简化的人类中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）分离与处理

摘要

在以下实验方案中，我们描述了一种使用常规试剂从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（Neutrophil Extracellular Traps, NETs）的极为简便的方法。随后，我们展示了如何将分离得到的NETs用于一项 体外 癌细胞黏附实验

摘要

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）最近被确认为中性粒细胞抗菌防御机制的一部分。除了在抗感染中的作用外，近期研究还表明，NETs可能参与多种其他疾病过程，包括癌症进展。分离纯化的NETs是研究这些功能的关键步骤。

在本视频中，我们演示了一种使用 readily available 试剂从人全血中简化分离无细胞 NET 的方法。分离得到的 NET 可用于免疫荧光染色、印迹或各种功能检测。该方法能够在排除中性粒细胞自身潜在干扰效应的情况下，对其生物学特性进行评估。

采用密度梯度分离技术从健康供体全血中分离中性粒细胞。分离得到的中性粒细胞随后经佛波酯12-肉豆蔻酸13-乙酸酯（PMA）刺激以诱导NETosis。激活后的中性粒细胞被弃去，获得无细胞的NET储备液。

随后，我们演示如何将分离的NETs用于与A549人肺癌细胞的黏附实验。将NET原液用于包被96孔细胞培养板的孔，过夜（O/N）；在确认孔底部形成充分的NET单层后，加入CFSE标记的A549细胞。使用尼康TE300荧光显微镜对黏附细胞进行定量。在部分孔中，在计数前10分钟加入1000U DNA酶1以降解NETs

引言

中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）是一类新发现的由中性粒细胞释放的结构，由附着数百种蛋白质和组蛋白的细胞外DNA链组成。在感染和炎症过程中，中性粒细胞在特定刺激下分泌NETs，最初被认为属于中性粒细胞抗感染防御机制的一部分。研究首次证实NETs可促进捕获多种微生物入侵者，包括细菌、病毒和真菌^1-3。微生物被捕获后，可被NET相关蛋白直接杀灭^3,4，也可通过局部募集吞噬细胞间接清除^5,6。然而，NETs的作用似乎不仅限于宿主防御。近年来研究发现，其在自身免疫性疾病^7,8、血栓形成⁹、妊娠相关疾病¹⁰以及癌症进展^11,12中均发挥重要作用。因此，NETs似乎在多种不同的生理过程中具有重要影响。然而，鉴于该研究领域较新，NETs发挥其效应的具体机制仍有待进一步阐明。本文介绍一种在无中性粒细胞条件下分离NETs的简化方法。

在以下视频中，我们展示了一种简化且简便的技术，用于从人全血中分离中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）。游离的NETs随后可用于多种实验 体外 包括染色、免疫荧光、印迹以及黏附、增殖和迁移等多种检测实验。其他方案也存在 ^{13, 19}然而，这些方法通常耗时较长、步骤复杂、成本高昂，且常常产率较低 ¹³该简化方案使用基础试剂并减少了分离中性粒细胞所需的步骤，从而在最大程度提高得率的同时缩短了操作时间。

以下方法结合了文献中先前描述的多种中性粒细胞分离技术，以获得一种可得到高纯度活中性粒细胞的简便方案。根据文献建议，静脉血采集至含EDTA的采血管中，并在10分钟内使用，以避免中性粒细胞被激活¹⁴。我们采用淋巴细胞分离液（Lymphocyte Separation Media, LSM）密度梯度离心法，从肝素抗凝全血中分离粒细胞和红细胞，该方法改进自Boyum等人最初描述的Ficoll密度梯度离心技术¹⁵。LSM是对Boyum配方的改良，以碘酞酸钠替代了甲基泛影酸钠，已在多项研究中成功用于中性粒细胞的分离^16-18。

经密度梯度离心后，弃去单核细胞和淋巴细胞；随后使用6%右旋糖酐溶液沉降红细胞¹⁴，并裂解残留的红细胞，以获得纯化的中性粒细胞群体，通过台盼蓝和亚甲蓝染色验证其纯度。

多种试剂已被用于诱导 NETosis 体外 和 体内包括脂多糖（LPS）、佛波酯（PMA）和白细胞介素（IL-8） ^3,5,6在以下实验方案中，分离的中性粒细胞用 500 nM PMA 刺激 4 小时，该浓度已被证明足以诱导稳定且可重复的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）形成，同时不促进细胞凋亡。 ^19,20.

分离后，我们展示如何将本方案获得的无细胞中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）用于黏附实验。如先前所述，使用DNA酶1（DNAse1）消化并降解NETs，从而作为对照^2,3,11。其他可选方案包括使用中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂（NEi）来抑制NET的形成，当实验目标是抑制NET的生成而非促进其降解时，这是一种可接受的替代方法¹¹。尽管NEi具有多种不同功能，但已有研究证实，NEi可通过阻断染色质去浓缩、核颗粒释放以及中性粒细胞死亡等过程来抑制NET的沉积¹²

方案

注意：所有实验均按照当地机构的伦理指南进行。

1. 采血

1. 通过肘前静脉穿刺，从健康志愿者体内采集14管血液至绿色管帽（含肝素）试管中，采集后立即轻轻颠倒混匀各试管，然后置于冰上。实验前10至15分钟内完成采血，以确保获得最佳的中性粒细胞产量。

2. 从全血中分离中性粒细胞

1. 用 5 ml 不含 Ca 和 Mg 的 PBS 洗涤每管绿色管盖的血液，以稀释血液。在 4 个 50 ml 离心管中，各加入 15 ml 室温的淋巴细胞分离液（LSM）。使用安装在 60 ml 注射器上的 18 G 针头，将稀释后的血液小心地铺加到 LSM 上，形成清晰的 LSM-血液界面。
   注意：尽量避免各层混合。
2. 在 21 °C 下以 800 × g 离心 30 分钟，不启用刹车。
   注意：突然停止会导致不同层之间的混合。
3. 观察红细胞和中性粒细胞沉淀至管底。吸除并弃去上层两层（血浆和 LSM），注意去除含有淋巴细胞和单个核细胞的界面层，仅保留底部的红色沉淀层。
4. 向每管中加入 20 ml 磷酸盐缓冲液（PBS）和 20 ml 6% 右旋糖酐溶液。轻轻颠倒混匀，使液体与红细胞和中性粒细胞层充分混合，室温静置 30 分钟。
   注意：此步骤可使红细胞（RBCs）沉淀至管底。
5. 30 分钟后，将富含中性粒细胞的上清液转移至新管中，弃去红细胞沉淀。将上清液在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。离心后弃去上清液，沉淀物主要为中性粒细胞，含少量红细胞。
6. 通过将 0.5 ml 裂解缓冲液加入 4.5 ml 无菌水中配制裂解液。用配制好的 5 ml 裂解液裂解残留的红细胞，将所有重悬的沉淀转移至同一管中。室温避光孵育 10 分钟以完成裂解。
7. 在 4 °C 下以 450 × g 离心 5 分钟。弃去上清液，用 5 ml 不含 Ca 和 Mg 的 PBS 重悬沉淀，并再次在 4 °C 下以 450 × g 离心，以彻底去除残留的裂解液。此时所得沉淀即为中性粒细胞。将沉淀重悬于 30 ml 冰冷的 3% RPMI 中，并置于冰上。
   注意：3% RPMI 是通过在 RPMI 培养基中添加 3% 胎牛血清（FBS）配制而成。
8. 使用亚甲蓝染色验证样品纯度。>95% 的细胞应为具有多叶核的粒细胞。使用台盼蓝染色验证细胞活力>95%，并计数最终的中性粒细胞产量。用冰上预冷的 3% RPMI 稀释中性粒细胞，使其最终浓度为 5 × 10⁶ 个中性粒细胞/ml。

3. NETs 的生成

1. 每30 ml中性粒细胞溶液中加入500 nM PMA刺激，并在37 °C、5% CO₂条件下，于带有20 mm网格的150 x 25 mm平底组织培养皿中孵育4小时，以诱导NETosis。
2. 刺激4小时后，轻柔吸除并弃去培养基，保留底部附着的NETs和中性粒细胞层，切勿破坏该层。
3. 每皿使用总共15 ml不含Ca和Mg的冷PBS，通过移液器将15 ml PBS加至皿底，冲洗皿底以完全脱离所有附着物质。
4. 将每皿洗涤所得溶液（步骤3.3）收集至15 ml锥形管中，在4 °C条件下以450 × g离心10分钟。中性粒细胞及任何残留细胞将形成沉淀，上清液则为无细胞、富含NETs的组分。
5. 将上清液分装至1.5 ml微量离心管中，在4 °C条件下以18,000 × g离心10分钟，使所有DNA沉淀。
   注意：若普通离心机可达到此类高转速，则使用较大体积离心管更为便捷且省时；否则需将上清液分装至较小离心管中，以便使用高速微量离心机。
6. 弃去上清液，将所有沉淀合并后重悬于冰上预冷的PBS中，调整浓度至每100 μl PBS中含有2 × 10⁷个中性粒细胞。由此获得可用于后续实验的无细胞NET储备液。
7. 使用分光光度法或其他DNA定量工具测定所获样品中的DNA浓度。样品中DNA浓度应介于140 – 180 ng/μl之间，视为合适。

4. NET-肿瘤细胞静态黏附实验

1. 在96孔平底板中每孔加入100 μl先前获得的NET原液，4 °C避光过夜孵育，使孔板包被。
2. 12 至 20 小时 随后，在显微镜下观察验证孔底部是否形成均匀的无细胞中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）单层。图1此时，轻柔地吸出孔中所有非黏附性物质，注意不要破坏底部的NET单层。
3. 每孔加入 100 μl 1% 牛血清白蛋白（BSA）封闭液，室温孵育 1 h。
4. 使用2 ml 0.25%胰蛋白酶溶液从T-75培养瓶中消化A549癌细胞。细胞脱落后，加入10 ml A549培养基终止消化，于4 °C、450 × g离心5 min。弃上清，将细胞沉淀重悬于培养基中，调整细胞浓度至2 × 10⁶ cells/ml⁴ 每100 μl培养基中的癌细胞数
   注意：A549 细胞单独培养。简言之，细胞在含 10% 胎牛血清和 1% 青霉素-链霉素的 DMEM F12 培养基中培养并维持，于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。₂待细胞融合度达到70 - 80%时，使用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化并脱离细胞，然后重悬于上述相同的培养基中。
5. 使用CFSE对癌细胞进行染色，每毫升培养基中加入1 μl CFSE，在室温下染色10分钟。染色完成后，在4 °C条件下以450 × g离心5分钟，弃去上清液，将细胞重悬于初始体积的培养基中，使细胞浓度达到2 × 10⁶个/mL。⁴ 每100 μl培养基中的癌细胞数
6. 孵育1小时以阻断NETs后，轻柔吸除阻断液，加入2×10⁴ 将相当于每孔100 μl的含癌细胞培养基加入NET单层上方，于37 °C、5% CO₂条件下孵育90分钟，使细胞贴壁。₂轻轻吸出细胞，每孔加入100 μl PBS，以洗涤未贴壁的细胞。
7. 在部分孔中，加入1000 U的DNAse1，每孔100 μl，作用10分钟，以降解NETs，作为阴性对照。在其他孔中，每孔加入100 μl无菌水，作用10分钟，作为溶剂对照（VC）。
   注意：每个条件通常设置3个重复，以增加样本量。
8. 吸弃并移除各孔中的全部溶液，仅保留底部的中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）和贴壁的癌细胞。每孔加入100 μl 4%多聚甲醛溶液，以固定贴壁癌细胞与NETs的结合结构，并在荧光显微镜下读取实验结果。图1）。绘制并分析结果（图3).

结果

成功完成中性粒细胞胞外诱捕网（NETs）的静态黏附实验，要求在加入癌细胞之前，孔板表面已充分包被一层完整的NETs单层（图1）。后续所有操作步骤均需谨慎进行，以避免破坏该层结构。当形成足够量的NETs层时，应观察到大量癌细胞黏附于NETs，如图2A 和2C所示。该黏附效应可被DNAse1消除，因其可降解NETs，如图2B 和2D所示。相反，在使用溶剂对照时，A549细胞对NETs的黏附不应出现显著下降（图3）。为准确估算每个高倍视野（hpf）下的平均癌细胞黏附数量，建议每孔至少计数4个随机选取的高倍视野。由于技术问题导致NETs包被不充分的视野不应纳入计数范围，以免干扰实验结果。

讨论

本视频展示的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）分离方案结合了文献中用于中性粒细胞分离和NET形成的多种技术。该方法简化了一个原本较为复杂且多变的过程，提供了一种可靠且可重复性高的纯化无细胞NET分离方法，步骤少于其他现有方案。此外，本方案使用常规易得的试剂，进一步提高了操作的简便性，并显著降低了成本。将分离得到的NET应用于静态黏附实验，可体现该分离技术的灵活性，因为NET的浓度可轻松调节以满足特定实验需求（17）。因此，通过本方案分离的NET可用于多种类型的实验分析，包括动态黏附实验、迁移实验、增殖实验、免疫荧光与共聚焦成像、电子显微镜观察、流式细胞术以及传统的蛋白质印迹（Western blotting）。

本方案中有多个步骤对实验成功至关重要。首先，中性粒细胞在分离过程中可能意外被激活，从而导致凋亡。因此，必须在生物安全柜中进行无菌操作，避免剧烈混匀离心管，红细胞裂解步骤后所有样品均需置于冰上，并避免各步骤之间长时间等待。其次，如果实验目的是包被孔板以评估细胞黏附，则必须严格遵守每孔建议的中性粒细胞胞外诱捕网（NET）浓度以及“NET 原液”中建议的最终 DNA 浓度，以确保形成...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
杜尔贝科’不含氯化钙和氯化镁的改良型磷酸盐缓冲液（PBS）	Wisent	311-425-CL
淋巴细胞分离液（LSM）	Wisent	305-010-CL
盐酸葡聚糖（粉末）	光谱	DE130	6% 葡聚糖溶液通过在含 Ca 和 Mg 的 PBS 中添加 6% 葡聚糖粉末配制而成
含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基	Wisent	350-000-CL	3% RPMI 溶液通过在 RPMI 中添加 3% 胎牛血清制备
BD Pharm Lyse 溶血缓冲液	BD 生物科学	555899
佛波醇-12-肉豆蔻酸酯-13-乙酸酯（PMA）	Sigma-Aldrich	P8139
DNA酶1	罗氏	11284932001
F12 DMEM	维森特	319-075-CL
胎牛血清（FBS）	Wisent	080-150
青霉素/链霉素	Gibco	15140-122
CFSE	Invitrogen	C1157
0.25% 胰蛋白酶-EDTA	Gibco	25200-056
带20毫米网格的完整组织培养皿（150 x 25 mm）	Falcon	353025