使用高效液相色谱法测定培养细胞和动物组织中DNA氧化生物标志物8-oxo-7,8-dihydro-2'-deoxyguanosine

摘要

本实验方案的目的是通过高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）检测培养细胞或动物组织DNA中的DNA氧化标志物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo）。

摘要

氧化应激与多种生理和病理过程以及外源性物质代谢相关，可导致包括DNA在内的生物大分子发生氧化。因此，高效检测DNA氧化对医学、毒理学等多个研究领域具有重要意义。氧化损伤DNA的一个常见生物标志物是8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo；常被误称为8-羟基-2'-脱氧鸟苷，8-OH-dGuo或8-oxo-dG）。已有多种采用高效液相色谱-电化学检测法（HPLC-ED）测定8-oxo-dGuo的实验方案被报道。然而，这些方法主要应用于经促氧化剂处理的纯化DNA。此外，由于各实验室在方法学上的差异，尤其是分析仪器的不同，各实验室在采用已发表的HPLC-ED法检测8-oxo-dGuo时，均需进行细致的优化。目前尚缺乏系统描述此类优化过程的完整实验方案。本文提供了一种详细的HPLC-ED法检测培养细胞或动物组织DNA中8-oxo-dGuo的实验流程，展示了如何简便、快速地优化DNA样品制备过程，以最大限度减少样品处理过程中可能发生的非特异性DNA氧化。本方案还演示了在培养的人肺泡腺癌细胞中检测8-oxo-dGuo的方法即，经氧化剂KBrO₃处理的A549细胞）₃，以及暴露于多环芳烃二苯并（def,p)屈（DBC，以前称为二苯并(a,l)芘，DalP）。总体而言，这项工作展示了如何对高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ED）方法进行简便优化，以实现对生物样品中8-oxo-dGuo的检测。

引言

活性氧（ROS）在多种病理状况和异源物质代谢过程中其稳态水平可能升高，从而导致氧化性DNA损伤的发生频率增加。在多种可能的碱基氧化产物中，氧化性DNA损伤可通过稳定的生物标志物8-氧代-7,8-二氢-2'-脱氧鸟苷（8-oxo-dGuo）进行便捷检测，该物质是2'-脱氧鸟苷（dGuo）的氧化形式之一¹。8-oxo-dGuo是含量最丰富的DNA损伤产物²，因此尽管存在多种DNA氧化产物，它仍被更深入地研究作为DNA氧化的生物标志物³。在人体中，这种损伤可通过8-氧代鸟嘌呤糖苷酶1（hOGG1）介导的碱基切除修复途径进行修复⁴。若未被修复，8-oxo-dGuo可导致碱基对置换突变（即 G至T颠换）的发生⁴。重要的是，8-oxo-dGuo已被确立为与致癌作用的启动和促进相关的DNA损伤标志物²。因此，对8-oxo-dGuo进行准确定量是评估氧化性DNA损伤的一种有用且理想的生物标志物⁵。

关于氧化损伤型2-脱氧鸟苷的正确命名，以及通常作为氧化DNA损伤生物标志物所检测的化合物的正确名称，目前文献中存在广泛混淆⁶。8-氧代-dGuo的6,8-二酮式和6-烯醇-8-酮式互变异构体（见图1）是文献中讨论最多的两种主要互变异构体^5,7。在生理p....

方案

确保所有动物饲养、饲养环境、操作和实验均遵守当地的法规，并在开始任何研究之前获得实验方案的批准。对于本研究所描述的实验，动物护理、操作和处理均已通过加拿大卫生部动物护理委员会的批准。供应商信息见“试剂表”。

1. 生物样本的采集

1. 细胞或动物组织
   1. 在含有10%胎牛血清、100单位/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素的F12-K培养基中培养人肺泡腺癌A549细胞。
   2. 以每10厘米培养皿约100万个细胞的密度接种细胞。每次实验共使用12个培养皿（每个生物学重复3个培养皿 × 4个剂量组），以获得足量DNA（80 μg）用于酶切消化和高效液相色谱分析。
   3. 当细胞密度超过培养皿表面积的约70%时，移除培养基，并用4 ml磷酸盐缓冲液（PBS，pH 7.4）洗涤细胞两次。
   4. 对于培养的动物细胞，使用 KBrO₃ 作为阳性对照。
      注意：KBrO 与线性正相关关系₃ 浓度与8-oxo-dGuo频率之间的关系已有文献报道⁹.
   5. 将 KBrO 溶解₃ 在 PBS 中，确保其在细胞培养基中的终浓度大于 1 mM，以获得相对于未暴露细胞显著增加的 8-oxo-dGuo 水平。加入相同浓度的 KBrO₃ 向系列中的每块板加入（例如，1....

结果

dGuo 的保留时间为 4.7 分钟，而 8-oxo-dGuo 的保留时间约为 6.4 分钟（图 2A 和 B）。如 图 2C 所示，两种分析物的峰高相差约 1,000 倍。通过在 +0.2 至 +1.1 V 的工作电位范围内运行标准品，获得 8-oxo-dGuo 和 dGuo 的伏安图。8-oxo-dGuo 的最佳工作电位确定为 +0.5 V，dGuo 为 +0.9 V（图 3）。这些电位值与文献中报道的其他玻碳电极结果一致^14,15。据报道，8-oxo-dGuo 和 dGuo 的电化学检测限和动态范围分别处于飞摩尔（femtomole）和纳摩尔（nanomole）水平^8,9。应每天运行 dGuo 和 8-oxo-dGuo 的标准曲线，以确保在合适的浓度范围内实现线性检测以及仪器的正常性能（图 4）。标准曲线通过将峰面积对已知分析物浓度作图构建（补充图 2），从而可根据标准曲线生成的方程计算.......

讨论

尽管8-oxo-dGuo已被报道为DNA氧化的一种有用生物标志物，但其准确定量仍具有挑战性。虽然已有多种发表的方法，但仍缺乏对实验方案的全面、详尽描述，以帮助研究人员在各自实验室中成功应用该方法。本文提供了一种基于高效液相色谱（HPLC）的详细实验方案概述，可帮助新用户建立有效的8-oxo-dGuo检测与定量方法。

目前已报道三种用于定量8-oxo-dGuo的主要方法。这些方法包括基于酶联免疫吸附测定（ELISA）的商业试剂盒¹⁹、液相色谱/质谱（MS）法（例如，其他文献中所述方法⁹）以及高效液相色谱-电化学检测（HPLC-ED）法，后者如本文所述。ELISA方法可能受到生物样品中某些化合物的干扰¹⁹。通常认为，与基于ELISA的方法相比，采用色谱技术获得的结果在8-oxo-dGuo定量方面更为可靠²⁰。在比较HPLC-ED方法与基于MS的方法时，前者的优点在于设备成本相对较低（即，大约比基于MS方法所需设备便宜一个数量级）。此外，HPLC-MS方法优于HPL.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
8-oxo-dGuo 标准品	Cayman Chemical Company	89320	不恰当地被称为 "8-羟基-2'-脱氧鸟苷"；详见 图1 及正文说明。
碱性磷酸酶	Sigma-Aldrich	P5931	来源于 E. coli
Chelex 100	Sigma-Aldrich	C7901	螯合重金属
去铁胺甲磺酸盐	Sigma-Aldrich	D9533
dGuo 标准品	Sigma-Aldrich	D7145
磷酸氢二钠	Sigma-Aldrich	S9390
鲑鱼精子DNA	Sigma-Aldrich	D1626	钠盐
DNase I	Sigma-Aldrich	D4527	II型，来源于牛胰腺
DNAzol	Invitrogen	10503-27
乙二胺四乙酸二钠盐二水合物（EDTA）	Sigma-Aldrich	E4884	该化合物在溶液pH值调节至8.0之前不会完全溶解（例如 使用NaOH）
F12-K培养基	ATCC	30-2004
胎牛血清	ATCC	30-2020
保护柱	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 0204GC	防止色谱柱污染；也可能导致压力升高
氯化镁	Sigma-Aldrich	M8266
磷酸二氢钠	Sigma-Aldrich	S9638
青霉素-链霉素	Invitrogen	15140-122
磷酸盐缓冲液	Invitrogen	15190-250
磷酸二酯酶I酶	Sigma-Aldrich	P3243	II型，来源于响尾蛇（Crotalus adamanteus）毒液
特氟龙匀浆器	Thomas Scientific	7724T-1 或 7724T-5（分别用于1 mL或5 mL）	体积（容纳容量）取决于待处理样品的量。
胰蛋白酶	Invitrogen	15050-065
YMC-BASIC键合球形硅胶柱	Chromatographic Specialties	YBA 99S03 1546WT