一种用于测量乙醇对运动速度影响的检测方法 秀丽隐杆线虫

摘要

C. elegans 是研究乙醇对行为影响的有用模型。本文介绍一种行为检测方法，可定量分析乙醇对爬行线虫运动速度的影响；通过该方法可同时测定线虫对乙醇的初始敏感性及其急性功能耐受性的形成。

摘要

酒精使用障碍是一个重要的公共卫生问题，目前有效的治疗策略较少。阻碍更有效治疗方法开发的一个难题在于，人们对乙醇对行为影响的分子基础仍相对缺乏了解。线虫 Caenorhabditis elegans （C. elegans）为研究乙醇分子效应的假设提供了有用的模型。本文描述了一种已开发并用于研究特定基因和环境因素在乙醇行为反应中作用的检测方法，其中以运动行为作为观测指标。乙醇以剂量依赖的方式引起线虫在琼脂表面爬行活动的急性抑制。这种效应具有动态性：暴露于高浓度乙醇的线虫首先表现出明显的爬行抑制，即本文所称的初始敏感性，随后尽管药物持续存在，其运动速度仍部分恢复。这种由乙醇诱导的行为可塑性在本文中称为急性功能性耐受的形成。该检测方法已被用于证明上述两种表型是独立且在遗传上可分离的。本文所述的简单运动检测方法适用于研究遗传和环境因素对 C. elegans 急性乙醇行为反应的影响。

引言

酒精使用障碍（AUD）普遍存在，并引发严重的健康、社会和经济问题。在人类中，发生 AUD 的易感性在很大程度上受到遗传和环境因素的共同影响^1,2。酒精（乙醇）滥用倾向的一个重要生理预测指标是初试饮酒者对乙醇的初始反应水平（LR）^3-5。这种 LR 表型受到遗传和非遗传因素的共同影响⁶。阐明影响乙醇反应水平的分子机制，是乙醇反应行为研究的重要目标。

线虫秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）被越来越多地用作研究乙醇对行为影响的模型^7-9。在神经系统功能机制方面，线虫与哺乳动物之间存在高度的分子保守性；已有多个被证实可影响线虫对乙醇镇静作用敏感性（LR）的基因，也被证明会影响哺乳动物对乙醇的敏感性^10-16，并被认为与人类酒精滥用倾向相关^17-19。

乙醇会使蠕虫中毒，表现为其运动速度降低。多个不同的实验室已开发出多种行为检测方法，这些方法在若干方面存在差异，例如所研究的运动行为（爬行 versus 游泳^{11,12,14,20,21}），或检测所用溶液的组成（线虫生长培养基 versus Dent's 生理盐水^20,22）。有趣的是，这些不同的检测方法所得出的乙醇效应剂量-反应曲....

方案

1. 检测前一天需执行的步骤

1. 挑取L4期线虫至新鲜的接种有OP50菌苔的线虫生长培养基（NGM）平板上 E. coli，并在20℃下培养 ˚C O/N。每个检测条件需要10条线虫；挑选时应多取一些线虫，以弥补过夜培养过程中的线虫损耗。
   1. 仅检测刚成年的第一天成虫；许多突变体的生长速度比野生型慢。对于发育延迟的品系，应调整挑选时间，确保所有被检测的个体均为第一天成虫。

2. 检测当天需执行的步骤

1. 检测前的准备工作：
   1. 在标准的未接种60 × 15 mm NGM平板上进行实验。将所有待用平板在37℃下干燥 ˚在无盖条件下于 C 培养 2 小时。每次实验重复使用四块干燥的 NGM 平板；这些平板将作为 0 mM 和 400 mM 乙醇检测平板及其对应的适应平板。
      注意：此处使用NGM平板非常重要；平板成分的差异，尤其是其渗透压，会显著影响乙醇对行为的剂量反应，这至少部分归因于动物体内乙醇蓄积量的变化²⁰NGM 琼脂的渗透压为 160 mOsm。
   2. 干燥后，称量每块将用于实验的未接种 NGM 平板，并记录重量。根据空平板的重量确定平板中培养基的体积。为估算琼脂重量与体积的换算关系，可假设培养基的重量与同体积水的重量相等。
      注意：我们发现，当N....

结果

来自多种不同基因型及其配对对照的代表性数据（图1）已展示^8,24；所选数据特别突出了被检测动物之间的差异。暴露10分钟时效应的程度被视为品系的初始敏感性，如图1B-G左侧纵坐标所示。在暴露10分钟时相对运动速度高于对照的突变品系被认为具有乙醇抗性（图1F, G），而相对运动速度低于对照的突变品系则被认为对乙醇具有超敏感性（图1D, E）。图1右侧纵坐标显示了10至30分钟时间段内运动速度的恢复程度。该指标用于衡量急性功能耐受性（AFT）的发展速率，计算方法为30分钟时的相对速度减去10分钟时的相对速度。相较于对照动物，恢复值较大的品系被认为具有更快的AFT发展速率（图1D, F），而恢复值低于对照动物的品系则被认为AFT发展速率较低（图1C, E）。需注意，sbp1(ep79)的测定AFT值（图1G）呈负向恢复趋势，但由于变异较大.......

讨论

C. elegans 具有简单的神经生物学特性以及可用的遗传学工具，使其成为研究乙醇对行为影响的分子基础的理想模型。本文描述了一种已用于鉴定急性乙醇行为反应中多个分子和环境介导因子的实验方法^{8,10,20,24,25}。该方法能够区分并同时检测两种不同的乙醇反应行为表型——初始敏感性和急性功能性耐受的形成，这两者共同模拟了哺乳动物中反应水平的复合表型。相同的实验方法也可轻松改造用于研究其他药理学物质，从而在评估其他药物行为效应时，充分利用多种品系同时测试的优势。

10-12 分钟 时间窗口为测量菌株对乙醇的初始敏感性提供了一个有用的时间点。在前10分钟内分析400 mM乙醇作用效果 暴露时间显示，在乙醇暴露的第二分钟即开始出现速度效应，但直到第七分钟才达到稳定效应状态。 ²⁰由于这种对运动速度的时间依赖性效应，特定品系在培养板上的放置顺序将对第八或第九分钟之前的速度测量结果产生重要影响（假设操作耗时少于2分钟） 将所有蠕虫放置于乙醇平板上）。在这些较早的时间点，一些蠕虫受到乙醇的影响更大，仅仅.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
C. elegans 品系	秀丽隐杆线虫遗传学中心
60 × 15 mm 三通气培养皿	Greiner Bio-One	628161	其他品牌的培养皿亦可使用。
NGM 琼脂	多种供应商		NaCl（3 g/L），琼脂（17 g/L），蛋白胨（2.5 g/L），1 ml 胆固醇（5 mg/ml 溶于乙醇），1 ml（1 M）MgSO4，1 ml（1 M）CaCl2，25 ml（1 M）KPO4，pH = 6，975 ml H2O
镊子	多种供应商		例如，Fisher Scientific #10300
37 °C 培养箱	多种供应商		用于干燥琼脂
电子天平	多种供应商		用于测定培养皿重量和琼脂体积
铜环	Plumbmaster	STK#35583（48 盖螺纹垫圈）	内径 1.6 cm，外径 1.8 cm 的铜环
100% 乙醇	多种供应商
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD 相机	QImaging	RET-4000R-F-M-12	该相机具有较大的视场。
带 C 接口和 0.5X 物镜的体视显微镜	Leica	MZ6	已停产型号，M60 为其当前等效型号。
光源	Schott	A08923	3”×3” 背光，可实现视场内均匀照明
成像与追踪软件	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	软件的新版本具备追踪功能。