三维组织工程人食管黏膜型号生产，表征和潜在用途

Summary

这份手稿描述了生产，表征和组织工程食管三维结构从正常原代人成纤维食管，并在脱细胞化猪接种支架鳞状上皮细胞制备的潜在用途。结果证明类似于正常人食道成熟复层上皮的形成。

Abstract

两者食管腺癌和其前体，巴雷特化生的发生，正在迅速在西方世界上升。此外食管腺癌一般预后较差，在生存率几乎没有改善的排头兵。这些都是困难的条件下，研究，至今缺乏合适的实验平台，以探讨食管粘膜的疾病。

已经开发了麦克尼尔实验室，它不象常规的2D细胞培养系统，概括本体内的细胞-细胞和细胞-基质相互作用，并产生一个成熟的，分层类似于正常人上皮的人食管粘膜的模型食道。简要地说，该模型利用内的猪源性脱细胞食管支架生长的未转化的正常原代人食管成纤维细胞和上皮细胞。这种模式的表征免疫组化通过CK4，CK14，Ki67和外皮染色展示了人类正常食管黏膜的组织学再演合适。

这个模型提供了人类食管粘膜的稳健，生物相关的实验模型。它可以很容易被操纵以调查了若干研究问题，包括药理学试剂的有效性和暴露于环境因素，如醇，毒素，高温或胃食道反流部件的影响。该模型还有助于延长培养期间无法实现与传统的二维细胞培养，启用， 除其他外 ，一个成熟的上皮反复暴露于感兴趣的代理的影响为长达20天的研究。此外，各种细胞系，诸如那些自食管肿瘤或巴雷特化生衍生，可并入该模型来调查如肿瘤侵袭和药物responsivene流程SS在更生物学相关的环境。

Introduction

食管粘膜包括分层，鳞状上皮以上的层结缔组织，固有层，并且是遇到摄取环境应激第一站点之一。暴露于饮食毒素牵涉于食管鳞状细胞癌的发展，而duodenogastro食管返流是在巴雷特上皮化生，这是与进展的风险增加至食管腺癌相关的发病机理的关键因素。食管癌是在英国男性和食道腺癌的^第 8 ^次最常见的恶性肿瘤是在西方世界¹迅速增加。此外，很少有改善疾病的预后，具有大约15％的总体5年存活率。因此，有必要对实验平台来调查对环境应激有关此食管上皮的开发板的曝光的影响和其潜在参与pment化生或肿瘤形成。

虽然永生化或肿瘤细胞系允许研究人员研究上皮细胞向这些压力在体外的反应，它们保持增殖和失败分化成的食管粘膜的最上层中发现的成熟上皮细胞。此外，那些已经经历了肿瘤细胞株可提供关于内上皮环境因素正常细胞的初始响应仅有限的信息;这是当用于治疗性干预的潜在可能是最高的阶段。最后，传统的细胞培养系统无法捕捉上皮细胞和间质细胞之间，并且这些细胞和周围基质在体内组织内发生之间的潜在的重要相互作用。

动物模型对于研究食管epitheli的答复提供更逼真的微环境微米和可以结合的人工诱导胃食管反流病^2。然而，它可以是更具挑战来操纵这些模型的环境压力，他们可能不能完全代表人类食道内的响应。

Protocol

人食管癌细胞是从发生胃或食管手术的患者获得。获得知情同意被用于研究目的的组织，并在适当的伦理批准（SSREC 165/03，人类研究组织库牌照12179）的组织所使用匿名。

1.隔离人食管上皮细胞

1. 比1:工作在层流组织培养罩，并使用无菌技术，通过混合的Dulbecco氏改良的Eagle氏培养基（DMEM）和火腿的F12在3制备上皮培养基（体积:体积）。加10％（体积/体积）FCS，10纳克/毫升的表皮生长因子，0.4微克/ ml氢化可的松，1.8×10 ^-4 M腺嘌呤，5微克/毫升胰岛素，5微克/毫升转铁蛋白，2×10 ^{-7 M的}甲状腺素，1×10 ^-10 M霍乱毒素，2×10 ^{-3 M}谷氨酰胺，100IU / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，和0.625微克/毫升两性霉素B.
2. 使用标准无菌操作技术，把11毫升的DMEM，10％FCS，2×10 ^-3 M L-谷氨酰胺，100IU / ml青霉素，100微克/ ml链霉素，和0.625微克/毫升两性霉素B成T75组织培养瓶中。加1×10 ⁶个致死剂量照射小鼠3T3成纤维细胞¹²在1ml相同的培养基中，在5％的CO _2，湿润气氛孵育过夜，在37℃。这将产生一个饲养层上皮细胞的后续培养。
3. 用手术刀和以下一个组织病理学家的建议，解剖组织的约....

Results

这个手稿描述所需的过程，在图1以示意形式示出，以人类食管上皮成功培养3D模型。以确认模式的适用性作为实验平台的组织学和免疫组化研究已进行用正常人食管鳞状黏膜比较培养组织。

通过所描述的方法产生的上皮的组织学评估显示了成熟的，多层，层鳞状上皮（ 图2B），这是相媲美，与正常人食管（ 图2A）观察到，虽然稀释剂（5至10层细胞的用10至20为正常食管），与细胞变得逐渐谄最终无核当它们朝向表面迁移比较。

增殖和二的关键标志物免疫组化特征fferentiation证明的模型上皮的显微解剖是类似于人正常食管上皮。可比Ki67的表达在这两种天然食道和模型上皮观察，用染色限制于基底内的细胞，并立即基底层（ 图3A和3B）的一个子集。这类似于研究哪些报告细胞小于10％一般显示增殖标记物的表达，Ki67蛋白，在正常食管上皮^18。 CK4正常表达在分层和柱状.......

Discussion

这个手稿描述适合用作实验平台，研究暴露于环境应激经食管上皮的影响的生物相关的人类食管粘膜模型的制备和表征。

对于成功制造人工食道粘膜模型的最重要的步骤是:确保多数上皮细胞保持增殖和尚未开始播种它们在支架上之前，分化;维持空气 - 液体界面的复合，以确保上皮的正确的成熟;保持无菌整个扩展文化时期。

由于人体组织的可用于细胞分离的有限量的这通常是不可能从单一组织样品的种子新鲜分离细胞直接在支架和随后的细胞扩张ph值获得足够的细胞需要酶，其中所述细胞生长在标准的2D细胞培养条件。以确保在此期间细胞保持增殖是非常重要的。这是通过确保培养物决不允许达到完全汇合，用细胞模型中最多只能通道4，并仔细监测细胞形态​​来实现的。于是，单元应保留其独特的增殖多边形形态和紧"鹅卵石"路面状外观增殖的上皮细胞而不是多漫外观，其中已开始分化培养物中观察的特征。第二关键步骤是通过确保细胞培养基覆盖用来解除培养物到气 - 液界面，但本身不被水淹没的构建体的最上面的表面上的不锈钢网格的顶部表面来控制。生产脱细胞化时，第三步是取决于严格遵守扩展灭菌协议猪脚手架.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
胰蛋白酶	BD Biosciences	215240	在 PBS 中制备 0.1% w/v 溶液并过滤灭菌。37 英寸暖和：>C 使用前进行水浴。
DMEM	Labtech	LM-D1112	暖色 37 >C 水浴
使用前 Ham's F12	Labtech	LM-H1236	暖入 37 >C 水浴 使用前
胎牛血清	Labtech	FB-1090
表皮生长因子	R+D 系统	236-EG-200	准备 200 µg/ml 10 mM 乙酸、1%
FCS 氢多可的松	Sigma-Aldrich	H0396	储备液在 PBS 中制备储备溶液并过滤灭菌 腺
嘌呤	Sigma-Aldrich	A2786	在 PBS 中制备储备溶液并过滤灭菌 使用前消毒
胰岛素	Sigma-Aldrich	I2767	在 0.01 中制备 10 mg/ml 溶液 M HCl，在蒸馏水中以 1：10 稀释并过滤 使用前消毒
转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T2036	在蒸馏水中制备储备液并过滤 使用前消毒
三碘甲状腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T2752	在蒸馏水中制备储备溶液并过滤 使用前消毒
霍乱毒素	Sigma-Aldrich	C8052	在水中制备储备溶液
L-谷氨酰胺	Sigma-Aldrich	G7513
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P0781
两性霉素 B	Gibco	15290-026	品牌名称 Fungizone
PBS	Oxoid	BR0014	将 1 片溶于 100 片中 ml 水和高压灭菌器对
胶原酶 A	罗氏	10103578001
聚维酮碘溶液	Ecolab	10830E	品牌名称 Videne
乙醇	Sigma-Aldrich	E7023
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901
新生小牛血清	Gibco	26010074
黄体酮	Sigma-Aldrich	P8783	在 DMEM 中制备储备溶液并过滤 使用前消毒
胺	Sigma-Aldrich	E9508	在 DMEM 中制备储备溶液并过滤 使用前消毒
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0888	在 DMEM 中制备储备溶液并过滤 使用前消毒
O-磷酸乙醇胺	Sigma-Aldrich	P0503	在 DMEM 中制备储备溶液并过滤 使用前消毒
ITS（胰岛素、转铁蛋白、硒）	Lonza	17-838Z	用于复合培养基制备
胰蛋白酶-EDTA	Sigma-Aldrich	T3924	温热 37 >C 水浴 使用前
EDTA 0.02% 溶液	Sigma-Aldrich	E8008	37 温热>C 水浴 使用前
T75 培养瓶	VWR	734-2313
50 ml 离心管	Fisher	11819650
15 ml 通用管	SLS	SLS7504
180 ml 罐	VWR	216-2603
培养皿	SLS	150350
6 孔板	VWR	734-2323
不锈钢环			内部制造 - 医用级不锈钢，内径 10 毫米，外径 20 毫米
钢网网格			内部制造 - 板材有 0.3 厘米直径的孔，弯曲以产生网格 2 厘米（宽）x 2 厘米（深）x 0.5 厘米（高）
ki67	Novocastra	KI67-MM1-L-CE	克隆 MM1。以 1：100 的比例使用。
CK4	Abcam	ab9004	克隆 6B10。以 1：200 的比例使用。
CK14	Novocastra	LL002-L-CE	克隆 LL002。以 1：200 的比例使用。
Involucrin	novocastra	INV	克隆 SY5.以 1：100 的比例使用。
OE21	Sigma-Aldrich	96062201
OE33	Sigma-Aldrich	96070808
Het-1A	ATCC-LGC	CRL-2692
小鼠 3T3 成纤维细胞	ATCC-LGC	CRL-1658	先前因照射而生长受阻 （60 Gy）