本文描述了一种用于纯化下一代测序DNA片段的自动化凝胶大小选择方法。Ranger技术可完全自动化整个琼脂糖凝胶上样、电泳分析及目标DNA片段回收过程，从而实现高通量、高质量的下一代测序文库制备。
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本文内容
摘要
摘要
环境样品的下一代测序可能具有挑战性，因为这些样品中DNA的数量和质量存在较大差异。要获得下一代测序的最佳结果，需要高质量的DNA文库。环境样品（如水样）中的DNA可能含量低、质量差，并含有与DNA共沉淀的污染物。提取和文库制备过程中涉及的机械和酶学操作可能进一步损伤DNA。凝胶片段大小选择可实现特定大小DNA片段的纯化与回收，适用于测序应用。然而，该步骤是DNA文库构建流程中最耗时的环节之一。本文所述方案可实现琼脂糖凝胶上样、电泳分析及目标DNA片段回收的完全自动化。
本研究中，我们描述了一种高通量方法，用于从淡水样品中制备高质量DNA文库，该方法也可应用于其他环境样品。我们采用间接方法从环境淡水样品中富集细菌细胞；使用市售的DNA提取试剂盒提取DNA，并利用基于转座子的商业化建库试剂盒构建DNA文库。通过Ranger Technology（一种自动化电泳工作站）对500至800 bp的DNA片段进行凝胶回收和片段筛选。对片段筛选后的DNA文库进行测序，结果显示测序读长和读段质量均有显著提升。
引言
宏基因组学涉及对样本中所有遗传物质进行测序，以表征存在的微生物群落。该过程复杂且成本较高，包括将提取的核酸转化为DNA文库，随后进行高通量测序。高质量的文库对于获得最大数据产出和准确的宏基因组分析至关重要。环境样本（如水样）常常因DNA含量低且可能已降解1-3，以及存在PCR抑制物4-6，而难以构建高质量文库。
高质量文库理想情况下应包含长度范围较窄且较长的DNA片段。为了最大化每次测序运行所产生的有用数据量，文库中DNA的长度应至少达到所用测序方法最大读长的长度。当使用如Illumina MiSeq等合成测序技术时，DNA片段的大小会影响在流动池上生成簇的效率。例如，当文库中同时含有较短和较长的DNA片段时，较短的片段会在测序数据中被过度代表7,8。相比之下，DNA片段大小均一的文库在测序数据中将呈比例性代表。许多文库制备试剂盒采用基于连接的方法将接头添加到DNA片段上，因此需要进行片段大小选择，以去除不含插入片段的接头二聚体9,10。实现这一目的的方法有多种11,12，但其中结果最一致的技术是通过电泳分离DNA，随后回收目标长度的DNA片段13,14。该过程可手动完成少量样本的处理，但在面对数百个样本时，则需要自动化解决方案。目前可用的自动化凝胶片段大小选择平台通量较低，亟需新的平台以满足大规模测序样本处理的需求。Ranger技术可与现有的液体处理工作站整合，从而能够在满足当前高通量需求的规模上，利用琼脂糖凝胶电泳进行片段大小选择及分析。
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方案
1. 水样采集与过滤
- 从不同地点采集淡水样品（图1）。将样品依次通过一系列滤膜：1 µm 滤膜、0.2 µm 滤膜和 30 kDa 截留分子量的切向流滤膜，以系统分离真核生物、细菌和病毒尺寸的颗粒。
注意：本报告仅描述在 0.2 µm 滤膜上回收物质（自由生活的细菌）的纯化与分析，但类似方法也可用于其他滤膜上回收的颗粒。
2. 细菌浓度测定、DNA 提取与纯化
- 从水过滤系统中移除0.2 µm膜滤器（示意图， 图2将0.2 µm圆盘滤膜对折，放入50 ml离心管中，开口朝上。向管中加入5 ml 1×磷酸盐缓冲液（PBS）和0.01% Tween，pH 7.4。若过程中使用多个滤膜，则每个滤膜应使用独立的离心管。将含滤膜的离心管置于4 °C保存，待后续处理。否则，继续进行步骤2.2。
- 用无菌镊子从50 ml离心管中取出0.2 µm微孔滤膜，将滤膜置于培养皿上（PBS缓冲液保留在离心管中）。
- 使用无菌镊子和无菌剪刀将滤膜剪成小条（1 cm × 1 cm）。在处理不同样品之间，通过将镊子和剪刀浸泡于70%异丙醇、用DNA表面去污剂擦拭并用一级超纯水冲洗的方式进行消毒。
- 将滤膜剪成条状后放回原来的50 ml离心管中。向滤膜中加入10 ml 1×PBS和0.01% Tween，pH 7.4，使50 ml离心管中缓冲液体积总量达到15 ml。
- 向每个50 ml离心管中加入6颗洁净的钨珠（直径3 mm），用Parafilm封口膜封住管口，使用50 ml离心管涡旋振荡适配器剧烈涡旋振荡20 min。若同一份样品需处理多个滤膜，则将所有匀浆液转移至一个洁净的50 ml离心管中并混合。在4 °C条件下，以3,300 x g离心15 min。
- 将菌体沉淀重悬，并分装细菌细胞（每份约1 ml）至1.7 ml微量离心管中。注意每个样本需分装为5管。
- 在10,000 × g下离心微量离心管10分钟，然后移除大部分上清液，保留至约200 µl刻度处。
- 将样品储存于 -80 °C，或按照制造商说明书，使用市售的DNA提取试剂盒提取细菌DNA。在提取细菌DNA过程中，使用PBS或水作为空白提取对照， E. coli 作为阳性提取对照。
- 由于需从多个试管中提取DNA，将同一样本的平行分装 aliquot 汇集至一个2 ml离心管中，然后进行过夜（O/N）处理。 使用由0.1体积3 M醋酸钠、2体积100%乙醇和5 µl 5 µg/µl线性聚丙烯酰胺组成的溶液进行沉淀。充分混匀后，将样品置于-80 °C保存。
- 在 4 °C 条件下以最大速度（17,000 × g）离心 30 分钟。用 1 ml 冰冷的 70% 乙醇洗涤沉淀，在生物安全柜中风干不超过 5 分钟，将 DNA 沉淀重悬于 34 µl 10 mM Tris-Cl（pH 8.5）中。
注意：线性丙烯酰胺有助于在过夜沉淀后观察DNA沉淀。 - 使用高灵敏度荧光核酸定量检测试剂盒和微量分光光度计，分别按照制造商说明书（见材料表）测定DNA的浓度和质量。
注意：若同时制备多个样本，可改用超敏荧光核酸定量法检测双链DNA，并使用基于微孔板的荧光计/分光光度计进行测定。
3. DNA文库构建
- 将从水样中提取的细菌基因组DNA归一化至浓度约为0.2 ng/μl。
- 使用基于转座子的方法（tagmentation）对一纳克细菌DNA进行酶切片段化。按照制造商说明书，将接头和索引序列添加到片段化的DNA上。根据制造商说明书指示，对tagmented样品进行12个循环的PCR扩增，以引入测序索引。
4. 自动化凝胶大小筛选
- 跳过制造商说明书中描述的标准PCR后纯化步骤（参见材料表）。直接使用基于自动化凝胶的片段大小筛选平台对PCR后的样品进行片段选择。
- 向每个样品中加入3.5 μl上样缓冲液。
- 按照制造商的方案，将样品加载到电泳工作站上，指定片段筛选目标为500–800 bp，提取体积为300 μl，使用预制的1.5%琼脂糖胶盒。
- 通过乙醇沉淀将原始洗脱产物（300 μl）浓缩至25 μl。
注意： alternatively，可使用电泳工作站通过滤板和真空装置自动化完成大量样品的浓缩。- 使用0.1倍体积的3 M醋酸钠、2倍体积的100%乙醇以及5 μl的5 µg/µl线性聚丙烯酰胺对原始洗脱体积进行沉淀。充分混匀，将样品置于-80 °C过夜。在17,000 x g离心30分钟。
- 弃去上清液，随后用1 ml冰浴的70%乙醇洗涤DNA沉淀。
- 再次在17,000 x g离心30分钟，弃去上清液，空气干燥，最后将DNA沉淀重悬于25 μl的10 mM Tris-Cl（pH 8.5）中。
- （可选）取1 μl经自动化凝胶片段筛选平台筛选后的DNA文库，用pH 8.0的Tris-EDTA缓冲液进行五倍稀释。根据制造商说明书，使用基于芯片的毛细管电泳仪器分析dsDNA的质量。
5. 文库标准化与测序
- 按照制造商提供的文库制备说明书，使用文库标准化磁珠（转座子文库制备试剂盒中包含）对样本进行标准化处理。
- 或者，使用高灵敏度荧光核酸定量检测法测定双链DNA文库，随后按等摩尔比例混合，使最终双链DNA浓度达到2 nM。取10 μl混合后的文库与10 μl 0.2 N NaOH，室温孵育5分钟以变性文库。用杂交缓冲液（随转座子文库制备试剂盒提供）将变性后的文库稀释至最终体积1 ml、浓度11.5 pM。
- 按照测序仪制造商的标准测序流程，将样本上机进行高通量测序。
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结果
DNA 浓度与质量评估
不同流域采样点的水样中细菌DNA浓度范围为每毫升0.01至0.11 ng（表1）。从细菌组分中提取的DNA，其A260/280和A260/230比值分别为1.4至1.8和0.3至1.6。尽管部分A260/230比值相对较低，但在构建的文库及其他下游应用中未观察到明显的抑制现象。这些应用包括针对16S rRNA和cpn60的PCR和qPCR检测，以及后续的扩增子测序（数据未显示）。
游骑兵技术
采用基于转座子的方法构建DNA文库，并通过高通量自动化平台进行凝胶尺寸筛选，获得了片段大小集中在500–800 bp范围内的紧密分布的DNA片段（图3）。该替代性方案所获得的文库浓度范围为0.3至3.4 ng/μl（表1
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讨论
接头二聚体的存在以及当前测序平台对小片段插入序列的优先簇生成和测序，导致可用数据产出降低和仪器通量未被充分利用15使用珠击法结合基于转座子的方法建库可能导致比其他提取方法产生更多的DNA剪切4,5然而，所有提取和文库制备方法都可能对测序读段的分布引入偏差。8,16使用自动化核酸提取平台结合基于连接的方法进行实验观察时，似乎未能去除鸟枪法文库中过量的接头二聚体（数据未显示）。本研究采用了一种改良的文库制备方案，通过对环境样品中的DNA片段进行特定大小范围的选择，从而最大限度地减少接头二聚体或小片段DNA的残留。利用自动化凝胶片段大小筛选平台，获得了大小在500–800 bp范围内、可重复的DNA文库图谱（图3）。尽管使用标准处理方法（0.5倍比例的磁性 beads）相比其他纯化方法获得了更多的原始 reads（约 150 万）即，2次，0.5倍比例）以及本文所述的改进方案，每个样本中仅有55%的读段长度超过225 bp。而采用改进方案时，每个样本中至少有75%的读段长度超过225 bp。在标准处理中，大量读段的存在表明文库...
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披露
Jared R. Slobodan 和 Matthew J. Nesbitt 均持有 Coastal Genomics 的股份，这是一家位于加拿大不列颠哥伦比亚省的私营公司，提供 Ranger 技术。
致谢
本工作由Genome BC、Genome Canada和Coastal Genomics资助。作者感谢Kirby Cronin和Michael Chan在样品采集与处理方面的帮助。我们还要感谢Thea Van Rossum和Fiona Brinkman博士在生物信息学分析方面的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Masterflex P/S 1400 系列蠕动泵 | Thermo Scientific | 1400-1620 | |
| 0.2 µm Supor 滤膜 | VWR | CA28143-969 | Pall Corporation, Ann Harbor, MI |
| 碳化钨珠，3 mm（200 个） | Qiagen | 69997 | |
| 70% 异丙醇 | Jedmon Products | 825751 | Healthcare Plus |
| DNA away | VWR | 7010 | Molecular BioProducts, Inc. San Diego, CA |
| Milli-Q 水纯化系统 | Fisher Scientific | ZMQS6VF0Y | Merck Millipore。该产品已停产。 |
| 20x PBS，pH 7.5 | VWR | E703-1L | Amresco, Inc., Solon, OH |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337-100 | Fisher chemicals |
| 适用于 2 支（50 ml）离心管的涡旋振荡器适配器 | VWR | 13000-V1-50 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Vortex-Genie 2，120 V（型号 G560） | VWR | SI-0236 | Scientific Industries, Inc. |
| Beckman 离心机 | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd | 型号 J-6B | |
| PowerLyzer Powersoil DNA 提取试剂盒 | VWR | 12855-100 | MoBio, Carlsbad, CA |
| 适用于 24 支（1.5–2 ml）离心管的涡旋振荡器适配器 | VWR | 13000-V1-24 | MoBio, Carlsbad, CA |
| Microfuge 18 离心机 | Beckman Coulter | 367160 | |
| 配备 Ranger 技术的 Nimbus Select 工作站 | Hamilton Robotics | 92720-01 | 包含液体处理工作站和集成的 Ranger Tech（电泳硬件） |
| Ranger 试剂盒 | Coastal Genomics | CG-10600-150-12-21 | 包含上样缓冲液和卡盒 |
| 乙醇（无水） | Commercial Alcohols | P016EAAN | Greenfield Ethanol |
| 乙酸钠 | Sigma-Aldrich | S2889-250G | |
| 线性丙烯酰胺（5 mg/ml） | Life Technologies | AM9520 | Ambion |
| Eppendorf 冷冻离心机 | Raeyco Lab Equipment Systems Management Ltd. | 5417R | |
| 缓冲液 EB（250 ml） | Qiagen | 19086 | |
| NanoDrop 1000 分光光度计 | Thermo Scientific | ND-1000 | |
| Qubit 荧光计 | Life Technologies | Q32857 | Invitrogen。该产品已停产。 |
| Qubit dsDNA HS 检测试剂盒 | Life Technologies | Q32854 | Invitrogen |
| 高灵敏度 DNA 试剂 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| 高灵敏度 DNA 芯片 | Agilent Technologies | 5067-4626 | |
| Agilent 2011 生物分析仪 | Agilent Technologies | G2938B | |
| Nextera XT DNA 样品制备试剂盒 | Illumina | FC-131-1024 | |
| Nextera XT Index 试剂盒 | Illumina | FC-131-1001 | |
| MiSeq 试剂盒 v2（500 个循环） | Illumina | MS-102-2003 | |
| MiSeq 系统 | Illumina | SY-410-1003 |
参考文献
- Siuda, W., Chrost, R. J. Concentration and susceptibility of dissolved DNA for enzyme degradation in lake water - some methodological remarks. Aquatic Microbial Ecology. 21, 195-201 (2000).
- Butler, J. M., Hill, C. R. Scientific Issues with Analysis of Low Amounts of DNA. , Available from: http://www.promega.ca/resources/profiles-in-dna/2010/scientific-issues-with-analysis-of-low-amounts-of-dna (2010).
- Ficetola, G. F., Miaud, C., Pompanon, F., Taberlet, P. Species detection using environmental DNA from water samples. Biology letters. 4, 423-425 (2008).
- Liles, M. R., et al. Recovery, purification, and cloning of high-molecular-weight DNA from soil microorganisms. Applied and environmental microbiology. 74, 3302-3305 (2008).
- Bey, B. S., Fichot, E. B., Dayama, G., Decho, A. W., Norman, R. S. Extraction of high molecular weight DNA from microbial mats. BioTechniques. 49, 631-640 (2010).
- Tebbe, C. C., Vahjen, W. Interference of humic acids and DNA extracted directly from soil in detection and transformation of recombinant DNA from bacteria and a yeast. Applied and environmental microbiology. 59, 2657-2665 (1993).
- Solonenko, S. A., et al. Sequencing platform and library preparation choices impact viral metagenomes. BMC genomics. 14, 320(2013).
- Aird, D., et al. Analyzing and minimizing PCR amplification bias in Illumina sequencing libraries. Genome biology. 12, R18(2011).
- Quail, M. A., Swerdlow, H., Turner, D. J., et al. Improved protocols for the illumina genome analyzer sequencing system. Current protocols in human genetics / editorial board, Jonathan L. Haines .. [et al.]. 18, 18(2009).
- Head, S. R., et al. Library construction for next-generation sequencing: overviews and challenges. BioTechniques. 56, 61-64, 66, 68 (2014).
- Dijk, E. L., Jaszczyszyn, Y., Thermes, C. Library preparation methods for next-generation sequencing: tone down the bias. Experimental cell research. 322, 12-20 (2014).
- Grunenwald, H., Baas, B., Caruccio, N., Syed, F. Rapid, high-throughput library preparation for next-generation sequencing. Nature Methods. 7, (2010).
- Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular cloning : a laboratory manual. , 3rd edn, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring, NY. (2001).
- Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments. Journal of visualized experiments. , (2012).
- Quail, M. A., et al. A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system. Nature methods. 5, 1005-1010 (2008).
- Marine, R., et al. Evaluation of a transposase protocol for rapid generation of shotgun high-throughput sequencing libraries from nanogram quantities of DNA. Applied and environmental microbiology. 77, 8071-8079 (2011).
- Rohland, N., Reich, D. Cost-effective high-throughput DNA sequencing libraries for multiplexed target capture. Genome research. 22, 939-946 (2012).
- Lamble, S., et al. Improved workflows for high throughput library preparation using the transposome-based nextera system. Bmc Biotechnology. 13, (2013).
- Picelli, S., et al. Tn5 transposase and tagmentation procedures for massively scaled sequencing projects. Genome research. , (2014).
- Rhodes, J., Beale, M. A., Fisher, M. C. Illuminating Choices for Library Prep: A Comparison of Library Preparation Methods for Whole Genome Sequencing of Cryptococcus neoformans Using Illumina HiSeq. PloS One. 9, e113501(2014).
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