简化的人类中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）分离与处理

摘要

在以下实验方案中，我们描述了一种使用常规试剂从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的极为简便的方法。随后，我们展示了如何将分离得到的NETs用于一项 体外 癌细胞黏附实验

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）最近被确认为中性粒细胞抗菌防御机制的一部分。除了在抗感染中的作用外，近期研究还表明，NETs可能参与多种其他疾病过程，包括癌症进展。分离纯化的NETs是研究这些功能的关键步骤。

在本视频中，我们演示了一种使用 readily available 试剂从人全血中简化分离无细胞 NET 的方法。分离得到的 NET 可用于免疫荧光染色、印迹或各种功能检测。该方法能够在排除中性粒细胞自身潜在干扰效应的情况下，对其生物学特性进行评估。

采用密度梯度分离技术从健康供体全血中分离中性粒细胞。分离得到的中性粒细胞随后经佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激以诱导NETosis。激活后的中性粒细胞被弃去，获得无细胞的NET储备液。

随后，我们演示如何将分离的NETs用于与A549人肺癌细胞的黏附实验。将NET原液用于包被96孔细胞培养板的孔，过夜（O/N）；在确认孔底部形成充分的NET单层后，加入CFSE标记的A549细胞。使用尼康TE300荧光显微镜对黏附细胞进行定量。在部分孔中，在计数前10分钟加入1000U DNA酶1以降解NETs

引言

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一类新发现的由中性粒细胞释放的结构，由附着数百种蛋白质和组蛋白的细胞外DNA链组成。在感染和炎症过程中，中性粒细胞在特定刺激下分泌NETs，最初被认为属于中性粒细胞抗感染防御机制的一部分。研究首次证实NETs可促进捕获多种微生物入侵者，包括细菌、病毒和真菌^1-3。微生物被捕获后，可被NET相关蛋白直接杀灭^3,4，也可通过局部募集吞噬细胞间接清除^5,6。然而，NETs的作用似乎不仅限于宿主防御。近年来研究发现，其在自身免疫性疾病^7,8、血栓形成⁹、妊娠相关疾病¹⁰以及癌症进展^11,12中均发挥重要作用。因此，NETs似乎在多种不同的生理过程中具有重要影响。然而，鉴于该研究领域较新，NETs发挥其效应的具体机制仍有待进一步阐明。本文介绍一种在无中性粒细胞条件下分离NETs的简化方法。

在以下视频中，我们展示了一种简化且简便的技术，用于从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。游离的NETs随后可用于多种实验 体外 包括染色、免疫荧光、印迹以及黏附、增殖和迁移等多种检测实验。其他方案也存在 ^{13, 19}然而，这些方法通常耗时较长、步骤复杂、成本高昂，且常常产率较低 ¹³该简化方案使用基础试剂并减少了分离中性粒细胞所需的步骤，从而在....

方案

注意：所有实验均按照当地机构的伦理指南进行。

1. 采血

1. 通过肘前静脉穿刺，从健康志愿者体内采集14管血液至绿色管帽（含肝素）试管中，采集后立即轻轻颠倒混匀各试管，然后置于冰上。实验前10至15分钟内完成采血，以确保获得最佳的中性粒细胞产量。

2. 从全血中分离中性粒细胞

1. 用 5 ml 不含 Ca 和 Mg 的 PBS 洗涤每管绿色管盖的血液，以稀释血液。在 4 个 50 ml 离心管中，各加入 15 ml 室温的淋巴细胞分离液（LSM）。使用安装在 60 ml 注射器上的 18 G 针头，将稀释后的血液小心地铺加到 LSM 上，形成清晰的 LSM-血液界面。
   注意：尽量避免各层混合。
2. 在 21 °C 下以 800 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。
   注意：突然停止会导致不同层之间的混合。
3. 观察红细胞和中性粒细胞沉淀至管底。吸除并弃去上层两层（血浆和 LSM），注意去除含有淋巴细胞和单个核细胞的界面层，仅保留底部的红色沉淀层。
4. 向每管中加入 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）和 20 ml 6% 右旋糖酐溶液。轻轻颠倒混匀，使液体与红细胞和中性粒细胞层充分混合，室温静置 30 分钟。
   注意：此步骤可使红细胞（RBCs）沉淀至管底。

结果

成功完成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的静态黏附实验，要求在加入癌细胞之前，孔板内已充分包被形成单层的 NETs（图1）。所有后续操作步骤均需小心进行，避免破坏该层结构。当形成足够量的 NETs 层时，应可观察到大量癌细胞黏附于 NETs，如图2A和2C所示。该黏附效应可被 DNAse1 消除，因其可降解 NETs，如图2B和2D所示。相反，在使用溶剂对照时，A549 细胞对 NETs 的黏附不应出现显著下降（图3）。为准确估算每个高倍视野（hpf）下的平均癌细胞黏附数量，建议每孔至少计数4个随机选取的高倍视野。由于技术原因导致 NETs 包被不充分的视野不应纳入计数范围，以免造成结果偏差。

讨论

本视频展示的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）分离方案结合了文献中用于中性粒细胞分离和NET形成的多种技术。该方法简化了一个原本较为复杂且多变的过程，提供了一种可靠且可重复性高的纯化无细胞NET分离方法，步骤少于其他现有方案。此外，本方案使用常规易得的试剂，进一步提高了操作的简便性，并显著降低了成本。将分离得到的NET应用于静态黏附实验，可体现该分离技术的灵活性，因为NET的浓度可轻松调节以满足特定实验需求（17）。因此，通过本方案分离的NET可用于多种类型的实验分析，包括动态黏附实验、迁移实验、增殖实验、免疫荧光与共聚焦成像、电子显微镜观察、流式细胞术以及传统的蛋白质印迹（Western blotting）。

本方案中有多个步骤对实验成功至关重要。首先，中性粒细胞在分离过程中可能意外被激活，从而导致凋亡。因此，必须在生物安全柜中进行无菌操作，避免剧烈混匀离心管，红细胞裂解步骤后所有样品均需置于冰上，并避免各步骤之间长时间等待。其次，如果实验目的是包被孔板以评估细胞黏附，则必须严格遵守每孔建议的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）浓度以及“NET 原液”中建议的最终 DNA 浓度，以确保形成.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’不含氯化钙和氯化镁的改良型磷酸盐缓冲液（PBS）	Wisent	311-425-CL
淋巴细胞分离液（LSM）	Wisent	305-010-CL
盐酸葡聚糖（粉末）	光谱	DE130	6% 葡聚糖溶液通过在含 Ca 和 Mg 的 PBS 中添加 6% 葡聚糖粉末配制而成
含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	Wisent	350-000-CL	3% RPMI 溶液通过在 RPMI 中添加 3% 胎牛血清制备
BD Pharm Lyse 溶血缓冲液	BD 生物科学	555899
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
DNA酶1	罗氏	11284932001
F12 DMEM	维森特	319-075-CL
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
带20毫米网格的完整组织培养皿（150 x 25 mm）	Falcon	353025