圆筒实验中的前肢不对称性经典分析通常用于评估脑损伤或中风后大鼠的行为缺陷；然而，该方法无法在小鼠中检测到一致的缺陷。本研究表明，量化前爪拖拽行为是对小鼠脑损伤更为敏感的分析方法。
需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用
本文内容
摘要
摘要
圆筒试验通常用于预测啮齿类动物前肢运动皮层的局灶性缺血性损伤。当动物被放置在圆筒中时，会通过后肢直立并以前肢爪子接触圆筒壁来探索环境，以维持姿势稳定。在前肢感觉运动皮层发生缺血性损伤后，大鼠会更多地依赖未受影响的前肢爪子来支撑身体，导致患侧前肢接触次数减少，这种现象称为前肢不对称。相比之下，小鼠脑部的局灶性缺血损伤通常不会引起类似且一致的前肢不对称缺陷。尽管前肢不对称缺陷较少被观察到，但小鼠在卒中后表现出一种新的行为，称为“拖爪”。“拖爪”是指小鼠在由直立姿态转为四足站立时，倾向于将其受影响的爪子沿圆筒壁拖行，而不是直接从筒壁推离。我们先前已证明，拖爪行为对前肢运动皮层的小范围皮质缺血性损伤具有高度敏感性。本文提供了拖爪行为分析的详细实验方案，明确定义了何为拖爪行为，并演示了如何量化该行为。圆筒试验操作简便、成本低廉，无需预先训练或食物剥夺。结合拖爪分析的圆筒试验，填补了在预测皮质缺血性损伤（如光化学血栓形成和内皮素-1（ET-1）诱导的缺血）方面的空白——这两种模型日益流行，且产生的局灶性损伤比大脑中动脉阻塞模型更小。最后，在圆筒试验中测量拖爪行为，将有助于利用多种转基因小鼠品系开展皮质损伤后功能恢复的研究，而以往的前肢不对称分析在这些品系中往往无法检测到一致的缺陷。
引言
神经再生策略的目标是同时证明组织修复和功能恢复。功能恢复通常通过行为学测试来评估，这些测试用于测量功能缺损，特别是在与特定脑区损伤相关的运动技能方面。皮层感觉运动前肢区域的创伤性脑损伤或缺血性损伤可通过多种行为学测试加以验证。其中一种测试——圆筒测试，被广泛用于大鼠以评估前肢活动的功能缺损1。该测试设置成本较低，仅需一个圆筒、一台摄像机以及带有透明顶面的桌子即可完成。该测试易于实施，因其基于啮齿类动物自然的探索行为，因此无需预先训练，也无需食物剥夺或奖励。尽管具有诸多优势，圆筒测试在评估小鼠局灶性前肢感觉运动皮层损伤后的前肢功能缺损方面却未被充分利用，我们认为这主要归因于小鼠在圆筒测试中的行为分析方法。前肢不对称性是圆筒测试的经典分析指标。当动物被放入圆筒中时，会自然地以后肢直立，用前肢爪子触碰圆筒壁以维持姿势平衡。在此探索过程中，通过录像可轻松量化每侧前肢爪子接触圆筒壁的次数。当前肢受损侧爪子接触壁的次数少于未受损侧时，即出现前肢不对称性，提示对侧感觉运动皮层受损。在大鼠中，向感觉运动前肢皮层内注射血管收缩剂内皮素（Endothelin, ET-1），可造成局灶性缺血性病灶，导致对侧前肢出现行为功能缺损。对侧前肢使用减少的功能缺损可通过大鼠圆筒测试中前肢不对称性的变化被明确检测到1-3。然而与大鼠不同的是，在接受类似ET-1注射后的小鼠中，前肢不对称性的变化较为多变且一致性较差4-6。本文中，我们介绍一种圆筒测试中前肢行为的新分析方法——爪拖曳行为分析。我们先前已....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
方案
伦理声明：所有实验均根据加拿大动物护理委员会的指南，经纽芬兰纪念大学动物护理伦理委员会批准。
1. 小鼠
- 使用成年小鼠。本研究采用2-4月龄的成年雄性FVBN小鼠（n=10）。将小鼠饲养在12:12小时反向光暗循环环境中，提供标准啮齿类动物饲料和水 随意供应.
2. 圆筒实验所需材料
- 准备一张顶部透明的桌子用于拍摄圆筒实验。桌子的具体尺寸无关紧要，但顶部必须由有机玻璃或玻璃制成，并且桌子下方需留有足够的空间放置一面镜子，以便从下方对小鼠进行录像。将镜子置于桌子下方，通过圆筒反射成像。作为替代方案，如有条件，也可使用倒置的摄像机。本实验方案中所用桌子的尺寸为 54 × 56 × 66.5 cm（宽 × 长 × 高），顶部尺寸为 51 × 51 cm（宽 × 长）。
- 准备一面镜子。本实验方案中所用镜子的尺寸为 34 × 58 cm（宽 × 长）。
- 准备一个透明/有机玻璃圆筒供小鼠进行实验。本实验方案中所用圆筒的尺寸为高 17.5 cm，内径 8.8 cm，外径 9.5 cm，壁厚 0.35 cm。对于活动性更强的小鼠品系，可能需要更高一些的圆筒。
- 将圆筒放置在桌面上，并通过下方的镜子拍摄其反射影像。
- 需要配备一台摄像机和三脚架。视频录制码率约为 650 Kb/s，相当于每 5 分钟的圆筒视频约占用 190 M....
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
结果
我们先前已证实，前肢感觉运动皮层局灶性缺血损伤后会出现前肢拖拽行为，该行为是损伤的阳性指标4在前肢感觉运动皮层内注射ET-1以诱导缺血性损伤图 8A、B）。本研究旨在检测爪拖曳行为是否在损伤后持续超过14天，以评估其用于判断功能恢复的潜力。在ET-1注射前一日（术前时间点）以及损伤后第1、3、7、14、21和28天，对小鼠进行圆筒实验测试。在每个时间点，分别量化损伤侧与未损伤侧前爪的触碰次数和拖曳次数。对触碰次数进行双因素重复测量方差分析，结果显示时间具有显著的主效应［F(6,108) = 3.59， P=0.0028] 以及受试者 [F(18,108) = 2.38， P=0.0032]，但治疗因素无显著效应（表1）。而采用圆筒实验中前肢不对称性的标准分析方法，即量化患侧爪触碰次数占总爪触碰次数的百分比，结果显示前肢行为缺陷不一致。对患侧爪使用率进行单因素重复测量方差分析，结果显示时间因素具有显著主效应（p=0.015），经Dunnett事后检验表明，术后7、14和21天患侧爪使用率显著降低，至术后28天恢复图8C
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
讨论
在圆筒实验中定量分析前肢拖拽行为时，需明确以下关键点：i) 在脑损伤前，分别定量记录每侧前肢的拖拽次数与前肢总接触次数，以建立基线数据；ii) 在缺血性损伤后，分别定量记录每侧前肢的拖拽次数与前肢总接触次数；iii) 区分前肢拖拽行为与小鼠躯干侧向旋转时前肢沿圆筒壁产生的侧向移动动作。
爪拖拽是一种在前肢感觉运动皮层受损后出现的新行为。因此，爪拖拽行为的出现可作为前肢感觉运动皮层已受损伤的阳性指标。代表性结果显示，体积约为 2–4 mm3、且局限于前肢感觉运动皮层的小型 ET-1 梗死灶可导致爪拖拽行为。这与前肢不对称性分析形成对比，后者在检测 ET-1 所致缺血性皮层损伤后患侧爪接触次数占总接触次数的百分比变化时，无法发现一致的功能缺陷4-6。因此，对爪拖拽行为的分析在检测前肢感觉运动皮层损伤方面更为敏感。此外，由于爪拖拽行为可持续至损伤后四周，该指标也可能适用于功能恢复的分析。我们先前已证实，爪拖拽行为与前肢感觉运动皮层的损伤具有相关性4，因此，多种损伤模型均可从圆筒实验中的此项分析中获益。尽管诸如大脑中动脉闭塞.......
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 John Crowell 先生和 Terry Upshall 先生在摄影和摄像方面提供的专业技术支持与协助。本研究得到了加拿大卫生研究院以及纽芬兰研究与发展公司向 JLV 提供的运营资助，以及心脏 & 加拿大卒中基金会加拿大卒中康复合作伙伴催化基金。RBR 获得了基思·格里菲斯纪念心脏基金 & 中风基金会研究生奖学金
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 有机玻璃圆筒 | 高 17.5 cm，外径 9.5 cm，内径 8.8 cm，壁厚 0.35 cm（或 3.5 mm） | ||
| 观察台 | 54×56×66.5 cm（宽×长×高），台面为一块 51×51 cm 的有机玻璃板 | ||
| 镜子 | 34×58 cm 的镜子 | ||
| 摄像机 | Sony | DCR-SR42 | 内置存储、支持 SD 卡、具备 40 倍光学变焦功能的摄像机 |
| 计算机 | Dell | Optiplex 760 | 处理器：Intel，3.0 GHz，内存 4.00 GB（RAM） |
| 计算机显示器 | Samsung | S22C350H | |
| Excel（Microsoft Office Professional Plus） | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC 媒体播放器 | Video LAN | v2.1.2 | 支持播放速度调节和视频播放的媒体播放器 |
| 外置硬盘 | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
参考文献
- Schallert, T., Fleming, S. M., Leasure, J. L., Tillerson, J. L., Bland, S. T. CNS plasticity and assessment of forelimb sensorimotor outcome in unilateral rat models of stroke, cortical ablation, parkinsonism and spinal cord injury. Neuropharmacology. 39, 777-787 (2000).
- Kolb, B., et al.
访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
重印与许可
