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方法文章

一种用于测量乙醇对运动速度影响的检测方法 秀丽隐杆线虫

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DOI：

10.3791/52681

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2015年4月9日

 ,  ,  , 
1Department of Pharmacology and Toxicology, Virginia Commonwealth University, 2VCU Alcohol Research Center, Virginia Commonwealth University

本文内容

摘要

C. elegans 是研究乙醇对行为影响的有用模型。本文介绍一种行为检测方法，可定量分析乙醇对爬行线虫运动速度的影响；通过该方法可同时测定线虫对乙醇的初始敏感性及其急性功能耐受性的形成。

摘要

酒精使用障碍是一个重要的公共卫生问题，目前有效的治疗策略较少。阻碍更有效治疗方法开发的一个难题在于，人们对乙醇对行为影响的分子基础仍相对缺乏了解。线虫 Caenorhabditis elegans （C. elegans）为研究乙醇分子效应的假设提供了有用的模型。本文描述了一种已开发并用于研究特定基因和环境因素在乙醇行为反应中作用的检测方法，其中以运动行为作为观测指标。乙醇以剂量依赖的方式引起线虫在琼脂表面爬行活动的急性抑制。这种效应具有动态性：暴露于高浓度乙醇的线虫首先表现出明显的爬行抑制，即本文所称的初始敏感性，随后尽管药物持续存在，其运动速度仍部分恢复。这种由乙醇诱导的行为可塑性在本文中称为急性功能性耐受的形成。该检测方法已被用于证明上述两种表型是独立且在遗传上可分离的。本文所述的简单运动检测方法适用于研究遗传和环境因素对 C. elegans 急性乙醇行为反应的影响。

引言

酒精使用障碍（AUD）普遍存在，并引发严重的健康、社会和经济问题。在人类中，发生 AUD 的易感性在很大程度上受到遗传和环境因素的共同影响1,2。酒精（乙醇）滥用倾向的一个重要生理预测指标是初试饮酒者对乙醇的初始反应水平（LR）3-5。这种 LR 表型受到遗传和非遗传因素的共同影响6。阐明影响乙醇反应水平的分子机制，是乙醇反应行为研究的重要目标。

线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）被越来越多地用作研究乙醇对行为影响的模型7-9。在神经系统功能机制方面，线虫与哺乳动物之间存在高度的分子保守性；已有多个被证实可影响线虫对乙醇镇静作用敏感性（LR）的基因，也被证明会影响哺乳动物对乙醇的敏感性10-16，并被认为与人类酒精滥用倾向相关17-19。

乙醇会使蠕虫中毒，表现为其运动速度降低。多个不同的实验室已开发出多种行为检测方法，这些方法在若干方面存在差异，例如所研究的运动行为（爬行 versus 游泳11,12,14,20,21），或检测所用溶液的组成（线虫生长培养基 versus Dent's 生理盐水20,22）。有趣的是，这些不同的检测方法所得出的乙醇效应剂量-反应曲线存在一定差异。这些结果揭示了爬行与游泳行为背后的重要差异9,23，以及环境变量渗透压在乙醇反应中的作用20，同时也凸显了详细描述各种检测实验条件的重要性。

本文介绍了一种用于测量乙醇对爬行行为急性影响的实验方法。该实验方法已被广泛用于研究遗传和环境因素对乙醇反应性（LR）的影响8,10,20,24,25。哺乳动物的LR表型由至少两个组分构成：对乙醇的初始敏感性和对乙醇的急性功能性耐受26,27。在蠕虫中，通过使用该行为学检测方法，已证明LR表型可分解为这两个独立组分。利用这一单一实验方法，可同时检测遗传和环境干预对这两种表型的影响。重要的是，这两种表型在遗传上是可分离的。

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方案

1. 检测前一天需执行的步骤

  1. 挑取L4期线虫至新鲜的接种有OP50菌苔的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli，并在20℃下培养 ˚C O/N。每个检测条件需要10条线虫；挑选时应多取一些线虫，以弥补过夜培养过程中的线虫损耗。
    1. 仅检测刚成年的第一天成虫；许多突变体的生长速度比野生型慢。对于发育延迟的品系，应调整挑选时间，确保所有被检测的个体均为第一天成虫。

2. 检测当天需执行的步骤

  1. 检测前的准备工作：
    1. 在标准的未接种60 × 15 mm NGM平板上进行实验。将所有待用平板在37℃下干燥 ˚在无盖条件下于 C 培养 2 小时。每次实验重复使用四块干燥的 NGM 平板；这些平板将作为 0 mM 和 400 mM 乙醇检测平板及其对应的适应平板。
      注意：此处使用NGM平板非常重要；平板成分的差异，尤其是其渗透压，会显著影响乙醇对行为的剂量反应，这至少部分归因于动物体内乙醇蓄积量的变化20NGM 琼脂的渗透压为 160 mOsm。
    2. 干燥后，称量每块将用于实验的未接种 NGM 平板，并记录重量。根据空平板的重量确定平板中培养基的体积。为估算琼脂重量与体积的换算关系，可假设培养基的重量与同体积水的重量相等。
      注意：我们发现，当NGM培养基充分脱水至初始10 ml体积干燥后体积介于8.3–8.9 ml之间时，结果最为稳定。作为2小时干燥时间的替代方案，可根据不同培养箱的差异，将干燥时间调整至平板达到该体积范围为止。
    3. 将4个铜环（内径1.6 cm）熔入每块培养板表面，用于分隔不同基因型或处理组的线虫。用镊子夹住每个铜环，在火焰中加热约3秒（本生灯产生的强火焰效果较好）。加热后立即用镊子夹住铜环并将其放置在培养板上，以防止铜环“跳动”。
      1. 用镊子在环的多个位置轻轻下压，确保环平整地贴合在琼脂表面。放置环时，注意留出足够空间以容纳另外三个环。
      2. 将额外的三个铜环熔合到平板表面，注意尽可能使它们彼此靠近，以确保四个铜环均位于相机视野范围内。
        注意：在实验过程中，琼脂与虫圈之间形成良好的密封至关重要，以确保线虫保留在圈内。若虫圈在培养皿上发生移位，则难以与琼脂形成有效密封，还可能划伤琼脂表面，导致线虫钻入琼脂并干扰观察。
      3. 为每块检测板准备一块相应的“适应”板，该板应为干燥且未接种的，并不添加乙醇。在这些板上放置四个铜环。
    4. 在每孔底部靠近环的位置标记将用于该环的线虫品系，注意不要在环本身的视野范围内书写。确保检测板上的标签与其对应的适应板上的标签相匹配。
    5. 计算向每块检测板中添加的100%乙醇量，使乙醇终浓度分别为0 mM或400 mM（质量/体积）。每次实验（n = 1）时，将有一个0 mM和一个400 mM乙醇平板；适应性平板不添加乙醇。使用移液器将乙醇滴加至平板表面各处。用实验室封口膜密封平板，并在室温下静置平衡2小时。
    6. 1.5 小时后，开始进行检测的适应步骤，即步骤 2.2。
  2. 进行运动行为检测：检测平板
    1. 将每个实验组的10条线虫小心转移至驯化平板上铜环的中心位置。用线虫挑针轻轻刮除琼脂表面可见的食物。在不同实验重复中，轮换各实验组上板的顺序，以确保相同品系在线虫上板过程中不会始终以相同顺序被放置。
      注意：转移动物时应尽量减少食物量，因为如果适应性培养板上的食物被带入检测板，线虫会聚集在食物周围，从而掩盖药物对运动能力的影响。
    2. 注意不要用接种针刺破琼脂表面，否则线虫会钻入其中，干扰实验结果。将线虫在室温下孵育30分钟。
    3. 确保每块培养板的启动时间之间有适当的间隔。一名有经验的实验人员可以一次转移40只动物，每环10只，共4环。 < 1.5 分钟，但可长达 2 分钟 可以接受。标准检测的录像时长为10-12分钟。 30至32分钟 0 mM 和 400 mM 乙醇暴露时间
    4. 启动0 mM暴露的驯化平板和400 mM暴露的驯化平板，时间间隔约为2分钟 30 秒 分开保存第一个电影文件，以便在开始第二个电影之前完成保存。
    5. 30 分钟后 适应期结束后，将线虫从适应板转移至检测板。按照线虫添加到适应板的相同顺序，将其转移至检测板（0 mM 或 400 mM 乙醇）中，并记录每块板完成转移的时间间隔。用实验室封口膜密封培养板，以尽量减少乙醇挥发损失。
    6. 使用边缘较薄且已压平的线虫挑取工具，以刮取动作将线虫收集在工具的扁平表面。将线虫从未接种细菌的适应性培养板转移至检测板时，不要使用细菌，尽管细菌通常用于线虫转移过程中以帮助黏附线虫至挑取工具。
      注意：此步骤中转移动物的速度非常重要，因为平板上最先加入的线虫暴露于乙醇的时间将长于最后加入的线虫，较早的时间点可能会表现出一些时间依赖性效应。因此，在不同实验重复中需轮换不同品系在平板上的加样顺序，这是主要原因。
  3. 进行运动能力检测：拍摄
    1. 使用显微镜/相机组合，确保能够在视场内同时成像全部四个环（约42×42 mm）2 方形），例如0.5倍显微物镜、0.8倍放大倍率以及配备2048×2048、7.4 µm 像素 CCD
    2. 在整个视野范围内使用均匀照明，有助于在强度阈值步骤（见下文）中进行物体识别。3英寸×3英寸的背光灯效果良好。
    3. 将线虫置于培养皿中，使培养基一侧朝上（皿盖朝下），以此产生对比度，相较于使用传统显微镜的透射光源，背光照明会丧失该对比度。
    4. 准备图像分析软件以捕获移动线虫的延时录像。将软件设置为每1秒捕获一次12位灰度图像，持续2分钟 （120帧）视频。为减小输出文件大小，同时保持足够的图像分辨率，采用2×2像素合并模式采集1024×1024像素的图像。
    5. 记录视频。开始对第一块培养板（0 mM 乙醇）进行10分钟的120帧视频录制 在将最后一条蠕虫放置到该培养皿上后，保存视频文件。
    6. 记录第二块平板（400 mM 乙醇）。从30分钟开始，对两块平板重复此过程 在将最后一条蠕虫放置于第一块平板（0 mM 乙醇）后，开始采集30–32分钟的数据 每次暴露的时间点
      注意：每次采集后，应在开始记录下一块待分析的培养板之前，留出充足的时间保存图像文件。
    7. 为确保归档影片的长期可用性，并允许这些影片被其他公共领域的开源成像软件程序（如 ImageJ）打开和分析28将每部影片的副本转换为8位256级灰度TIFF文件。
      注意：此处所述的图像分析软件使用专有文件格式。
  4. 使用ImagePro软件分析视频。
    1. 捕获后，使用 Image-Pro Plus 软件或其等效软件分析视频。
      注意：已有多种其他物体追踪软件被成功用于追踪多个 秀丽隐杆线虫 一次29 此类软件可以合理地替代本文所述软件，因为对象识别步骤基于相似的原理。本文所述方法适用于 Image-Pro Plus 软件 6.0-6.3 版本及 7.0 版本，更新版本的 Image-Pro Plus 软件可能存在细微差异。
    2. 分析2分钟内的视频 （120帧）片段。首先对图像应用滤镜，以平整背景并增强线虫目标的对比度。按如下方式选择滤镜：菜单>过程>滤光片>增强>展平：参数：背景 = 暗；特征宽度 = 20 像素。
    3. 滤波处理后需重新保存视频文件，但务必保留原始的未滤波视频。
      1. 分别对每个环中的动物运动进行分析，使用圆形兴趣区域（ROI），将其放置并调整大小以与铜环重叠。通过菜单识别并追踪蠕虫>测量>追踪物体… 命令；此时将弹出“追踪数据表”窗口。“追踪选项”按钮可用于排除特定轨迹并限制任何实验伪影。
    4. 在“自动追踪”选项卡下，使用以下参数：追踪参数：速度限制（搜索半径）= 400 µm/帧，加速度限制 = 自动，最小总轨迹长度 = 400 µm，主导运动类型 = 无序；轨迹对象参数：允许不完整轨迹 = 是，最小长度 = 21 帧，跟踪预测深度 = 1 帧。
    5. 要启动追踪过程，请点击“自动查找所有轨迹”功能按钮，弹出“计数/尺寸”选项对话框和“追踪”对话框。在“计数/尺寸”对话框中，选择“强度范围选择”的“手动”选项，该选项提供关键的阈值步骤，利用线虫像素的灰度强度来突出用于分析的线虫对象，并忽略较亮的背景像素。
      1. 调整强度阈值滑块（一个用于设置上限，一个用于设置下限），以创建一个能够突出显示所有深色物体的包含性范围。在0–4,095的尺度上，将范围设为0–1,500是进行精细调整的良好起点。
      2. 应用大小过滤器，排除大于或小于单条线虫物体的结构，例如铜环以及培养板上的任何碎片。通过“测量”功能设置两个大小参数，以涵盖不同体态下单条线虫的尺寸范围。>在“计数/尺寸”选项对话框中选择“测量”菜单项。（面积范围：28,000–120,000 µm2 周长范围：600–2,500 µm
      3. 若待分析平板上的突变株显著小于或大于其他个体，应在追踪动物之前，先扩大目标识别滤镜设置的范围，以兼容不同品系的体型差异，从而避免在分析过程中中途调整参数。
    6. 在跟踪对话框中单击“继续”以完成跟踪过程。将输出的轨迹与视频中每条线虫的运动过程进行视觉比对，确保每条线虫均有对应轨迹，除非根据自动过滤设置有合理理由将其排除。对于因确认为非线虫物体但满足尺寸过滤条件而产生的轨迹，应手动删除。
    7. 使用软件计算每只蠕虫在每帧之间的运动速度（即每个对象质心每秒移动的距离） 帧之间）并显示每条轨迹的平均速度，以及线虫群体在铜环内所有轨迹的总体平均速度。将此最终的平均值视为 n = 1 表示实验试验次数。将数据导出至电子表格程序，用于统计分析和数据存档。
    8. 在记录完平板上第一个环的数据后，将 ROI 移动到下一个环，并重复跟踪过程，且不更改任何参数。
    9. 通过以下公式计算运动的相对速度：
    10. 相对速度（%）= （处理组（400 mM）速度 / 未处理组（0 mM）速度）× 100
      注意：不同的遗传操作通常会改变动物的基础运动速率。为了确定乙醇对动物运动速度的影响，并能够比较不同基因型或条件下的这些影响，应计算相对速度。

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结果

来自多种不同基因型及其配对对照的代表性数据（图1）已展示8,24；所选数据特别突出了被检测动物之间的差异。暴露10分钟时效应的程度被视为品系的初始敏感性，如图1B-G左侧纵坐标所示。在暴露10分钟时相对运动速度高于对照的突变品系被认为具有乙醇抗性（图1F, G），而相对运动速度低于对照的突变品系则被认为对乙醇具有超敏感性（图1D, E）。图1右侧纵坐标显示了10至30分钟时间段内运动速度的恢复程度。该指标用于衡量急性功能耐受性（AFT）的发展速率，计算方法为30分钟时的相对速度减去10分钟时的相对速度。相较于对照动物，恢复值较大的品系被认为具有更快的AFT发展速率（图1D, F），而恢复值低于对照动物的品系则被认为AFT发展速率较低（图1C, E）。需注意，sbp1(ep79)的测定AFT值（图1G）呈负向恢复趋势，但由于变异较大...

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讨论

C. elegans 具有简单的神经生物学特性以及可用的遗传学工具，使其成为研究乙醇对行为影响的分子基础的理想模型。本文描述了一种已用于鉴定急性乙醇行为反应中多个分子和环境介导因子的实验方法8,10,20,24,25。该方法能够区分并同时检测两种不同的乙醇反应行为表型——初始敏感性和急性功能性耐受的形成，这两者共同模拟了哺乳动物中反应水平的复合表型。相同的实验方法也可轻松改造用于研究其他药理学物质，从而在评估其他药物行为效应时，充分利用多种品系同时测试的优势。

10-12 分钟 时间窗口为测量菌株对乙醇的初始敏感性提供了一个有用的时间点。在前10分钟内分析400 mM乙醇作用效果 暴露时间显示，在乙醇暴露的第二分钟即开始出现速度效应，但直到第七分钟才达到稳定效应状态。 20由于这种对运动速度的时间依赖性效应，特定品系在培养板上的放置顺序将对第八或第九分钟之前的速度测量结果产生重要影响（假设操作耗时少于2分钟） 将所有蠕虫放置于乙醇平板上）。在这些较早的时间点，一些蠕虫受到乙醇的影响更大，仅仅...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

这些研究由美国国立卫生研究院、国家酒精滥用与酒精中毒研究所资助：R01AA016837（JCB）和 P20AA017828（AGD 和 JCB）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
C. elegans 品系秀丽隐杆线虫遗传学中心
60 × 15 mm 三通气培养皿Greiner Bio-One628161其他品牌的培养皿亦可使用。
NGM 琼脂多种供应商NaCl（3 g/L），琼脂（17 g/L），蛋白胨（2.5 g/L），1 ml 胆固醇（5 mg/ml 溶于乙醇），1 ml（1 M）MgSO4，1 ml（1 M）CaCl2，25 ml（1 M）KPO4，pH = 6，975 ml H2O
镊子多种供应商例如，Fisher Scientific #10300
37 °C 培养箱多种供应商用于干燥琼脂
电子天平多种供应商用于测定培养皿重量和琼脂体积
铜环PlumbmasterSTK#35583（48 盖螺纹垫圈）内径 1.6 cm，外径 1.8 cm 的铜环
100% 乙醇多种供应商
Parafilm MBemisPM996
CCD 相机QImagingRET-4000R-F-M-12该相机具有较大的视场。
带 C 接口和 0.5X 物镜的体视显微镜LeicaMZ6已停产型号，M60 为其当前等效型号。
光源SchottA089233”×3” 背光，可实现视场内均匀照明
成像与追踪软件Media CyberneticsImagePro-Plus v6.0-6.3软件的新版本具备追踪功能。

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