本手稿描述了一种由正常原代人食管成纤维细胞和鳞状上皮细胞在脱细胞猪源支架内接种培养而构建的组织工程三维食管结构，介绍了其制备方法、表征结果及潜在应用。研究结果表明，该结构可形成成熟的复层上皮，类似于正常人食管组织。
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本文内容
摘要
摘要
食管腺癌及其癌前病变巴雷特食管的发病率在西方世界正迅速上升。此外，食管腺癌通常预后较差，近年来生存率几乎没有改善。这些疾病难以研究，且一直缺乏合适的实验平台来探究食管黏膜的病变。
MacNeil 实验室已开发出一种人类食管黏膜模型，该模型与传统的二维细胞培养系统不同，能够重现细胞间及细胞与基质间的相互作用 体内 并形成类似于正常人食管的成熟、分层上皮。简而言之，该模型利用未转化的正常原代人食管成纤维细胞和上皮细胞，在猪源性去细胞食管支架内进行培养。通过CK4、CK14、Ki67和兜甲蛋白（involucrin）染色对该模型进行免疫组织化学表征，结果表明其能够准确再现正常人食管黏膜的组织学特征。
该模型提供了一个稳定且具有生物学相关性的人类食管黏膜实验模型。可通过该模型轻松探究多种研究问题，包括药物制剂的有效性以及酒精、毒素、高温或胃食管反流物成分等环境因素暴露的影响。此外，该模型支持较长期的培养，这是传统二维细胞培养所无法实现的，从而能够 例如研究特定因子对成熟上皮反复暴露长达20天的影响。此外，该模型还可整合多种细胞系，例如源自食管肿瘤或巴雷特化生的细胞系，以在更具生物学相关性的环境中研究肿瘤侵袭和药物反应性等过程。
引言
食管黏膜由位于结缔组织层（即固有层）上方的复层鳞状上皮构成，是最早接触摄入性环境应激原的部位之一。饮食毒素的暴露与食管鳞状细胞癌的发生相关，而十二指肠胃食管反流则是巴雷特化生发病机制中的关键因素，后者与进展为食管腺癌的风险增加相关。食管癌是全球第8位常见恶性肿瘤th 英国男性中最常见的恶性肿瘤，且食管腺癌在西方世界正迅速增加1此外，该疾病的预后改善甚微，总体5年生存率约为15%。因此，亟需建立实验平台，以研究环境应激因素对食管上皮的影响，及其在化生或肿瘤发生中的潜在作用。
尽管永生化细胞系或肿瘤细胞系可使研究人员研究上皮细胞对这些应激因素的反应 体外它们仍保持增殖状态，无法分化为食管黏膜最表层所存在的成熟上皮细胞。此外，已经发生肿瘤转化的细胞系可能仅能提供有限信息，用以了解正常上皮细胞在早期阶段对环境因素刺激的初始反应；而这一阶段恰恰可能是治疗干预潜力最高的时机。最后，传统的细胞培养系统无法模拟组织中上皮细胞与间充质细胞之间，以及这些细胞与周围基质之间可能存在的关键相互作用。 体内.
动物模型为研究食管上皮的反应提供了更接近真实的微环境，并可人为诱导胃食管反流病2。然而，在这些模型中调控环境应激因素可能更具挑战性，且其反应可能无法完全代表人体食管内的实际情况。
已开发出其他利用原代细胞、永生化细胞或肿瘤细胞系的人类食管实验模型，这些模型以含有成纤维细胞的胶原蛋白或混合胶原蛋白/Matrigel支架为基础3,4。与本文所述的脱细胞猪食管支架相比，制备此类支架所需劳动强度较低，且这些类器官模型提供了有用的工具，尤其适用于肿瘤侵袭研究5,6，因为在这些模型中可直接观察肿瘤细胞向胶原凝胶中的浸润过程。然而，这些胶原凝胶具有非天然的力学特性，并缺乏原始组织的某些特征，包括特定的基底膜结构和适当的表面拓扑结构。这可能影响细胞行为，例如使用胶原凝胶支架时，上皮与支架之间的黏附性较差7。因此，人们开发了脱细胞猪食管支架，其优势在于生物学特性更接近真实组织，因而更适合作为实验平台。此外，已有研究表明，在食管构建物中使用原代细胞优于使用永生化的食管上皮细胞系（如Het-1A），因为后者虽能形成多层上皮，但无法正常分层或分化4,7,8。
因此，本实验方案改编自MacNeil实验室已有的构建组织工程化皮肤和口腔黏膜的方法9,10，并结合了脱细胞猪食管支架与原代人食管上皮细胞及成纤维细胞。该方案可生成成熟的、分层的上皮结构，其特征与正常人食管上皮相似，经CK4、CK14、Ki67和兜甲蛋白（involucrin）染色证实。所建立的模型为研究环境应激因素的反应提供了实验平台，并已成功用于探究食管上皮在接触胃食管反流物成分后基因表达的变化11。
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方案
人食管细胞取自接受胃部或食管手术的患者。已获得患者知情同意，允许将组织用于科研目的，并在相应的伦理批准（SSREC 165/03，人类研究组织库许可证 12179）下匿名使用该组织。
1. 人食管上皮细胞的分离
- 在超净工作台内操作，并采用无菌技术，通过将DMEM（Dulbecco改良Eagle培养基）与Ham’s F12培养基按3:1（v:v）体积比混合，配制上皮细胞培养基。加入10%（v/v）胎牛血清（FCS）、10 ng/ml表皮生长因子、0.4 µg/ml氢化可的松、1.8 x 10-4 M 腺嘌呤、5 µg/ml胰岛素、5 µg/ml转铁蛋白、2 x 10-7 M 三碘甲腺原氨酸、1 x 10-10 M 霍乱毒素、2 x 10-3 M 谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B。
- 采用标准无菌技术，向T75细胞培养瓶中加入11 ml DMEM、10% FCS、2 x 10-3 M L-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B。加入1 x 106个经致死剂量照射的小鼠3T3成纤维细胞12（溶于1 ml相同培养基中），于37 °C、5% CO2、湿润环境中过夜培养。此步骤将形成后续上皮细胞培养所需的饲养层。
- 使用手术刀，并依据病理学家的建议，从接受胃或食管手术患者的非病变背景区域获取约2 cm2的食管鳞状黏膜组织样本。将组织置于含50 ml无菌转运液（PBS，含100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B）的50 ml容器中，室温运送至实验室。
- 此时可将组织在转运液中于4 °C保存最多12小时（过夜），以方便操作；但不应延长保存时间，以免导致细胞活力下降。
- 在超净工作台内操作，并采用无菌技术，将手术刀片浸入70%乙醇中5分钟以进行灭菌，随后用无菌PBS冲洗。
- 将组织置于无菌培养皿中，用手术刀将其切成0.5 cm长的条状。向培养皿中加入5 ml含0.1%（w/v）胰蛋白酶的PBS，盖上皿盖，在37 °C孵育1小时。
- 向培养皿中的组织加入5 ml FCS以终止胰蛋白酶活性。用无菌镊子夹住组织条，用手术刀片轻轻刮擦每条组织的上皮表面1-2分钟，使上皮细胞脱落至周围液体中。移除刮过的组织并弃去。对所有组织条重复该过程。
- 收集含有脱落上皮细胞的液体至15 ml离心管中，离心（5分钟，200 x g）。弃去上清液，将沉淀物重悬于12 ml上皮细胞培养基（见步骤1.1所述）中。
- 弃去步骤1.2中制备的T75培养瓶内饲养层细胞的培养液。使用无菌移液管将含有新鲜分离上皮细胞的悬液加入该培养瓶中，于37 °C、5% CO2、湿润环境中继续培养。
- 24小时后，弃去旧培养液（其中含有细胞碎片），更换为12 ml新鲜上皮细胞培养基。继续在37 °C、5% CO2、湿润环境中培养。接下来24至48小时内将开始出现细胞克隆，可通过将培养瓶置于普通光学显微镜下观察。每2至3天更换一次等体积的新鲜培养液。
- 当培养瓶中细胞融合度达到80%时，进行传代13。以1:5比例传代，以增加用于模型构建的细胞数量。在传代前24小时，按照步骤1.2操作，在每个将要接种上皮细胞的培养瓶中建立经照射处理的3T3细胞饲养层。
注意：用于下述食管模型的上皮细胞仅限于第1至第4代之间使用。
2. 人食管成纤维细胞的分离
- 在超净工作台中操作，并采用无菌技术，取步骤1.7中预留的组织，放入无菌培养皿中，用无菌手术刀片将其充分切碎。加入10 ml 0.5%（w/v）胶原酶A溶液，盖上培养皿盖，于37 °C、5% CO2、湿润环境中过夜孵育。
- 将消化后的悬液转移至15 ml离心管中，离心（10分钟，200 × g），小心倾去并弃除上清液，将沉淀物重悬于10 ml成纤维细胞培养基（DMEM，含10%胎牛血清、2 × 10-3 M L-谷氨酰胺、100 IU/ml青霉素、100 µg/ml链霉素和0.625 µg/ml两性霉素B）中。
- 将细胞悬液接种至T75培养瓶中，于37 °C、5% CO2、湿润环境中培养。24小时后，弃去含有碎片的培养基，更换为12 ml新鲜成纤维细胞培养基。每2至3天更换一次培养基，当细胞融合度达到80%时进行传代13，按1:5比例分瓶以增加细胞数量。
注意：在下文所述模型中使用的成纤维细胞，仅限于第4至第10代之间。
3. 脱细胞食管支架的制备
- 从用于食品生产的、刚屠宰的长白猪的屠宰场获取完整的猪食管。单根食管可为约30个独立构建体提供足够的支架材料。
注意：由于所需的灭菌程序复杂且耗时，通常建议一次至少获取并处理10根食管。 - 立即将新鲜切除的食管放入含有约150 ml 10%聚维酮碘溶液的180 ml无菌容器中，浸泡5分钟，以减少可能的微生物污染。随后将食管转移至第二个含有约100 ml无菌PBS（含200 IU/ml青霉素、200 µg/ml链霉素和1.25 µg/ml两性霉素B）的容器中。
- 盖上容器盖子，并在室温下将食管运回实验室。根据食管大小，每个容器可运输两到三根食管。
- 到达实验室后，在超净工作台中采用无菌操作技术处理组织，以最大限度减少微生物污染。将镊子、剪刀和手术刀片在70%乙醇中浸泡5分钟进行消毒，然后用无菌PBS冲洗。
- 使用无菌镊子夹持食管，用剪刀沿纵向切开食管。将食管放入含有约100 ml无菌PBS的180 ml无菌容器中，轻轻振荡以去除残留碎片，对组织进行冲洗。
- 用大量70%乙醇喷洒软木解剖板进行清洁，并待其自然干燥。
- 将食管从PBS中取出，使用无菌针将其固定在解剖板上，黏膜面朝上。用无菌镊子夹住食管一端的黏膜表面并轻轻拉离解剖板，使黏膜与下方的黏膜下层分离。
- 然后使用无菌手术刀片沿固有层纵向解剖食管，在解剖过程中逐步移除固定针，以便将黏膜完全剥离。
- 保留已分离的黏膜组织，弃去下方的黏膜下层。
- 切除并弃去黏膜最近端和最远端各2 cm的区域，因为这些区域分别含有较多的黏膜下腺体和更厚的固有层7。
- 使用手术刀将剩余组织切成5 cm2大小的片状。将所有切割后的组织放入含有约150 ml无菌PBS的180 ml无菌容器中，轻轻振荡以清洗组织。若同时处理超过五根食管，则可能需要在本步骤及后续三个步骤中使用多个容器。
- 使用无菌镊子将切割后的组织转移至含有150 ml无菌1 M NaCl、200 IU/ml青霉素、200 µg/ml链霉素和1.25 µg/ml两性霉素B的180 ml无菌容器中。在37 °C下孵育72小时。
- 将组织放入新的180 ml无菌容器中，加入150 ml无菌PBS。此时上皮层将开始明显与下方组织分离。使用无菌镊子轻轻剥离并移除脱落的上皮层，弃去。
- 将剩余组织转移至另一个新的180 ml无菌容器中，加入150 ml无菌PBS，轻轻振荡5分钟进行清洗。倒去PBS，再用新鲜PBS重复清洗两次。
- 将所有组织放入含有400 ml无菌80%（v/v）甘油溶液的500 ml玻璃瓶中，在室温下处理24小时。随后转移至含有400 ml无菌90%（v/v）甘油溶液的容器中，继续处理24小时。
- 将组织保存在400 ml无菌100%甘油溶液中，室温下至少保存4个月，以实现组织脱水和灭菌，同时保持基底膜的完整性。
4. 培养基的制备
- 准备螯合的新生小牛血清用于培养基。
- 将100 g Chelex 100倒入一个1 L玻璃瓶中，加入去离子水。水的精确体积不关键，但需加入足够量以完全覆盖Chelex粉末。加入磁力搅拌子，通过高压灭菌（121 °C，15分钟）进行灭菌。
- 让瓶子冷却并使Chelex沉淀。在超净工作台中倾去多余的水，加入500 ml新生小牛血清（NCS），于4 °C下搅拌过夜。
- 停止搅拌，待Chelex完全沉淀（可能需要长达30分钟）。在超净工作台中使用无菌移液管小心倾出螯合后的血清，注意不要扰动Chelex，然后以10 ml分装储存于-20 °C。
- 在超净工作台中配制三种不同的培养基，从促增殖型开始，最后配制促分化型。
- 配制复合培养基I：由DMEM与Hams F12以3:1（v:v）比例混合，含4 × 10-3 M L-谷氨酰胺、0.5 µg/ml氢化可的松、1 × 10-4 M O-磷酸乙醇胺、2 × 10-12 M三碘甲腺原氨酸、1.8 × 10-4 M腺嘌呤、1.88 × 10-3 M CaCl2、4 × 10-12 M孕酮、10 µg/ml胰岛素、10 µg/ml转铁蛋白、10 ng/ml硒、1 × 10-3 M乙醇胺以及0.1%（v/v）螯合NCS。
- 配制复合培养基II，成分同复合培养基I，但将螯合血清替换为0.1%（v/v）非螯合NCS。
- 配制复合培养基III，成分同复合培养基II，但省略孕酮，并将血清浓度提高至2%（v/v）非螯合NCS。
5. 人食管黏膜模型的制备
- 所有操作均须在超净工作台内进行，采用无菌技术以维持无菌环境。所有工具使用前需在70%乙醇中浸泡5分钟进行灭菌，随后用无菌PBS冲洗。
- 在需要使用的前一天，对无细胞猪源性食管支架进行再水化处理。每制备一个构建体需使用一片支架。
- 将足够数量的猪源性支架放入盛有100 ml无菌PBS的容器中，充分搅拌并浸泡10分钟以实现组织再水化。倾去PBS并更换新鲜PBS。重复洗涤五次，以确保彻底去除所有甘油残留。
- 通过将再水化后的组织在37 °C条件下于100 ml DMEM培养基中过夜孵育，检测支架的无菌性。若孵育结束后培养基的颜色或浊度未发生变化，则认为支架无菌。确认无菌后，将5 cm2的无细胞支架放入6孔板中，黏膜下层朝上。
- 将无菌医用级不锈钢环（内径10 mm，外径20 mm）置于每片支架中央，使用无菌镊子轻轻按压，确保其与组织形成良好密封。
- 使用胰蛋白酶-EDTA13消化收集成纤维细胞，制备细胞悬液。使用血细胞计数板14进行细胞计数。离心细胞悬液（10分钟，200 × g）。将细胞沉淀重悬于适量成纤维细胞培养基中，调整终浓度为每毫升含2.5 × 106个细胞。
- 在每个环内加入0.2 ml含5 × 105个人食管成纤维细胞的成纤维细胞培养基。在环外周区域加入约2 ml成纤维细胞培养基。于37 °C、5% CO2、湿润环境中孵育。
- 24小时后，移除钢环及成纤维细胞培养基，向每孔加入至少5 ml新鲜成纤维细胞培养基，确保支架完全浸没于培养基中。于37 °C、5% CO2、湿润环境中继续培养1周，每2至3天更换一次培养基。
- 1周后，将含支架的6孔板转移至超净工作台，吸除培养基，并使用无菌镊子将每片支架翻转，使黏膜面朝上。此时间点记为第0天（Day 0）。
- 参照步骤5.4，在组织黏膜面中央放置钢环。
- 准备T75培养瓶中的上皮细胞用于胰蛋白酶消化13。在PBS洗涤后、加入胰蛋白酶-EDTA溶液前，向每瓶中加入2 ml无菌0.02%（w/v）EDTA溶液。于37 °C孵育2分钟。轻拍培养瓶，选择性地使i3T3饲养层细胞脱落，而上皮细胞仍附着于瓶壁。
注：通常无需也不实际将上皮细胞与前一周已整合于模型中的成纤维细胞进行患者匹配。 - 倾去含饲养层细胞的EDTA溶液，加入胰蛋白酶-EDTA溶液以收获上皮细胞13。使用血细胞计数板14进行细胞计数。离心细胞悬液（10分钟，200 × g）。将细胞沉淀重悬于适量复合培养基I（Composite Medium I）中，调整终浓度为每毫升含5 × 106个细胞。
- 在环内加入0.2 ml含1 × 106个上皮细胞的复合培养基I。在环外周区域加入约2 ml复合培养基I，并将构建体置于37 °C、5% CO2、湿润环境中孵育。
- 24小时后（第1天），移除钢环及培养基，加入至少5 ml新鲜复合培养基I，确保支架完全浸没，然后放回孵箱。再过24小时后（第2天），更换为至少5 ml复合培养基II，同样确保支架完全浸没，然后放回孵箱。
- 第4天，将无菌医用级不锈钢网格（2 cm宽 × 2 cm长 × 0.5 cm高）放入新的6孔板中，每构建体一个。使用无菌镊子将构建体转移至钢网顶部，黏膜面朝上。
- 加入足量的复合培养基III，使液体刚好接触构建体底部，而表面暴露于空气中，以确保样本维持在气-液界面状态。所需培养基的确切体积取决于支架厚度、孔板容积及不锈钢网的确切高度。
- 根据实验需求，将构建体在气-液界面条件下维持10至20天（第14天至第24天）。每2至3天（建议采用周一、周三、周五的更换方案）更换新鲜的复合培养基III。
注：在气-液界面培养5天后（第9天），构建体已形成足够成熟的食管上皮，可用于研究环境因素对食管上皮影响的实验。 - 实验结束后，将构建体固定用于组织学分析及免疫组织化学染色7，或从上皮层提取蛋白15或RNA11,16用于进一步分析。如需，可保留条件培养基用于细胞外信号分子的分析17。
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结果
本手稿描述了成功培养人食管上皮三维模型所需的步骤，该过程如图1所示。为验证该模型作为实验平台的适用性，已开展组织学和免疫组织化学研究，将培养的组织与正常人食管鳞状黏膜进行比较。
通过所述方法生成的上皮组织经组织学评估显示，其为成熟、多层的复层鳞状上皮（图2B），与正常人食管所见的上皮组织相似（图2A），但层数较薄（细胞层数为5至10层，而正常食管为10至20层），且细胞在向表面迁移过程中逐渐变扁平，最终失去细胞核。
对增殖和分化关键标志物的免疫组织化学表征表明，该模型上皮的显微解剖结构与正常人食管上皮相似。在天然食管和模型上皮中均观察到类似的Ki67表达，染色局限于基底层及紧邻的副基底层中的一部分细胞（图3A和3B）。这与已有研究报道一致，即正常食管上皮中通常少于10%的细胞表达增殖标志物Ki6718。CK4通常表达于复层和柱状上皮中，但...
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讨论
本文描述了一种具有生物学意义的人类食管黏膜模型的构建与表征，该模型可作为实验平台，用于研究环境应激因素暴露对食管上皮的影响。
成功构建人食管黏膜模型最关键的步骤包括：确保大部分上皮细胞保持增殖状态，在接种到支架前尚未开始分化；维持复合体的气-液界面，以保证上皮的正确成熟；在整个长期培养过程中保持无菌状态。
由于可用于细胞分离的人体组织量有限，通常无法从单个组织样本中获得足够数量的细胞，直接将 freshly isolated 的细胞接种到支架上，因此需要一个细胞扩增阶段，在此阶段中，细胞在标准的二维细胞培养条件下进行培养。在此期间，必须确保细胞保持增殖能力。为此，应避免培养物达到完全汇合状态，仅使用传代次数不超过4代的细胞，并密切监测细胞形态。因此，细胞应保持其特有的增殖性多边形形态，以及增殖性上皮细胞典型的紧密“鹅卵石”样铺路石外观，而不是出现已经开始分化的培养物中所观察到的更为弥散的形态。第二个关键步骤是通过确保细胞培养基覆盖用于将培养物提升至气液界面的不锈钢网格的上表面，但构建物本身的最上层表面不被浸没来实现控制。第三个...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢谢菲尔德教学医院NHS基金会信托的顾问外科医生Roger Ackroyd先生、Andrew Wyman先生和Chris Stoddard先生在获取食管组织样本方面提供的帮助以及对我们工作的支持。我们感谢Ashraful Haque在将肿瘤细胞系整合到模型中所提供的协助。本研究得到了Bardhan研究与教育信托基金（BRET）和约克郡癌症研究（YCR）资助项目的经费支持，特此致谢。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 胰蛋白酶 | BD Biosciences | 215240 | 用 PBS 配制 0.1% w/v 溶液，并过滤除菌。使用前在 37 °C 水浴中预热。 |
| DMEM | Labtech | LM-D1112 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| Ham's F12 | Labtech | LM-H1236 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 胎牛血清 | Labtech | FB-1090 | |
| 表皮生长因子 | R+D Systems | 236-EG-200 | 用 10 mM 乙酸、1% FCS 配制 200 µg/ml 储存液 |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0396 | 用 PBS 配制储存液，使用前过滤除菌 |
| 腺嘌呤 | Sigma-Aldrich | A2786 | 用 PBS 配制储存液，使用前过滤除菌 |
| 胰岛素 | Sigma-Aldrich | I2767 | 用 0.01 M HCl 配制 10 mg/ml 溶液，再用蒸馏水稀释 1:10，并在使用前过滤除菌 |
| 转铁蛋白 | Sigma-Aldrich | T2036 | 用蒸馏水配制储存液，使用前过滤除菌 |
| 三碘甲腺原氨酸 | Sigma-Aldrich | T2752 | 用蒸馏水配制储存液，使用前过滤除菌 |
| 霍乱毒素 | Sigma-Aldrich | C8052 | 用水配制储存液 |
| L-谷氨酰胺 | Sigma-Aldrich | G7513 | |
| 青霉素-链霉素 | Sigma-Aldrich | P0781 | |
| 两性霉素 B | Gibco | 15290-026 | 商品名 Fungizone |
| PBS | Oxoid | BR0014 | 将 1 片溶解于 100 ml 水中，高压灭菌以除菌 |
| 胶原酶 A | Roche | 10103578001 | |
| 聚维酮碘溶液 | Ecolab | 10830E | 商品名 Videne |
| 乙醇 | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| Chelex 100 | Sigma-Aldrich | C7901 | |
| 新生牛血清 | Gibco | 26010074 | |
| 孕酮 | Sigma-Aldrich | P8783 | 用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌 |
| 乙醇胺 | Sigma-Aldrich | E9508 | 用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌 |
| 氢化可的松 | Sigma-Aldrich | H0888 | 用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌 |
| O-磷酸乙醇胺 | Sigma-Aldrich | P0503 | 用 DMEM 配制储存液，使用前过滤除菌 |
| ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒） | Lonza | 17-838Z | 用于复合培养基的配制 |
| 胰蛋白酶-EDTA | Sigma-Aldrich | T3924 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| 0.02% EDTA 溶液 | Sigma-Aldrich | E8008 | 使用前在 37 °C 水浴中预热 |
| T75 培养瓶 | VWR | 734-2313 | |
| 50 ml 离心管 | Fisher | 11819650 | |
| 15 ml 通用管 | SLS | SLS7504 | |
| 180 ml 烧杯 | VWR | 216-2603 | |
| 培养皿 | SLS | 150350 | |
| 6 孔板 | VWR | 734-2323 | |
| 不锈钢环 | 自行制造——医用级不锈钢，内径 10 mm，外径 20 mm | ||
| 钢丝网格 | 自行制造——板材上孔径为 0.3 cm，弯曲成 2 cm（宽）× 2 cm（深）× 0.5 cm（高）的网格 | ||
| ki67 | Novocastra | KI67-MM1-L-CE | 克隆号 MM1。使用比例为 1:100。 |
| CK4 | Abcam | ab9004 | 克隆号 6B10。使用比例为 1:200。 |
| CK14 | Novocastra | LL002-L-CE | 克隆号 LL002。使用比例为 1:200。 |
| 兜甲蛋白 | Novocastra | INV | 克隆号 SY5。使用比例为 1:100。 |
| OE21 | Sigma-Aldrich | 96062201 | |
| OE33 | Sigma-Aldrich | 96070808 | |
| Het-1A | ATCC-LGC | CRL-2692 | |
| 小鼠 3T3 成纤维细胞 | ATCC-LGC | CRL-1658 | 此前经辐照（60 Gy）使其生长停滞 |
参考文献
- Pera, M., Manterola, C., Vidal, O., Grande, L. Epidemiology of esophageal adenocarcinoma. J. Surg. Oncol. 92 (3), 151-159 (2005).
- Manea, G. S., Lupusoru, C., Caruntu, I. D. Experimental study on the effect of bile, and bile and hydrochloric acid mixture on the esophageal mucosa. Rom. J. Morphol. Embryol. 50 (1), 61-66 (2009).
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