时，11%氧气），虽未能延长tMCAo所致神经血管损伤的治疗时间窗⁶，但足以诱导视网膜产生长期的缺血耐受³⁰。有趣的是，尽管间隔6天进行5次全身性缺氧暴露（每次8% O₂，持续5小时），可在最后一次缺氧暴露后第3天仍对tMCAo产生神经保护作用，但若将5次缺氧暴露的间隔缩短至3天，则神经保护效应消失³¹。这种差异的原因尚不明确，可能与该方案中严重缺氧的持续时间有关，和/或与如此严重程度的缺氧刺激之间缺乏足够的恢复时间有关。

简言之，在频.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
流量计、调节器	VetEquip, Inc	特殊订购	四个流量计连接到6.0 mm的柔性PVC管，该管通过塑料母接头连接至每个诱导室的进气口。这些流量计用螺栓固定在一根6.5" x 1" x 1"的金属条上。该金属条再用螺栓固定在带有DISS出口的MI-246-P压力表上。该压力表和流量计设备可用扳手连接至每个新气瓶。
21% O2气罐	AirGas	OX USP200
11% O2 气罐	AirGas	特殊订购
8% O2气罐	AirGas	特殊订购
15 L诱导室	VetEquip	941454
Moor Laber 多普勒血流仪	Moor Instruments	moorVMS-LDF1-HP	0.8 mm直径探头
高强度照明器	Nikon	NI-150
变焦立体显微镜	NIkon	SMZ800	也可使用其他手术显微镜。
Kent Scientific Right Temperature CODA	Kent Scientific Corporation	已停产	推荐替代产品为PhysioSuite，配备RightTemp体温监测与恒温控制系统（Kent Scientific，货号#PS-RT）。
Hovabator孵育器	Stromberg's	2362-E	我们的型号为2362N。2362E为后续型号，配备电子恒温器。
V010麻醉系统	VetEquip	901807	包括：十英尺高压氧气管、支架、流量计、氧气冲洗组件、挥发器、呼吸回路、诱导室、鼻罩、废气排放管及两个VapoGuard过滤器
250 ml 异氟烷	Butler Schein	NDC-11695
D-6 Vet Trim动物无线修剪器	Andis	#23905	替换刀片可从Andis公司购买（#23995）
聚维酮碘	Fisher Scientific	19-898-867
棉签	多家供应商	无目录号
纱布垫	Fisher Scientific	67622
手术巾	Fisher Scientific	GM300
丝线缝合线	Look/Div Surgical Specialties	SP115
尼龙缝合线	Look/Div Surgical Specialties	SP185
Durmont #5镊子（2把）	Fine Science Tools	11251-35	45°弯头
手术剪刀	Fine Science Tools	14028-10
3 mm Vannas剪	Kent Scientific Corporation	INS600177	直刃
Hartman止血钳	Fine Scientific Tools	13002-10
闭塞缝合丝	华盛顿大学	特殊订购	缝合丝由华盛顿大学进行硅胶涂层处理，并有偿提供给UTSW设施使用。
伊文思蓝	Sigma Aldritch	E2129-10G
滤纸	Sigma Aldritch	WHA1001150	150 mm，圆形，1号滤纸
称量舟	Fisher Scientific	02-202-101	2.5"直径
0.9%氯化钠注射液 USP	Baxter Pharmaceutics	2B1321
0.3 cc胰岛素注射器，带29号针头	Becton Dickinson Labware	309301
平底固定器	Braintree Scientific	FB M	2.0"直径
TTC	Sigma	T8877
10x PBS，pH 7.4	Fisher Scientific	BP399-20
水浴锅	多家供应商	无目录号	可手动将含TTC的闪烁管置于流动温水中，作为水浴锅的替代方法。
泡沫板	多家供应商	无目录号
大容量注射器套件	PumpSystems Inc	P-SYRKIT-LG
灌注泵	PumpSystems Inc	NE-300
60 cc注射器	Fisher Scientific	NC9203256
27号带翼输液器	Kawasumi Laboratories, Inc	D3K1-25G 1
20 ml闪烁瓶	Fisher Scientific	50-367-126
不锈钢刮刀	Fisher Scientific	14-373-25A
Alto丙烯酸1.0 mm小鼠脑，冠状切面	CellPoint Scientific	无目录号
0.21 mm不锈钢刀片，25片/包	CellPoint Scientific	无目录号	可重复使用的冷冻切片刀片是一种经济的替代选择。
4%多聚甲醛	Santa Cruz Biotechnology	SC-281692
Superfrost载玻片	Fisher Scientific	12-550-15
HP Scanjet G4050	多家供应商	无目录号	其他商用扫描仪也适用于本实验步骤。
ImageJ	美国国立卫生研究院	无目录号
分析天平	Mettler Toledo	XSE 205U
精密紧凑型烘箱	Thermo Scientific	PR305225M
1.7 ml微量离心管（Eppendorf）	Denville Scientific	C2170
甲酰胺	Fisher Scientific	BP228-100
96孔板	Fisher Scientific	07-200-9
Epoch微孔板分光光度计	BioTek	无目录号