间充质干细胞通常来源于骨髓，需要进行扩增培养。当样本在处理前发生凝固时，可采用溶栓药物尿激酶（一种酶解性溶栓剂）处理，以降解血凝块，从而释放细胞并使其可用于扩增培养。该方案为重新采样提供了一种快速且经济的替代方法。
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摘要
摘要
间充质干细胞（MSCs）通常来源于骨髓，常需要进行扩增培养。本方案采用临床级尿激酶降解骨髓中的血块，从而释放可用于后续实验的MSCs。该方法为骨髓重复取样提供了一种快速且经济的替代方案。骨髓是MSCs的主要来源，这类细胞在组织工程和自体干细胞治疗中具有重要研究价值。由于骨髓包含整个造血系统，抽取后可能发生凝血。形成的血块中也含有MSCs，这些细胞若不处理将无法用于扩增培养或直接干细胞治疗。我们发现，74%的犬骨髓样本存在凝血现象，其干细胞数量不足未凝血样本的一半。因此，我们建立了一种酶消化法处理这些血块，以避免耗时且昂贵的骨髓重复取样。尿激酶是一种临床批准且易于获得的溶栓药物，几乎可完全清除骨髓血块。经处理后，骨髓穿刺液中获得的MSCs数量与未凝血样本相当。此外，尿激酶处理后的细胞仍保持正常的代谢活性，并具备向软骨、成骨和脂肪细胞系分化的潜能。本方案可在不影响细胞质量的前提下，有效挽救已凝固的血液和骨髓样本，从而避免重复取样，显著降低采样成本，并使凝血样本仍可用于科研或治疗用途。
引言
间充质干细胞（MSCs）在再生医学和组织工程中发挥着重要作用。它们能够迁移、分化为多种细胞类型1并定植，因此是自体治疗的理想候选细胞2,3。近年来，已启动使用MSCs治疗骨与软骨修复、移植物抗宿主病或心脏病的临床试验4。这些MSCs可从脐带或脂肪组织中获取，但最具前景的结果主要来自骨髓来源的干细胞5。
髂嵴能够采集到较大量的骨髓，因此是骨髓穿刺的主要部位6。然而，随着抽取骨髓体积的增加，穿刺物的质量会下降。前5 mL骨髓穿刺液中含有高质量的间充质干细胞（MSCs），而抽取更大体积则会导致穿刺液被富含血管的骨组织中的外周血稀释7。由于骨髓穿刺液中存在巨核细胞和血小板，若不使用抗凝剂，穿刺液容易发生凝固。但即使使用抗凝剂，仍可能出现凝块。
在骨髓中，间充质干细胞仅占总细胞群体的一小部分 8 并且必须在培养中扩增，以用于大多数组织工程或治疗应用 4这种培养物的质量在很大程度上取决于初始的细胞群体， 即多样性及较高的起始数量 9供体间的个体差异可能部分解释了回收的MSC数量较少的现象。另一方面，低质量样本来源的MSC需要更长的培养时间和更多的传代次数才能达到所需的细胞数量。无论哪种情况，长期传代均可能导致细胞衰老，并引起分化潜能的丧失 10因此，必须开发出能够最大化细胞产量并防止有害影响的优化方案。 11,12.
当我们开始研究犬MSC时，惊讶地发现约四分之三的犬骨髓样本含有凝块，而幸运的是，人源样本中出现凝块的情况较少（十分之一）。另一方面，我们观察到凝块样本中MSC的得率显著降低，这一点并不令人意外。为解决样本反复出现凝块的问题，我们开发了使用溶栓药物尿激酶替代重新取样的实验方案。
溶栓疗法可用于对抗因异常凝血导致血管阻塞而引发的心肌梗死、中风或栓塞等危及生命的情况。其作用机制是通过纤溶酶及其酶促纤溶酶原激活剂对纤维蛋白进行酶解，从而降解血栓。尽管溶栓疗法在临床治疗中应用广泛，但将其溶栓活性用于实验室中挽救已凝固样本的研究报道极少，且主要集中于淋巴细胞。1987年，Niku et al. 报道了使用链激酶溶解血块以获得具有功能的淋巴细胞的方法13；四年后，De Vis et al. 将链激酶的应用扩展至从血液和骨髓中分离白血病细胞，用于流式细胞术分析14。最近的一项研究提出使用阿替普酶（Alteplase）用于癌症诊断15。虽然同样采用酶解策略，但本方案专注于从骨髓中分离多能间充质干细胞（MSCs），为干细胞领域的研究人员提供一种实用工具。
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方案
注意：人骨髓穿刺液取自髂嵴，由瑞士卢塞恩州伦理委员会批准，并在获得捐赠者知情同意后采集。犬骨髓穿刺液同样取自髂嵴，并在获得犬主知情同意后采集。人骨髓穿刺液（约 20 ml）和犬骨髓穿刺液（约 10 ml）在手术室采集后，立即加入 15 ml 3.8% 枸橼酸钠进行抗凝处理。样本于采集当日转移至实验室环境进行后续处理。
1. 尿激酶的制备（使用前）st 使用
- 根据制造商说明，使用无菌磷酸盐缓冲液（PBS）重新溶解尿激酶：用10 ml注射器向带隔膜入口的瓶中加入10 ml PBS，通过轻轻旋转溶解干粉，得到每毫升含50,000注射单位（U）的溶液。
- 将500 µl分装至无菌离心管中（每管含25,000 U）。分装后于-20 °C保存，可在至少6个月内随时取用。
2. 准备步骤（每次骨髓处理前）
- 每个凝块化的骨髓穿刺液样品解冻一份尿激酶（25,000 U）（已成功使用单份25,000 U的尿激酶处理体积达25 ml的穿刺液）。
- 将水浴箱或摇床培养箱预热至37 °C。
3. 血凝块的酶消化
- 所有操作均须在层流生物安全柜中进行，以避免处理过程中骨髓样本受到微生物污染。当处理可能具有传染性的人体材料时，建议佩戴防护手套并谨慎操作。
- 将一个100 µm细胞筛置于无菌50 ml离心管上方。小心将骨髓穿刺液通过细胞筛过滤，倾斜筛子或移动凝块组织以促进过滤。使用无菌移液器吸头可改善滤膜的通透性。
注意：避免对凝块进行任何稀释，例如，不得用PBS冲洗凝块。尿激酶为间接作用，其有效消化需要活检组织中血清成分（即，纤溶酶原）的存在。在继续处理凝块组织的同时，滤液可于室温保存，待步骤3.6中进一步使用。 - 使用无菌镊子将骨髓凝块转移至一个空的细胞培养皿中。用无菌手术刀将组织碎片切成约2 mm3大小的小块。
- 使用无菌镊子将凝块小块转移至一个50 ml反应管中。确保切碎的凝块呈湿润状态。若组织显得干燥，可使用步骤3.1中保留的部分滤液进行润湿。
- 使用5 ml移液器上下吹打混悬液5次以进行机械解离。向样本中加入一份尿激酶。于37 °C水浴或轻微振荡的培养箱中孵育30分钟。
- 使用5 ml移液器上下吹打混悬液5次。此步骤须在生物安全柜中进行。再次于37 °C孵育30分钟。孵育结束后，再次使用5 ml移液器吹打5次。通过新的100 µm细胞筛过滤，与步骤3.2所得滤液合并。
- 将细胞悬液在室温下以500 × g离心10分钟。弃去上清液。按照下述方法或根据实验室间充质干细胞扩增培养的标准操作程序，将细胞沉淀重悬于培养基中。
4. 扩增细胞培养和集落形成单位（CFU）平板的接种
- 用50 ml基础培养基重悬细胞（包含红细胞和单个核细胞），基础培养基为添加了10%胎牛血清（FBS）、100 U/ml青霉素、100 mg/ml链霉素和2.5 mg/ml两性霉素B的α-MEM培养基。将细胞与台盼蓝溶液按1:10稀释后，使用血细胞计数板（Neubauer计数室）进行细胞计数。
- 以5 × 107 个细胞/cm2 的密度将细胞接种至细胞培养瓶中，置于37 °C、湿润的培养箱中培养。如条件允许，采用低氧环境（5%氧气）。对于CFU检测对照组，将109 个细胞接种至直径为10 cm的细胞培养皿中。
- 培养3天后，间充质干细胞会贴附于培养皿表面，而其他细胞仍处于悬浮状态。此时更换培养基，使用添加了5 ng/ml碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）的基础培养基。CFU检测对照组的培养皿同样进行相同处理。
- 继续培养至总共2周时间，每周更换培养基三次。若细胞融合度超过80%，则用胰酶消化进行传代。CFU检测对照组同样更换培养基，但在两周培养期间不进行细胞传代。
5. CFU 实验的吉姆萨染色法
- 每皿准备 10 ml 吉姆萨染液：将储备液（7.6 g/L 吉姆萨溶于甘油:甲醇中）用无菌水按 1:10 比例稀释（每次均需新鲜配制工作液）。
- 移除细胞培养皿中的培养基，并用 PBS 洗涤细胞。向培养皿中加液时需格外小心，避免冲走细胞。
- 用纯甲醇在室温下固定细胞 5 分钟，弃去甲醇。加入吉姆萨染液，在 37 °C 湿润培养箱中孵育 60 分钟。
- 用 PBS 洗涤两次。将培养皿倒置，皿盖朝前置于纸巾上自然晾干。手动计数克隆集落，最好使用记号笔在培养皿背面标记计数区域以辅助计数。
6. 间充质干细胞分化
- 犬源MSCs的分化
注意：犬源MSCs通过相应诱导培养基刺激培养四周，分别向软骨细胞、成骨细胞和脂肪细胞系分化。 - 对于 脂肪生成分化，将MSCs以4 x 105 细胞/厘米²2 交替采用以下两种不同的培养条件；
- 使用含DMEM + GlutaMAX、3% FBS、100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素、2.5的脂肪生成维持培养基进行培养 µg/ml 两性霉素 B 和 170 mM 胰岛素。
- 在维持培养基中添加3% FBS、5%兔血清，并补充成脂诱导培养基进行培养 µM 地塞米松，500 µM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤，33 µM 生物素，5 µM 罗格列酮和 17 µM 泛酸盐 16.
- 用油红O染色显示脂滴。简而言之，用10%甲醛固定细胞，PBS洗涤，再用异丙醇中0.35%油红O染色。
- 用于成骨分化培养，将间充质干细胞以单层形式接种于7 x 103 细胞/厘米²2 并按以下步骤进行刺激：
- Advanced DMEM（GIBCO）+ GlutaMAX，5% FBS，100 单位/毫升青霉素，100 毫克/毫升链霉素，2.5 µg/ml 两性霉素 B，50 µM L-抗坏血酸-2-磷酸、10 mM β-甘油磷酸钠和100 nM 地塞米松。
- 通过Von Kossa染色（5% AgNO₃）鉴定矿化沉积物3）。简言之，用10%甲醛固定细胞，PBS洗涤后用5% AgNO₃染色3在蒸馏水中。
- 软骨形成分化
- 从由冻干I型胶原蛋白制成的海绵状医疗器械上切割出立方体（每边3 mm），用作支持细胞生长的支架材料 17.
- 将MSCs以4 x 10⁴个/立方体的浓度接种于立方体顶部6 细胞/毫升（约70,000个细胞/立方体）。
- 在加入培养基之前，让细胞在立方体上贴壁30分钟。
- 将MSC-胶原构建物维持在软骨诱导培养基中，培养基成分为DMEM/F12 + GlutaMAX、2.5% FBS、100单位/毫升青霉素、100毫克/毫升链霉素、2.5 µg/ml 两性霉素B，40 ng/ml 地塞米松，50 µg/ml 抗坏血酸-2-磷酸，50 µg/ml L-脯氨酸，1× 胰岛素-转铁蛋白-硒 X，以及 10 ng/ml 转化生长因子-β1.
- 使用阿利新蓝染色法对构建物切片中的蛋白聚糖积聚情况进行可视化观察。简言之，将切片置于含有0.4%阿利新蓝的0.01% HCl溶液中染色过夜。2SO4 以及0.5 M盐酸胍。接着，将切片在40% DMSO和0.05 M MgCl中洗涤30分钟2细胞用核固红复染。
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结果
74%的犬骨髓样本（n=54）在到达我们实验室时含有凝块（图1A），且这些样本的间充质干细胞（MSC）产量降低，这使我们认为有相当数量的MSC被截留在凝块中。事实上，对切片凝块组织进行简单的DAPI染色即可证实其中存在高密度的有核细胞（图1B）。这最终导致可用于扩增培养的MSC数量较少，从而促使我们开发了使用尿激酶的处理方案。通常情况下，应用本方案后凝块几乎完全消失。然而，在方法开发过程中，我们通过消化前后称重的方式系统地探讨了凝块消化的问题。实验结果显示，未消化残留物分别为初始凝块重量的15%（犬）或9%（人）（图2A）。
骨髓来源的MSCs的一个典型特征是能够贴附于细胞培养皿。研究人员利用这一特性来筛选MSCs。因此，集落形成实验能够以一种简单、定量且可靠的方式评估细胞群体的质量。在我们的实验室中，所述集落形成实验已常规应用于所有处理的骨髓样本（包括未凝固的样本），这使我们能够将该实验作为判断尿激酶消化效果的主要标准。为实现直接比较，来自凝块样本滤液的细胞（即...
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讨论
我们通常在患者接受手术时（在本研究中主要是脊柱手术）采集骨髓样本，其优势在于手术室人员只需额外进行少量操作。尽管样本在采集后会立即与枸橼酸钠混合，但许多样本在送达实验室进行处理时已出现部分凝固。在此阶段，若需重新采样以替换已凝固的样本，则属于一次额外的独立干预操作，需要再次实施局部或全身麻醉6。这不仅需要临床医护人员和供体的积极配合，还会消耗大量资源21。
在此，我们提供了一种利用重组人尿激酶处理凝固骨髓样本以分离多能间充质干细胞（MSCs）的实验方案。我们证实，尿激酶处理不会对细胞造成损伤，且细胞的分化潜能得以保留。该方案耗时较短，仅使样本处理时间延长约1小时。 ½ 与未凝固样本相比，该方法在获得相当的细胞群的同时，耗时更短。迄今为止，该方案已成功应用于不同个体及犬只的骨髓凝块，使用了多个批次的尿激酶，并表现出良好的稳健性和可重复性。此外，尿激酶通过激活样本内源性纤溶酶原间接发挥作用，这意味着尿激酶反应依赖于血浆环境。因此，不建议引入凝块冲洗或其他类似步骤 例如， PBS。这会稀释血清环境，导致酶促反应显著减...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由瑞士国家基金会资助项目 CR3I3_140717/1 和瑞士截瘫基金会支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 基础培养基成分 | |||
| 青霉素-链霉素溶液（100倍浓缩） | Gibco | 15140122 | |
| 人碱性成纤维细胞生长因子 | Peprotech | 100-18B | |
| 含核苷酸和稳定型谷氨酰胺的MEM Alpha培养基 | Amimed | 1-23S50-I | |
| 热灭活胎牛血清 | Amimed | 2-01F36-I | |
| 两性霉素B | Applichem | A1907 | |
| 成脂诱导培养基成分 | |||
| DMEM-HAM F12培养基（含GlutaMAX） | Amimed | 1-26F09-I | |
| 胰岛素 | Sigma | I5500 | |
| 兔血清 | Gibco | 16120099 | |
| 地塞米松 | Applichem | D4902 | |
| 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 | Sigma | I5879 | |
| 生物素 | Sigma | B4639 | |
| 罗格列酮 | Sigma | R2408 | |
| 泛酸盐 | Sigma | P5155 | |
| 油红O | Sigma | O0625 | |
| 成骨诱导培养基成分 | |||
| L-抗坏血酸-2-磷酸 | Sigma | A8960 | |
| ß-甘油磷酸盐 | Sigma | G9422 | |
| 硝酸银（AgNO3） | Sigma | S6506 | |
| 成软骨诱导培养基成分 | |||
| Biopad - 海绵状医用装置 | Euroresearch | ||
| L-脯氨酸 | Sigma | P5607 | |
| 胰岛素-转铁蛋白-硒X | Gibco | 51500056 | |
| 人转化生长因子-β1 | Peprotech | 100-21 | |
| 阿利新蓝8GX | Sigma | A3157 | |
| 核固红 | Sigma | N8002 | |
| 通用试剂 | |||
| 二水合柠檬酸三钠 | Applichem | A3901 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS） | Applichem | 964.9100 | |
| 尿激酶 | Medac | 1976826 | |
| 0.5% 胰蛋白酶-EDTA溶液 | Gibco | 15400054 | |
| 吉姆萨染液 | Applichem | A0885 | |
| 甲醛 | Applichem | A0877 | |
| 硫酸（H2SO4） | Applichem | A0655 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Applichem | A1584 | |
| 氯化镁（MgCl2） | Applichem | A3618 | |
| 盐酸胍 | Applichem | A1499 | |
| 耗材 | |||
| 50 ml 离心管 | Axygen | SCT-50ML-25-S | |
| 10 ml 注射器 | Braun | 4606108V | |
| 斯特里坎针头（22G） | Braun | 4657624 | |
| 1.7 ml 微量离心管 | Brunschwig | MCT-175-C | |
| 100 μm 细胞筛 | Falcon | 6.05935 | |
| 无菌镊子 | Bastos Viegas, SA | 489-001 | |
| 无菌手术刀 | Braun | 5518059 | |
| Primaria 细胞培养皿 | Falcon | 353803 | |
| C型改进型血球计数板（Neubauer Improved） | Bioswisstech | 505050 | |
| 细胞培养瓶 - T300培养瓶 | TPP | 90301 | |
| 设备 | |||
| II级微生物生物安全柜 | Skan | 82011500 | |
| 水浴锅 | Memmert | 1305.0377 | |
| 5ml 移液管（Serological Pipette） | Corning | 4487-200ea | |
| 显微镜 | Olympus | CKX41 | |
| 带加湿功能的培养箱 Heracells 240 | Thermo scientific | 51026331 | |
| Heraeus Multifuge 1S-R 离心机 | Thermo scientific | 75004331 |
参考文献
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