圆筒实验中的前肢不对称性经典分析通常用于评估脑损伤或中风后大鼠的行为缺陷；然而，该方法无法在小鼠中检测到一致的缺陷。本研究表明，量化前爪拖拽行为是对小鼠脑损伤更为敏感的分析方法。
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摘要
摘要
圆筒试验通常用于预测啮齿类动物前肢运动皮层的局灶性缺血性损伤。当动物被放置在圆筒中时，会通过后肢直立并以前肢爪子接触圆筒壁来探索环境，以维持姿势稳定。在前肢感觉运动皮层发生缺血性损伤后，大鼠会更多地依赖未受影响的前肢爪子来支撑身体，导致患侧前肢接触次数减少，这种现象称为前肢不对称。相比之下，小鼠脑部的局灶性缺血损伤通常不会引起类似且一致的前肢不对称缺陷。尽管前肢不对称缺陷较少被观察到，但小鼠在卒中后表现出一种新的行为，称为“拖爪”。“拖爪”是指小鼠在由直立姿态转为四足站立时，倾向于将其受影响的爪子沿圆筒壁拖行，而不是直接从筒壁推离。我们先前已证明，拖爪行为对前肢运动皮层的小范围皮质缺血性损伤具有高度敏感性。本文提供了拖爪行为分析的详细实验方案，明确定义了何为拖爪行为，并演示了如何量化该行为。圆筒试验操作简便、成本低廉，无需预先训练或食物剥夺。结合拖爪分析的圆筒试验，填补了在预测皮质缺血性损伤（如光化学血栓形成和内皮素-1（ET-1）诱导的缺血）方面的空白——这两种模型日益流行，且产生的局灶性损伤比大脑中动脉阻塞模型更小。最后，在圆筒试验中测量拖爪行为，将有助于利用多种转基因小鼠品系开展皮质损伤后功能恢复的研究，而以往的前肢不对称分析在这些品系中往往无法检测到一致的缺陷。
引言
神经再生策略的目标是同时证明组织修复和功能恢复。功能恢复通常通过行为学测试来评估，这些测试用于测量功能缺损，特别是在与特定脑区损伤相关的运动技能方面。皮层感觉运动前肢区域的创伤性脑损伤或缺血性损伤可通过多种行为学测试加以验证。其中一种测试——圆筒测试，被广泛用于大鼠以评估前肢活动的功能缺损1。该测试设置成本较低，仅需一个圆筒、一台摄像机以及带有透明顶面的桌子即可完成。该测试易于实施，因其基于啮齿类动物自然的探索行为，因此无需预先训练，也无需食物剥夺或奖励。尽管具有诸多优势，圆筒测试在评估小鼠局灶性前肢感觉运动皮层损伤后的前肢功能缺损方面却未被充分利用，我们认为这主要归因于小鼠在圆筒测试中的行为分析方法。前肢不对称性是圆筒测试的经典分析指标。当动物被放入圆筒中时，会自然地以后肢直立，用前肢爪子触碰圆筒壁以维持姿势平衡。在此探索过程中，通过录像可轻松量化每侧前肢爪子接触圆筒壁的次数。当前肢受损侧爪子接触壁的次数少于未受损侧时，即出现前肢不对称性，提示对侧感觉运动皮层受损。在大鼠中，向感觉运动前肢皮层内注射血管收缩剂内皮素（Endothelin, ET-1），可造成局灶性缺血性病灶，导致对侧前肢出现行为功能缺损。对侧前肢使用减少的功能缺损可通过大鼠圆筒测试中前肢不对称性的变化被明确检测到1-3。然而与大鼠不同的是，在接受类似ET-1注射后的小鼠中，前肢不对称性的变化较为多变且一致性较差4-6。本文中，我们介绍一种圆筒测试中前肢行为的新分析方法——爪拖曳行为分析。我们先前已证明，在小鼠中，爪拖曳行为分析比传统的前肢不对称性分析更能敏感地反映前肢感觉运动皮层的损伤，因此适用于多种局灶性皮层损伤模型。
在前肢感觉运动皮层发生缺血性损伤后，观察前爪接触圆筒壁的方式，发现小鼠出现了一种新的行为——前爪拖拽4。当前肢感觉运动皮层受损侧（对侧损伤）的前爪在小鼠以后肢直立探索圆筒壁时，沿着圆筒壁向中线或向下拖动，而未受损的前爪则在筒壁上提供姿势支撑，即发生前爪拖拽。前爪拖拽在未受伤小鼠中极为罕见，因此该行为的出现是前肢感觉运动皮层损伤的明确指征4。我们此前已在小鼠前肢感觉运动皮层接受ET-1诱导的缺血性损伤后，对前爪拖拽行为进行了量化分析，并证实小鼠在卒中后长达两周内持续表现出该行为4。本文结果显示，前爪拖拽行为可持续至卒中后四周。对前爪拖拽行为的分析为评估小鼠前肢感觉运动皮层局灶性缺血性损伤提供了一种新颖且敏感的工具。该方法设备成本低廉、操作与评分简便，是一种快速评估小鼠前肢行为缺陷的简单而有效的手段。
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方案
伦理声明：所有实验均根据加拿大动物护理委员会的指南，经纽芬兰纪念大学动物护理伦理委员会批准。
1. 小鼠
- 使用成年小鼠。本研究采用2-4月龄的成年雄性FVBN小鼠（n=10）。将小鼠饲养在12:12小时反向光暗循环环境中，提供标准啮齿类动物饲料和水 随意供应.
2. 圆筒实验所需材料
- 准备一张顶部透明的桌子用于拍摄圆筒实验。桌子的具体尺寸无关紧要，但顶部必须由有机玻璃或玻璃制成，并且桌子下方需留有足够的空间放置一面镜子，以便从下方对小鼠进行录像。将镜子置于桌子下方，通过圆筒反射成像。作为替代方案，如有条件，也可使用倒置的摄像机。本实验方案中所用桌子的尺寸为 54 × 56 × 66.5 cm（宽 × 长 × 高），顶部尺寸为 51 × 51 cm（宽 × 长）。
- 准备一面镜子。本实验方案中所用镜子的尺寸为 34 × 58 cm（宽 × 长）。
- 准备一个透明/有机玻璃圆筒供小鼠进行实验。本实验方案中所用圆筒的尺寸为高 17.5 cm，内径 8.8 cm，外径 9.5 cm，壁厚 0.35 cm。对于活动性更强的小鼠品系，可能需要更高一些的圆筒。
- 将圆筒放置在桌面上，并通过下方的镜子拍摄其反射影像。
- 需要配备一台摄像机和三脚架。视频录制码率约为 650 Kb/s，相当于每 5 分钟的圆筒视频约占用 190 Mb 存储空间。确保摄像机具备变焦功能，以便使圆筒充满整个视野。
注：本实验方案中使用的摄像机为 Sony DCR-SR42，具备 40 倍光学变焦、2,000 倍数字变焦、680k 像素，采用标准清晰度 NTSC 隔行扫描视频格式。 - 准备用于分析的软件——需具备视频播放和播放速度调节功能的媒体播放器。本实验方案中使用的媒体播放器为 VLC Media Player v2.1.2。
- 准备一台能够运行该媒体播放器的操作系统并配备显示器的计算机。
- 需要电子存储设备保存视频。可将视频下载至外接硬盘，或刻录至 DVD 以长期保存。
注：按每个视频 190 Mb 计算，16 GB 的 SD 卡可存储 84 次实验视频，32 GB 的 SD 卡可存储 168 次实验视频。鉴于 SD 卡成本相对较低，且部分小鼠完成 20 次直立所需时间存在不确定性，建议使用 32 GB 的 SD 卡。在本研究中，视频首先从摄像机复制到 2 TB 的外接硬盘，随后再转存至 DVD 作为备份。
3. 圆筒实验的实验设置
- 将镜子固定在桌下，使其与桌面呈45度角。使用两个支架分别固定在桌腿上，以支撑镜子的顶部和底部。支架的位置在桌子的侧视图（图1A）和正视图（图1B）中标注。
- 将圆筒放置在桌面中央。用黑色记号笔（Sharpie）在圆筒与桌面接触的位置画出四条等距的标记线，以便将圆筒抬起后能准确放回原位（图2）。将这些线画在透明桌面的下方，可在动物实验之间清洁桌面时避免记号笔墨水被溶解。
- 安装摄像机和三脚架。将摄像机对准镜子，使画面正对圆筒的轴心方向。确保圆筒的整个内壁清晰可见，且不被底座遮挡（图3）。参见装置的侧视图，包括从上方观察的摄像机与镜子设置的相对角度（图4A），以及从桌面水平高度观察的视图，图中包含一只小鼠直立（rearing）的姿态（图4B）。
- 在拍摄前准备提示卡片，用于识别每只小鼠。确保卡片通常包含每只小鼠的编号、测试时间点（例如，处理后3天）以及拍摄日期。为保证实验人员处于盲法状态，提示卡上不得标注处理分组信息。
- 在标准室内光照条件下进行拍摄，因为该光照强度足以清晰观察小鼠在圆筒周围的活动。
注意：如有条件，可在黑暗环境中使用红光摄像机拍摄，但需首先验证爪部触碰和拖拽动作是否清晰可见，以便进行定量分析。
4. 执行
- 开始录像。将相应的小鼠提示卡片放在镜头前展示。
- 在拍摄完提示卡片后，立即从圆筒顶部开口处将小鼠放入其中。
- 开始对小鼠进行录像。在此期间尽量减少噪音，因为小鼠若受到惊吓可能会失去探索兴趣。
- 观察小鼠直立探索圆筒的行为。持续录制视频，直至小鼠完成至少二十次直立行为。
注：当小鼠的两只前爪完全离开地面，仅以后肢支撑身体直立时，定义为一次直立。 - 每只小鼠测试结束后，使用适当的清洁溶液擦拭桌面和圆筒内壁，以消毒并去除小鼠留下的气味。
- “静止”是指小鼠停止探索行为，并安静地四肢着地静坐约5分钟。如果小鼠在完成二十次直立前即出现静止行为，可将其从圆筒中移出休息10-20分钟后再继续测试。若小鼠始终未能完成二十次直立，则将其剔除出研究。
注：根据我们的经验，从未有小鼠因无法探索圆筒而被排除。
5. 采用前爪拖拽分析法评估圆筒实验
- 根据小鼠探索圆筒的速度，以正常速度的0.25倍至0.67倍回放视频。使用支持慢速播放的媒体播放器。
- 量化前爪接触的总次数。前爪接触是指小鼠后肢直立（图5A），用前爪触碰圆筒侧壁（图5B），随后双前爪同时从圆筒上脱离（图5C），并落地（图5D）。前爪接触圆筒壁时，掌面是否完全接触均可，但必须与圆筒壁发生一定程度的接触。在直立状态下，当小鼠以一只或两只前爪接触（无论接触时间多短暂）圆筒壁时，即计为一次前爪接触。
需注意，仅当小鼠处于直立姿势——即后肢着地、双前爪离开台面时，与圆筒壁的接触才被计为“前爪接触”或“前爪拖动”。若小鼠保持三点支撑姿势——即双后肢和一只前爪着地，并用另一只前爪触碰圆筒壁，则不计为前爪接触。小鼠在直立时用单个前爪接触圆筒壁，应计为一次前爪接触。注意：小鼠在直立过程中可能沿圆筒移动身体，导致发生多次接触。这些接触应分别计数——每次左前爪接触计一次，每次右前爪接触计一次。 - 量化前爪拖动的次数。前爪拖动行为与正常的前爪接触不同。
- 若前爪以完全张开的掌面接触圆筒壁（图6B），随后会缓慢从壁面滑落，常伴有轻微震颤。该动作起始于脚趾沿圆筒壁向内侧或向下拖动（图6C），然后完全脱离圆筒壁（图6D）。随后，小鼠用未受影响的前爪脱离圆筒（图6E），最终四肢着地（图6F）。此类行为视为一次前爪拖动，应计入统计。
- 若前爪未以完全张开的掌面接触圆筒壁，而是仅以脚趾轻擦圆筒壁后滑落，或在脱离前虽沿壁面拖动但未完全松开，则此类行为既视为前爪拖动，也视为前爪接触，应在统计中同时计入两者。
- 小鼠在探索圆筒时，前爪也可能沿圆筒壁拖动。此时，前爪随小鼠躯干扭转而沿壁面移动，向左或向右偏离初始位置（图7A-D），随后脱离（图7E）。此类情况不视为前爪拖动，因其取决于小鼠随机选择的探索方向，而非受损皮层半球的位置。
- 前爪拖动以单次实验中前爪拖动次数占前爪接触总次数的百分比表示。分别对每只前肢的前爪接触总数，计算其前爪拖动所占百分比。
- 导致前爪拖动的接触应同时计为一次前爪拖动和一次前爪接触。因此，若小鼠每次前爪接触圆筒壁时均发生拖动，则前爪拖动百分比为100%。
6. 额外的实验设计建议
- 为尽量减少无关变量的影响：
- 在每次测试日的相同时间对小鼠进行测试。应在小鼠清醒周期内进行测试。将小鼠维持在12小时反转光照周期下有助于提高其行为表现。
- 若小鼠因噪音或新环境而产生应激，可能不愿探索圆筒。在动物饲养室或小鼠已适应的房间内进行测试可降低应激水平。当测试环境嘈杂、小鼠进入圆筒前受到扰动或存在习惯化不足时，均可能发生上述情况。
注意：应在实验干预前进行一次测试，以获得基线数据。干预后的测试时间点由实验者自行决定，但建议避免在短时间内对小鼠进行过多次数的圆筒暴露。 - 小鼠在经历6至7次圆筒测试后，可能表现出站立意愿下降。在本研究中，小鼠在缺血前及术后第1、3、7、14、21和28天共进行了七次圆筒测试。
注意：本研究采用FVBN品系小鼠。我们此前曾使用C57Bl/6小鼠进行圆筒测试，在ET-1诱导的缺血性损伤后观察到前爪拖曳行为（数据未显示）。C57BL/6小鼠在站立时比FVBN小鼠更活跃，且常跳跃至圆筒边缘并试图爬出。若小鼠出现跳跃逃逸行为，应使用更高圆筒。
7. 内皮素-1 手术及梗死体积测量
- 根据先前发表的方案4进行内皮素-1手术及梗死体积测量。为靶向大脑前肢运动皮层，每只小鼠应在以下坐标处接受三次ET-1注射：(i) +0.7 前后（AP）/1.5 内侧-外侧（ml）/-1.2 背侧-腹侧（DV），(ii) +0.4 AP/1.25 ml/-1.2 DV，以及 (iii) +0.1 AP/1.75 ml/-1.2 DV4。
8. 统计分析
- 建议采用双因素重复测量方差分析（ANOVA）来分析在不同时间点患侧与非患侧足部拖拽百分比。
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结果
我们先前已证实，前肢感觉运动皮层局灶性缺血损伤后会出现前肢拖拽行为，该行为是损伤的阳性指标4在前肢感觉运动皮层内注射ET-1以诱导缺血性损伤图 8A、B）。本研究旨在检测爪拖曳行为是否在损伤后持续超过14天，以评估其用于判断功能恢复的潜力。在ET-1注射前一日（术前时间点）以及损伤后第1、3、7、14、21和28天，对小鼠进行圆筒实验测试。在每个时间点，分别量化损伤侧与未损伤侧前爪的触碰次数和拖曳次数。对触碰次数进行双因素重复测量方差分析，结果显示时间具有显著的主效应［F(6,108) = 3.59， P=0.0028] 以及受试者 [F(18,108) = 2.38， P=0.0032]，但治疗因素无显著效应（表1）。而采用圆筒实验中前肢不对称性的标准分析方法，即量化患侧爪触碰次数占总爪触碰次数的百分比，结果显示前肢行为缺陷不一致。对患侧爪使用率进行单因素重复测量方差分析，结果显示时间因素具有显著主效应（p=0.015），经Dunnett事后检验表明，术后7、14和21天患侧爪使用率显著降低，至术后28天恢复图8C
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讨论
在圆筒实验中定量分析前肢拖拽行为时，需明确以下关键点：i) 在脑损伤前，分别定量记录每侧前肢的拖拽次数与前肢总接触次数，以建立基线数据；ii) 在缺血性损伤后，分别定量记录每侧前肢的拖拽次数与前肢总接触次数；iii) 区分前肢拖拽行为与小鼠躯干侧向旋转时前肢沿圆筒壁产生的侧向移动动作。
爪拖拽是一种在前肢感觉运动皮层受损后出现的新行为。因此，爪拖拽行为的出现可作为前肢感觉运动皮层已受损伤的阳性指标。代表性结果显示，体积约为 2–4 mm3、且局限于前肢感觉运动皮层的小型 ET-1 梗死灶可导致爪拖拽行为。这与前肢不对称性分析形成对比，后者在检测 ET-1 所致缺血性皮层损伤后患侧爪接触次数占总接触次数的百分比变化时，无法发现一致的功能缺陷4-6。因此，对爪拖拽行为的分析在检测前肢感觉运动皮层损伤方面更为敏感。此外，由于爪拖拽行为可持续至损伤后四周，该指标也可能适用于功能恢复的分析。我们先前已证实，爪拖拽行为与前肢感觉运动皮层的损伤具有相关性4，因此，多种损伤模型均可从圆筒实验中的此项分析中获益。尽管诸如大脑中动脉闭塞...
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披露
作者无竞争性财务利益。
致谢
我们感谢 John Crowell 先生和 Terry Upshall 先生在摄影和摄像方面提供的专业技术支持与协助。本研究得到了加拿大卫生研究院以及纽芬兰研究与发展公司向 JLV 提供的运营资助，以及心脏 & 加拿大卒中基金会加拿大卒中康复合作伙伴催化基金。RBR 获得了基思·格里菲斯纪念心脏基金 & 中风基金会研究生奖学金
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 有机玻璃圆筒 | 高 17.5 cm，外径 9.5 cm，内径 8.8 cm，壁厚 0.35 cm（或 3.5 mm） | ||
| 观察台 | 54×56×66.5 cm（宽×长×高），台面为一块 51×51 cm 的有机玻璃板 | ||
| 镜子 | 34×58 cm 的镜子 | ||
| 摄像机 | Sony | DCR-SR42 | 内置存储、支持 SD 卡、具备 40 倍光学变焦功能的摄像机 |
| 计算机 | Dell | Optiplex 760 | 处理器：Intel，3.0 GHz，内存 4.00 GB（RAM） |
| 计算机显示器 | Samsung | S22C350H | |
| Excel（Microsoft Office Professional Plus） | Microsoft | v14.0.7106.5003 | |
| VLC 媒体播放器 | Video LAN | v2.1.2 | 支持播放速度调节和视频播放的媒体播放器 |
| 外置硬盘 | Western Digital | WDBAAU0020HBK-01 | 2 TB |
参考文献
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