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透化骨骼肌纤维产生的最大等长收缩力的测定

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DOI：

10.3791/52695

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2015年6月16日

 ,  ,  ,  , 
1Department of Orthopaedic Surgery, University of Michigan Medical School, 2Department of Molecular & Integrative Physiology, University of Michigan Medical School, 3Department of Biomedical Engineering, University of Michigan Medical School, 4Department of Surgery, Section of Plastic Surgery, University of Michigan Medical School

本文内容

摘要

化学去膜或透化骨骼肌纤维收缩特性的分析为在单个肌细胞水平上评估肌肉功能提供了一种强有力的方法。本文概述了一种制备和检测透化骨骼肌纤维的有效且可靠的实验技术。 体外.

摘要

化学去膜或透化骨骼肌纤维收缩特性的分析，为在单个肌细胞水平上评估肌肉功能提供了一种强有力的方法。单根肌纤维研究在基础科学和临床研究中均具有重要价值。在基础研究中，单根肌纤维收缩力的测定可用于探究力量产生的基本机制，并可在基因操作背景下分析肌肉功能。在临床上，单根肌纤维研究有助于深入了解损伤和疾病对肌肉功能的影响，并可为肌肉病理机制的理解提供指导。在本视频文章中，我们概述了制备和分离单根骨骼肌纤维片段、将其连接至测力装置、激活其产生最大等长收缩力，以及估算其横截面积以用于收缩力标准化的全部步骤。

引言

骨骼肌的主要功能是产生力量。肌肉力量的产生由以下过程引发 体内 通过一系列复杂的事件，包括运动神经动作电位、神经-肌肉接头传递、肌纤维动作电位、细胞内钙离子释放以及调节蛋白与收缩蛋白系统的激活。由于力量的产生是这一系列过程的最终结果，任何单一或多个步骤的功能障碍都可能导致力量不足。透化肌纤维制备的一个关键特性在于，它消除了力量生成所需的大部分步骤 体内，仅保留与肌原纤维装置相关的调节和收缩功能。研究者可自主控制激活钙离子和能量（ATP）的供给，从而获得一个简化系统，用于评估处于天然构型下的独立调节与收缩结构。因此，在评估观察到的肌肉功能改变时，利用透化骨骼肌纤维进行的力测量具有重要价值 体内例如，我们已利用该技术来表征肌抑素缺陷型小鼠肌纤维的产生力能力1 并评估慢性肩袖撕裂后持续性肌肉无力的原因2,3.

现代透化肌纤维技术方法可追溯至早期具有重要影响的研究4,5，目前已被多个研究团队所采用。尽管这些技术在文献中已有描述，但尚未以视频形式呈现。本文的目标是展示一种经过更新、有效且可靠的实验技术，用于测定经化学透化处理的骨骼肌样本中单根肌纤维的最大产生力能力。为此，从预先透化的肌纤维束中分离出一段单个肌纤维（本文中简称“肌纤维”），并将其置于含有松弛液的实验槽中，该溶液的关键特征是钙离子浓度<10 nM。随后，将肌纤维一端连接至力传感器，另一端连接至长度控制器。在将肌纤维维持于最佳肌节长度的条件下，将其转移至激活溶液中，该溶液的钙离子浓度足以引发最大程度的激活，从而产生最大等长收缩力。力信号数据通过个人计算机进行采集、存储与分析。

方案

涉及动物或人类受试者的全部操作均应遵循相关指南、法规及监管机构的要求。本文所述的所有动物和人类操作均已获得密歇根大学动物使用与护理委员会（UCUCA）以及密歇根大学医学中心机构审查委员会的批准。

1. 配制解剖和储存储备液

注意：以下说明中指定的最终体积可根据需要按比例放大或缩小。

  1. 在1,000 ml烧杯中加入800 ml去离子水（ASTM 1级）。保持轻柔搅拌，将表1中列出的所有化合物加入去离子水中，并使其充分溶解。
    化合物目标浓度 (M)分子量 (g/mol)加入1 L的量 (g)
    K-丙酸盐0.250112.1728.040
    咪唑0.040 68.08 2.720
    EGTA0.010380.40 3.800
    MgCl2•6H2O0.004203.31 0.813

表1：解剖与储存储备液的成分。

  1. 用去离子水定容至终体积 1,000 ml。注意：此时无需调节溶液 pH。将储备液储存于 4 °C。

2. 配制储存液

  1. 配制 200 ml 储存液时，先取 100 ml 解剖与储存用储备液置于 250 ml 烧杯中。加入足量的 Na2H2ATP，使最终腺苷三磷酸（ATP）浓度达到 2 mM。用甘油定容至 200 ml。用氢氧化钾（KOH）调节 pH 至 7.00。将储存液于 -20 °C 保存。
    注意：由于甘油具有较高的黏性，按体积准确移取较为困难。因此，我们通常按质量加入甘油（100 ml 甘油的质量约为 126 g）。

3. 配制解剖溶液

  1. 配制 200 ml 解剖液时，先在 250 ml 烧杯中加入 100 ml 解剖与保存用储存液。
  2. 加入足量 Na2H2ATP，使 ATP 的终浓度为 2 mM。用 KOH 调节 pH 至 7.00。用去离子水定容至 200 ml。分装为每份 2.5 ml，于 -80 °C 保存。

4. 使用 Brij 58 配制解剖液

注意：Brij 58 是一种非离子型去污剂，可破坏（通透化）脂质双分子层。

  1. 配制含 Brij 58 的 200 ml 解剖液时，先取 200 ml 解剖液置于 250 ml 烧杯中。保持轻柔搅拌，加入 1 g Brij 58（终浓度为 0.5% w/v），待其完全溶解。分装为每管 2.5 ml，于 -80 °C 保存。

5. 配制测试溶液

注意：以下内容改编自 Moisescu 和 Thieleczek 1978 年的研究（6）。有关测试溶液制备的更多说明，请参见讨论部分。

  1. 准备三个独立的1,000 ml烧杯，分别标记为“松弛液”、“预激活液”和“激活液”。向每个烧杯中加入400 ml去离子水。
  2. 将表2中指定的化合物加入相应的烧杯中，然后将溶液加热至70 °C至80 °C之间。在持续搅拌的条件下，保持溶液温度在70–80 °C持续30分钟。
    注意：70–80 °C的温度有助于消除激活液中碳酸钙与EGTA反应生成的碳酸。为保持一致性，松弛液和预激活液的处理方式与激活液相同。
松弛溶液预激活溶液激活溶液
化合物分子量 (g/mol)目标浓度 (mM)所需质量 (g)目标浓度 (mM)所需质量 (g)目标浓度 (mM)所需质量 (g)
HEPES（酸）238.3090.010.72490.010.72490.0010.724
MgO 40.3110.3 0.208 8.5 0.171 8.12 0.164
EGTA（酸）380.4052.0 9.89052.00 9.890
HDTA（酸）348.3650.0 8.709
CaCO3100.1050.00 2.503

表2：松弛液、预激活液和激活液的成分。

  1. 将溶液冷却至室温，加入足量的 NaN3/KOH，使终浓度的 NaN3 达到 1 mM。
    注意：NaN3（叠氮化钠）有毒。操作前请查阅该化学品的材料安全数据表（MSDS）。
    1. 配制 100 ml 的 100 mM 叠氮化钠溶液：将 0.65 g NaN3 加入 10 ml 的 1 N KOH 中，再用去离子水定容至 100 ml。
  2. 用 KOH 将 pH 值调节至约 7.10。
  3. 在完成步骤 5.4 后，加入足量的 Na2H2ATP，使终浓度的 ATP 达到 8 mM，并加入足量的 Na2CrP，使终浓度的磷酸肌酸（CrP）达到 10 mM。
  4. 用去离子水将每种溶液定容至 500 ml。将溶液冷却或加热至实验所需的温度，同时在此温度下用 KOH 将 pH 值调节至 7.10。
  5. 将松弛溶液加入含有预激活溶液的烧杯中，使最终的预激活溶液为 1 份松弛溶液与 500 份预激活溶液的混合液。分装成每份 2.5 ml，于 -80 °C 保存。

6. 制作缝合线环

  1. 取一根非无菌的 USP 10-0 单丝尼龙缝线作为起始材料。
  2. 使用镊子采用双结套结技术将缝线制成环状结构，并将结扎紧至直径约 750 µm。可在显微镜下利用目镜测微标尺测量环的直径。
  3. 使用显微剪刀剪除多余缝线，仅保留环结构及两侧各约 500 µm 的短尾。成品环的示例见图1。
  4. 重复步骤 6.2–6.3，直至制备出 4 个可用的环，将制备好的环存放于硅胶弹性体包被的培养皿中以备后续使用。
    注意：每根测试纤维需要 4 个缝线环。

7. 捆绑样本

注意：以下步骤描述了将原始样本解剖为较小实验“束”的过程，最终将从中分离并测试单根纤维。在整个操作过程中，应始终小心处理样本。为便于说明，以下说明将假设研究者为右利手。

  1. 获取目标样本，并将其转移至进行解剖操作的实验场所。
    注意：组织活检的方法将根据实验模型和研究设计的不同而有所差异。在条件允许的情况下，应维持肌肉的灌注直至活检时。
  2. 若样本需在取材地点与解剖地点之间转移，请将其置于含有预冷解剖液的离心管中，并保持在冰上运输。
  3. 准备一个直径为5 cm、表面涂有硅橡胶弹性体的培养皿，加入预冷的解剖液，并备好两到三枚昆虫固定针（直径100 µm，不锈钢材质）。
  4. 将样本转移至培养皿中。必要时可添加更多解剖液，确保样本始终完全浸没。
  5. 在显微镜下检查样本，并调整其位置，使肌纤维的长轴朝向操作者的右肩方向（图2）。随后用固定针在样本四角将其固定于培养皿底部。
    注意：此时应尽量利用残留的结缔组织作为固定点，以最大化样本利用率并保持肌纤维的完整性。可对肌束施加轻微张力固定，以利于清晰分辨纤维间的边界。
  6. 左手持镊子，右手持显微解剖剪，沿肌纤维间的纵向边界开始轻柔地分离出一个肌束。
    注意：根据肌束总长度，可进一步将其分割为多个较小的肌束。
  7. 确保肌束的尺寸约为0.5–1 mm宽，长度≥3 mm。可通过目镜带刻度的显微镜或在培养皿下放置标尺来评估尺寸。
  8. 移除并丢弃在解剖过程中因镊子或固定针造成损伤的组织。
  9. 重复上述操作，直至获得足够数量的肌束，或样本已完全使用完毕。
    注意：可获得的肌束数量取决于多种因素，包括初始样本的大小与状态、肌肉的形态结构以及操作者的熟练程度。

8. 透化纤维

  1. 将组织束从解剖液转移至含有 2.5 ml 新鲜预冷解剖液的离心管中，解剖液中需添加非离子型去污剂“Brij 58”（0.5%，w/v）。冰上孵育 30 分钟，期间偶尔轻柔振荡。确保孵育过程中组织束始终浸没于液体中。
  2. 30 分钟孵育结束后，将组织束转移至另一含有新鲜解剖液（不含 Brij 58）的离心管中，轻轻短暂振荡，以去除残留的去污剂。

9. 准备用于储存的样本束

  1. 将束状物转移至含有冷储存液的小瓶中，并在 4 °C 下孵育过夜。

10. 储存束

  1. 次日，准备一个可耐受 -80 °C 的储存盒，并备足量的 0.5 ml 螺口锥形管（每管用于存放解剖过程中获得的一个组织束），以容纳解剖所得的全部组织束。每支锥形管中应加入 200–400 µl 新鲜的储存液。
  2. 将组织束转移至分别标记的锥形管中。确保组织束未贴附在锥形管壁上或漂浮于液面。盖紧管盖，并将样本在 -80 °C 条件下保存至检测当日。

11. 准备实验装置

注意：该定制装置由一个包含长度控制器和力传感器的平台、一个移动腔室系统以及一台10倍解剖显微镜组成。微米驱动装置可对纤维附着表面进行精确操控。通过激光衍射图样来估算肌节长度。实验过程中产生的数据记录在个人计算机上。有关实验装置的标注图像，请参见图3。

  1. 分别解冻一管松弛液、预激活液和激活液，并保持在冰上。注意ATP和CrP是不稳定的化合物，应始终保持低温。
  2. 准备显微镜、测试装置及相关计算机以供使用。
  3. 用松弛液填充第一个实验腔室。在我们的装置中，第一个腔室含有棱镜，可使研究者从侧面拍摄肌纤维图像。用预激活液填充第二个实验腔室，用激活液填充第三个腔室。
  4. 调节温度，使腔室内的温度计显示为15 °C。将两个预先准备好的缝合线环分别穿入力传感器和长度控制器伸出的不锈钢连接面上（图5A）。

12. 提取透化单根肌纤维

  1. 解冻感兴趣的肌纤维束，并将其转移至含有新鲜且预冷的松弛液的硅胶弹性体包被培养皿中。用针在纤维束两端固定，确保其完全浸没在溶液中。
  2. 使用镊子夹住一根肌纤维的一端，沿其纵轴平稳地将其抽出。
    注意：此时镊子对纤维末端造成的挤压损伤无需担心，因为该区域的收缩性能不会被检测。然而，在从纤维束中分离单根纤维时应格外小心，因为纤维与细胞外基质之间的粘连可能导致过度张力，最终引起拉伸诱导的损伤。需注意，不同肌肉之间纤维与周围细胞外基质粘连的程度存在显著差异。怀疑因过度拉伸而受损的纤维应予以弃用。
  3. 使用剃刀刀片或手术刀片按（图4）所示方式修整移液器吸头。将肌纤维连同少量松弛液一同引入吸头中。将单根肌纤维从硅胶弹性体包被的培养皿转移至含有松弛液的实验腔室中。

13. 安装单根光纤

注意：可在图5中查看逐步示意图。

  1. 用镊子轻轻引导，将纤维从移液器尖端取出，并使用第一个缝合环将其固定在长度控制器（左侧）上。
    1. 用镊子收紧缝合环时，应采用单一、流畅的动作。确保缝线两端所受张力相等且方向相反。
    2. 第一个缝合环应系在距离长度控制器附着面末端约 1 mm 至 2 mm 的位置。
  2. 将纤维的另一端移向力传感器（右侧），并采用相同方法固定纤维。使用显微解剖剪去除多余的缝线（图 5C）。
  3. 通过 x 轴坐标微米驱动装置增大长度控制器与力传感器臂之间的距离，使纤维承受轻微张力（图 3A）。
  4. 将第二个缝合环套在第一个环之上，并将纤维固定在距离力传感器附着面末端 0.2 mm 范围内的位置（图 5D）。
    1. 使用显微解剖剪去除多余的缝线。
  5. 纤维固定过程可能导致腔室中溶液流失。如有必要，添加更多松弛溶液，以确保液面平整（既无凹面也无凸面）。在使用激光衍射法评估肌节长度时，平整的液面至关重要。
  6. 通过调节长度控制器在 y 轴方向上的位置，使纤维与实验腔室的侧壁平行。
  7. 利用棱镜侧视观察纤维，并调节长度控制器在 z 轴方向上的位置，直至纤维与腔室底部平行。
    注意：即使没有腔室棱镜，也可通过先聚焦纤维一端，然后在不调节显微镜焦距的情况下，使用另一端的 z 轴微米驱动装置将纤维另一端调至清晰，从而实现纤维与腔室底部平行的定位。
  8. 若纤维因安装过程出现任何扭曲、扭转或损伤，应弃用该纤维，并重新安装新的纤维。

14. 设定最佳肌节长度

  1. 当纤维在腔室内正确对齐后，将已校准的目标屏插入显微镜前部，并将其对准第一个实验腔室。
    注意：目标屏的校准使用标准光栅方程 λ = SL sinθ，其中 SL 为肌节长度，θ 为 0° 与 1° 衍射光束之间的衍射角，λ 为激光波长。
  2. 打开激光器，并调节载物台位置，使激光穿过纤维中心。
    警告：高浓度激光可能损伤视力。激光开启时，切勿尝试通过显微镜直接观察纤维。
  3. 调整纤维相对于激光束的位置，使激光发生衍射，并在已校准的目标屏上观察到干涉图样（图6）。关闭室内光源以更清晰地观察该图样。
    注意：若激光束位置正确但未观察到干涉图样，则提示纤维的肌原纤维结构异常或受损，应更换为新鲜纤维。
  4. 设定肌节长度时，通过长度控制器的 x 轴微米驱动器调节纤维张力，直至在目标屏上观察到所需间距的衍射光斑。
    注意：纤维的最佳肌节长度取决于样本来源物种。评估人组织来源的纤维时，通常认为 2.7 µm 的肌节长度为最佳值7,8。
  5. 设定最佳肌节长度后，测量两个最内侧缝合线之间的距离。此操作最简便的方式是使用控制腔室 x 轴运动的微米驱动器上的数字读数显示。移动腔室，使目镜的垂直十字线对准最内侧缝合线的内边缘，并将微米驱动器上的数字读数归零。
  6. 相对于显微镜沿 x 轴方向移动载物台，直至到达另一最内侧缝合线。数字显示器将显示纤维长度。该数值应记录为纤维长度，Lf。
    注意：应明确，两个最内侧缝合线之间的距离决定了被评估收缩组织的功能长度。研究者应在一系列实验中力求保持该尺寸（即 Lf）的一致性。

15. 估算横截面积（CSA）

  1. 将纤维保持在 Lf 长度，并使用显微镜附带的相机从顶部和侧面视角分别拍摄纤维中心区域的高倍图像。侧面图像可通过 chamber 侧面嵌入的棱镜进行采集。
    注意：在切换顶部与侧面视角时，仅允许沿 y 方向移动显微镜，以确保两幅图像“对齐”，从而显示同一段纤维的不同视角。
  2. 此时获取测量数据，用于后续研究中对绝对力进行归一化处理。获取这些测量值的技术将在后文描述，并在 图 7A 和 图 7B 中示出。

16. 诱发等长收缩

注意：尽管在这些实验过程中产生的数据可以不使用计算机进行收集和解读，但使用能够实现力响应信号的采集、显示、存储和分析的软件具有显著优势。我们实验室开发的自定义 LabVIEW 软件不仅具备上述功能，还可设计“运动序列”，用于控制实验过程中长度控制器的动作。

  1. 确认松弛液、预激活液和激活液的温度均稳定在 15 °C。
  2. 使用腔室控制软件将肌纤维移至含有预激活液的腔室中，并孵育 3 分钟。
    注意：预激活液对 Ca2+ 的缓冲能力较弱，因此当肌纤维转入激活液时，可实现快速激活并迅速产生张力。
  3. 在预激活液中孵育还剩 10 秒时，保持肌纤维长度为 Lf，并在实验记录中设定零张力水平。
    注意：“寻找张力零点”操作通过长度控制器移动实现，可确定对应于零张力的张力传感器输出值（即 移动过程中肌纤维短暂变松弛）。被动张力即为该零张力值与传感器调零前瞬间张力值之间的差值。
  4. 3 分钟结束后，将肌纤维转移至含有激活液的腔室，待张力迅速上升后趋于平台，此时获得最大等长张力。
  5. 达到最大等长张力后，使用长度控制器确定在激活液腔室中对应于零张力的张力传感器输出值。
    注意：由于不同溶液填充的腔室中，对应于零张力的传感器输出值通常不同，因此此步骤必不可少。
  6. 在第二次张力平台稳定后，将肌纤维移回含有松弛液的腔室。测试至此完成。若需在同一次实验中测试多根纤维，请吸除所有溶液，并加入新的预冷溶液。
    注意：在长时间反复诱导最大收缩时，应考虑采用 Brenner 的循环实验方案。该方案已被证明可有效维持最大激活状态下肌纤维的结构与力学特性9。

结果

健康的、经化学通透处理的单根肌纤维在高倍镜下观察时应形态均匀，横纹间距一致。若肌纤维在镊子操作下僵硬或存在明显结构损伤，则应弃用。

在步骤15期间拍摄的高倍数字图像用于分析纤维中段的5组配对直径测量值。假设横截面为椭圆形，并通过对5个单独的横截面积（CSA）测量值取平均，来估算纤维的横截面积，如图7A所示。图7B还说明了在一个视图中的纤维尺寸与另一视图中对应尺寸可能存在显著差异（即，横截面通常并非圆形）。

人类慢肌纤维和快肌纤维的代表性力学轨迹分别如图8A和8B所示。在测试过程中采集力传感器的电压输出，并通过数据采集与分析软件（LabVIEW）将其转换为力值（mN）。图9展示了评估最大主动收缩力（Fo）的方法，该值通过从肌肉纤维在最大激活状态下产生的最大等长收缩力（总力，FT）中减去在松弛状态下维持肌节最佳长度所需的力（被动力，FP）而计算得出。由于对应于零力的力传感器输出通常在不同的灌流槽中各不相同，因此我们在激活前和激活溶液中均短暂松弛肌纤维，以在实验记录中捕捉零力水平。将最大主动收缩力除以肌纤维的横截面积（CSA）进行归一化处理，从而获得更具信息量的比力值（sFo）。由于该参数考虑了肌纤维的横截面积，sFo可反映肌纤维收缩装置内在的产力能力，从而允许对不同大小的肌纤维进行功能比较。但需要注意的是，横截面积的测量无法区分肌纤维中收缩丝所占比例与其他亚细胞结构所占比例。

健康成年肌纤维的典型特征详见表3，其中人类数据来自 Claflin et al. 201110，小鼠数据来自 Mendias et al. 20111，大鼠数据来自 Gumucio et al. 20122。表3中所有数据均采用本文所述技术获得。

人类
（股外侧肌）		小鼠
（趾长伸肌）		大鼠
（冈下肌）
男性女性男性男性
Ⅰ型Ⅱa型Ⅰ型Ⅱa型（未分型）（未分型）
横截面积 (μm2)4880 - 69005270 - 83803870 - 54704010 - 56101850 - 30805290 - 8010
最大主动张力 Fo (mN)0.79 - 1.171.02 - 1.540.64 - 0.970.71 - 1.070.14 - 0.250.55 - 0.97
比力 sFo (kPa)142 - 182165 - 210156 - 193172 - 21467 - 94102 - 131
n1291601492073794

表3. 人类股外侧肌健康成年肌纤维的典型特征10，小鼠趾长伸肌1 和大鼠冈下肌2 肌肉 最佳肌节长度设定为 2.7 µm 用于人类肌纤维7,8 和 2.5 µm 小鼠（36,37）和大鼠纤维（38）的实验 Lf 范围（25th 和 75th 四分位数范围）分别为人类1.39–1.73 mm、小鼠1.17–1.53 mm和大鼠1.32–1.59 mm。所示范围表示25th 和 75th 四分位数，n 为测试的纤维数量。

测试过程中最常见的问题包括缝线环滑脱，这会导致力响应出现“卡顿”现象，如图10A所示；以及纤维发生部分或完全断裂，这会导致在纤维仍浸没于激活溶液中时，力响应突然下降至零或接近零（断裂），如图10B所示。如果在实验过程中发生滑脱、撕裂或断裂，应弃用该纤维并排除相关数据，但记录纤维失效情况也可能具有参考价值11。另一种可能出现的不良结果是纤维在预激活溶液中过早激活，如图10C所示。在预激活溶液中出现部分激活，提示可能存在明显的跨孔污染（即预激活孔中钙离子浓度意外升高）。此时，应抽吸并用去离子水充分冲洗所有浴槽。建议同时擦干各腔室之间的分隔表面，因为这些区域的水分或冷凝水可能导致溶液在不同浴槽之间通过毛细作用迁移。是否纳入或排除数据最终取决于实验的具体目标，因此在实验设计阶段就应予以考虑。

显微镜下的卷曲导线，展示薄膜结构，比例尺为250 µm，用于材料分析。
图1：缝合线环（10-0单丝尼龙缝合线）。

显微镜实验装置，实验技术人员使用显微操作器进行精确样品分析。
图2： 束状解剖。 镊子持于左手，显微解剖剪持于右手。红线表示手腕与剪刀相对于纤维长轴的理想方向。

用于光学检测的显微镜装置，配有可调节的载物台和样品 holder 装置。
图 3: (A) 带有标注组件的测试装置。(a) 具有透明底部的实验腔室。(b) 长度控制器。(c) 力传感器。(d) 光源。(e) 带数字显示的长度控制器 x-y-z 微米驱动装置。(f) 带数字显示的载物台微米驱动装置。(g) 力传感器 x-y-z 微米驱动装置。(h) 用于校准激光衍射靶屏的平台。(i) 隔振台。(B) 实验腔室的特写视图。(j) 从长度控制器延伸出的不锈钢连接表面。(k) 从力传感器延伸出的不锈钢连接表面。(l) 侧视棱镜。(m) 热电制冷模块的外壳。(n) 用于报告腔室温度的热电偶。

喷嘴几何结构的显微镜图像，顶视图和侧视图；1 mm 比例尺，精密仪器分析。
图 4：经改造的 100 µl 移液器吸头，用于将纤维从解剖皿转移至实验腔室。

微尺度自切过程；纤维脱离；实验装置；机械分离分析。
图 5： 将单根纤维安装到实验装置上。（A）已制备的缝合环穿入不锈钢固定表面。（B）将纤维转移至实验腔室。（C）用第一对缝合环将纤维锚定在不锈钢固定表面上，并剪除多余的缝合线。（D）将第二对缝合环从第一对缝合环上方穿过并打结固定。

用于DNA分析的光学激发显微镜装置，包含激光准直和光谱检测。
图6: 通过将激光干涉图样投射到已校准的目标屏幕上来评估肌节长度。 (a) 激光源。 (b) 反射镜。 (c) 目标屏幕。 (d) 激光干涉图样。

显微镜光学装置示意图；公式：CSA=ΣAᵢ/5，Σπaᵢbᵢ/5；光纤分析。

显微图像，纤维的顶视图和侧视图，突出显示在100µm尺度下的结构片段。
图7：（A）在最佳肌节长度下测定纤维的横截面积（人类为2.7 µm）。假设横截面为椭圆形，计算纤维中段五个位置的横截面积（CSA），并以五个独立测量值的平均值作为纤维的CSA。2a代表顶视图直径，是椭圆的一个轴；2b代表侧视图直径，是椭圆的另一个轴。（B）代表性纤维图像，展示在顶视图和侧视图中分别进行的五个对应直径测量。

Muscle fiber contraction graph; Type 1 vs. Type 2a; force measurement; kPa; time in seconds.
图8： 健康人代表性力信号轨迹 股外侧肌 肌纤维 (A1型肌纤维（横截面积：CSA） 5710 µm2，Fo0.89 mN 和 sFo：156 kPa）。B2型a型肌纤维（横截面积：CSA: 9510 µm2，Fo：1.66 mN 和 sFo：174 kPa）。通过电泳分离和银染技术确定肌纤维肌球蛋白重链类型。22.

静力学平衡图；力-长度分析；张力-位移曲线；力学研究
图9：最大主动收缩力（Fo）的计算。（a）在预激活溶液中启动长度控制器产生松弛运动期间，肌纤维受力响应的放大视图。FP 表示在静息状态下维持肌节长度为 2.7 µm 所需的力。（b）长度控制器诱导松弛运动的放大视图。注意 Fo = FT – FP。

显示50 kPa应力下力学响应的力-时间图，图A、B、C。
图10：（A）缝合环滑脱，表现为力信号上升过程中出现“卡顿”。在激活纤维前，请检查确认缝合环已牢固固定。（B）纤维在激活过程中断裂，可能由纤维本身完整性差或在缝合环安装过程中操作过于剧烈所致。（C）由于预激活腔室被Ca2+污染，导致纤维提前部分激活。

讨论

对透化的单根骨骼肌纤维收缩特性的评估被广泛应用于多种情境下的肌肉功能研究。例如，已有研究评估了衰老12、运动10,13,14、太空飞行15、损伤2,3,16、药物处理17,18、疾病19以及基因操作20,21对肌纤维结构与功能的影响。由于该技术能够直接评估肌原纤维在其天然构型下的收缩性能，因此为理解肌原纤维功能提供了一个理想平台，避免了在研究系统中包含神经肌肉信号传递和兴奋诱导的钙释放时可能产生的混杂效应。此外，单根肌纤维的功能测试还可用于补充收缩蛋白鉴定的结果，例如通过免疫组织化学或凝胶电泳联合蛋白质印迹法（western blot）所获得的结果22。

骨骼肌的主要功能之一是产生力量。因此，sFo 作为衡量收缩系统内在产力能力的指标，受到肌肉生理学家的高度关注。对 sFo 的可靠估算需要准确测定肌纤维横截面积（CSA）和 Fo。由于肌纤维的横截面通常既非圆形，沿其长度方向的横截面积也不均匀，因此在估算 CSA 时必须格外谨慎。为此，需在肌纤维长度方向上的多个位置进行测量，且在每个位置均从相互垂直的两个视角（相隔 90°）进行观测。对 Fo 的可靠测量则需要注意多个细节，包括校正被动张力、调节肌节长度以实现粗肌丝与细肌丝的最大重叠、使用钙离子浓度足以引起最大激活的激活溶液、维持所需的实验温度，以及在实验前对肌纤维保持适当的储存条件（温度和储存时长）。

尽管此处所述步骤描述了评估最大等长收缩力的方法，但通常还需要评估骨骼肌纤维的其他重要功能特性。这可以通过扩展实验方案，增加对肌纤维的其他力学操控来实现。例如，通过测量肌纤维在一系列不同负荷下缩短的速度，可以确定力-速度关系，并由此计算出力-功率和速度-功率关系10,23,24。此外，可通过“松弛测试”（slack test）25测定无负荷缩短速度，该方法包括施加一系列引起松弛的缩短步骤，并测量肌纤维消除松弛所需的时间。另一个常被报道的动力学参数是ktr，即在机械扰动导致所有横桥暂时解离后，力量恢复的速率常数26。最后，钙离子浓度与主动生力之间的关系（即“力-pCa关系”）也常受到关注18，可通过将肌纤维暴露于一系列钙离子浓度逐步升高的溶液中来测定，这些溶液的钙浓度范围从低于激活收缩系统的阈值，到足以引发最大激活并产生最大力量（Fo）的浓度。

尽管评估单根肌纤维收缩力需要上述大部分设备，但某些设备并非绝对必要。例如，长度控制器对于需要快速或精确拉长或缩短肌纤维的实验方案至关重要，但在测定最大等长收缩力时并非必不可少（尽管仍需通过某种方式确定力信号记录中的零力水平）。用于从侧面观察纤维的棱镜在评估横截面积时虽有帮助，但在将纤维定位至实验腔室时并非绝对必需。此外，可采用其他方法使纤维暴露于不同实验溶液中，例如设计手动操作的多腔室系统，或使用单个腔室实现溶液的快速灌注与更换。最后，尽管常采用15 °C等低于生理温度的实验温度以提高力学测量的可重复性1,2,3,5,8,12,17,27，可以在其他温度下获得有效的数据23,28 只要温度对溶液性质（钙浓度、pH）的影响 等等。) 被纳入考虑范围。

测试溶液的成分是本文所述透化肌纤维技术中最关键的因素之一。关于溶液成分的考虑较为复杂，已超出本文的讨论范围。方案部分第5步中描述的溶液设计重点在于：当肌纤维从预激活溶液转移至激活溶液时，能够实现透化肌纤维的快速激活，同时保持恒定的离子强度、阳离子组成和渗透压6,29。其他研究团队已采用其他溶液配方并取得了显著成功，通常基于已发表的结合常数和计算工具27,30,31。在涉及亚最大激活的研究（如力-钙关系评估）中，不同激活溶液中钙离子的浓度尤为关键。对于肌纤维完全激活的实验（如本文所述），激活溶液中的钙离子浓度通常远高于产生最大收缩力所需的浓度，因此其精确浓度的重要性相对较低。添加磷酸肌酸对于缓冲肌原纤维内原本会因收缩活动而产生的ATP和ADP波动至关重要。肌酸激酶是催化磷酸基团从磷酸肌酸转移至ADP所必需的。在导致ATP高周转率的实验条件下（包括高温操作或在快肌纤维中测量高速缩短过程32），必须在溶液中额外添加肌酸激酶，以补充仍结合在肌纤维上的内源性肌酸激酶。在要求较低的实验条件下，ATP再生系统的重要性则相对较小27。

透化单肌纤维技术的局限性包括以下几点。这些测试所生成的数据仅能定义连接到实验装置上的特定肌原纤维单元的收缩特性。因此，该方法仅捕获了所取片段来源的整个多核肌纤维的一小部分，而这一小部分又仅代表肌肉内所有肌纤维总数中的一小部分。因此，研究人员应仔细考虑实验结论所需支持的取样充分性。此外，评估运动训练干预对肌纤维功能的影响，其前提是所检测的肌纤维确实在训练过程中被募集。尽管该实验方案试图模拟肌纤维内天然的细胞内环境，但肌膜透化过程是非特异性的，必然导致可溶性细胞内成分自由扩散至浸泡溶液中。膜通透性的另一后果是渗透平衡的改变，表现为肌纤维体积的肿胀33。肌纤维肿胀增加了肌动蛋白与肌球蛋白丝之间的距离，导致肌丝系统对钙离子的敏感性降低34,35，但可通过引入大分子、具有渗透活性的化合物来逆转这一现象34。另一个需要考虑的最终局限性在于将肌纤维连接至实验装置所采用的技术所带来的影响。该过程不可避免地会扭曲附着点处及附近的肌丝系统空间结构，从而引发相应的功能缺陷。具体而言，肌纤维在附着点及其邻近区域的功能受损，因而会向测量系统引入人为的串联弹性成分。

总之，我们介绍了一种评估经化学透化处理的骨骼肌纤维产生力量能力的方法。 体外尽管本文的重点是评估人类骨骼肌纤维的最大等长收缩力，但该实验方法可经修改和拓展，用于测定多种物种（包括哺乳类及其他类群）的一系列动力学参数及其相互关系。

披露

本文的出版和免费访问由 Aurora Scientific 赞助

致谢

本研究工作由以下资助来源支持：R01-AR063649，AG-020591，F31-AR035931。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
带盖聚苯乙烯培养试管Fisher Scientific 14-956-3D
0.5 ml 螺口微量离心管Fisher Scientific 02-681-334
带O形圈的0.5 ml 微量离心管盖Fisher Scientific 02-681-358
微量离心管冻存盒Fisher Scientific 5055-5005
pH计Mettler-ToledoFE20
培养皿Fisher Scientific 08-757-11YZ
非无菌10-0单股缝合线Ashaway Line TwineS30002
昆虫针Fine Science Tools26002-10
镊子 - Dumont #5Fine Science Tools11251-20
显微解剖剪刀Fine Science Tools15000-08
体视显微镜Leica MicrosystemsMZ8
微米驱动装置Parker Hannifin3936M
温度计PhysitempBAT-12
水浴循环器 Neslab InstrumentsRTE-111
温度控制器Alpha Omega InstrumentsSeries 800
LabVIEW 软件National Instruments-
计算机Varied-
腔室系统Aurora Scientific802D
长度控制器Aurora Scientific312C
力传感器Aurora Scientific403A
试剂
K-丙酸盐TCI AmericaP0510
咪唑Sigma-AldrichI0125
MgCl2•6H20Sigma-AldrichM2670
Brij 58Sigma-AldrichP5884
EGTA（酸形式）Sigma-AldrichE0396
Na2H2ATP•0.56H2OSigma-AldrichA7699
甘油Sigma-AldrichG6279
HEPES（酸形式）Sigma-AldrichH7523
MgOSigma-Aldrich529699
HDTA（酸形式）TCI AmericaD2019
CaCO3Sigma-AldrichC4830
NaN3Sigma-AldrichS8032
KOH（1 N）Sigma-Aldrich35113
HCl（1 N）Sigma-Aldrich318949
Na2CrP•4H2OSigma-AldrichP7936
pH 10 标准液Fisher ScientificSB115
pH 7 标准液Fisher ScientificSB107

参考文献

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透化骨骼肌纤维产生的最大等长收缩力的测定
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