肠神经系统由神经嵴细胞形成，这些细胞增殖、迁移并定植于肠道。神经嵴细胞分化为表达特定神经递质表型标志物的神经元。本方案描述了一种用于分离、固定和免疫染色小鼠胚胎胃肠道以可视化肠神经系统神经递质表达的技术。
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摘要
摘要
肠神经系统由神经嵴细胞形成，这些细胞增殖、迁移并定植于肠道。在定植之后，神经嵴细胞必须进一步分化为表达特定神经递质表型标志物的神经元。胆碱能神经元是肠神经系统中主要的神经递质表型之一，可通过染色胆碱乙酰转移酶（ChAT）——即乙酰胆碱的合成酶——来进行鉴定。以往在可视化胆碱能神经元方面的研究受到抗体特异性差异的限制，这些抗体对中枢神经系统与周围神经系统中的ChAT识别能力不同。我们及其他研究者已克服了这一局限，采用针对胎盘型ChAT的抗体，该抗体可同时识别中枢和周围神经系统的ChAT，成功实现了胚胎期肠源性胆碱能神经元的可视化。此外，我们将该抗体与ChAT基因报告系统进行了比较，结果表明该抗体在胚胎发育过程中更为可靠。本实验方案描述了一种用于解剖、固定及免疫染色小鼠胚胎胃肠道组织，以可视化肠神经系统神经递质表达的技术。
引言
一个功能正常的肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS），对于控制肠道蠕动、营养吸收以及局部血流至关重要，是维持生命所必需的1。ENS由神经嵴细胞（neural crest cells, NCC）发育而来，这些细胞增殖、迁移并定植于肠道，随后分化为包含神经元和胶质细胞的神经节。先天性巨结肠症（Hirschsprung’s Disease, HSCR，人类孟德尔遗传在线数据库编号），是一种多基因遗传的先天性疾病，发病率为每4,000名活产婴儿中1例，可被视为研究ENS发育障碍的典型疾病。在HSCR患者中，NCC未能迁移至远端后肠，导致该段肠道不同程度地缺乏神经节2。此外，儿科人群中其他常见的胃肠道（gastrointestinal, GI）发育异常，如肛门直肠畸形、肠闭锁以及动力障碍等，也与ENS基本功能的紊乱相关，并可能与ENS中细微且常被忽视的解剖结构和功能改变有关3-6。因此，能够帮助我们理解ENS发育决定因素的技术，有望揭示儿童胃肠道疾病发病机制及潜在治疗方法。
迁移并定植后，神经嵴细胞（NCC）会分化为表达特定神经递质表型标志物的神经元。胆碱能神经元约占肠神经元的60%7，可通过检测乙酰胆碱合成酶——胆碱乙酰转移酶（ChAT）进行识别，该酶是兴奋性神经递质乙酰胆碱的合成关键酶。历史上，针对中枢神经系统（CNS）ChAT与外周神经系统（PNS）ChAT的抗体....
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方案
威斯康星大学动物护理与使用委员会批准了所有实验程序。
1. 溶液的配制
- 使用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）作为解剖缓冲液和冲洗溶液。
- 配制 30% 蔗糖溶液：称取 30 g 蔗糖置于瓶中，加入 99 ml 1× PBS 和 1 ml 10% 叠氮化钠，充分混匀直至蔗糖完全溶解。4 °C 保存备用。
- 配制封闭液：将 1× PBS、3% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1% Triton-X-100 混合，充分混匀后置于冰箱中保存至使用前。
- 在 1× PBS 中配制 8% 多聚甲醛（PFA）溶液：将适量 PFA 称重后加入 1× PBS 中，于 65 °C 孵育至完全溶解。分装为 25 ml 等份，-20 °C 冷冻保存备用。使用当天用 1× PBS 稀释为 4% PFA 溶液。
2. 胚胎和肠道解剖
- 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案，处死孕鼠并将子宫转移至含有冰上预冷的1×PBS的60 mm培养皿中。
- 在解剖显微镜下，使用锋利的剪刀切开子宫壁以暴露胚胎。将胚胎从子宫中取出，并置于另一个含有冰上预冷的1×PBS的洁净60 mm培养皿中。
- 在冰上预冷的1×PBS中通过断头法处死每个胚胎。若使用表达荧光蛋白的转基因小鼠，可在荧光照明下鉴定阳性转基因胚....
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结果
我们此前已描述过表达GFP和tdTomato荧光报告基因的小鼠模型，该模型可用于检测ChAT的表达14。简言之，将ChAT-Cre小鼠与R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠杂交，以获得ChAT-Cre;R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠（称为ChAT-Cre tdTomato）。随后，将这些小鼠与纯合的ChAT-GFP报告基因小鼠进行杂交。在固定和免疫染色前，分离胚胎并解剖获取组织，所用抗体见Table 1。于E11、E13.5和E16.5时期分析小肠远端（SI）和结肠近端。
在E11时，远端小肠中已出现Hu阳性神经元，但神经嵴细胞尚未到达近端结肠（图1）。此时，大多数Hu阳性神经元同时表现出ChAT免疫反应性以及GFP阳性。有趣的是，在此时间点，ChAT-Cre tdTomato构建体的表达尚不可检测。到E13.5时，大多数Hu阳性神经元均呈ChAT-IR和ChAT-GFP阳性.......
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讨论
我们的实验室及其他研究团队已证实，先天性巨结肠（HSCR）的肠道缺陷不仅局限于无神经节细胞的结肠段，而是向近端延伸，甚至累及有神经节的小肠5,15,16。这些改变包括肠神经系统（ENS）神经元密度及神经递质表型的变化，可能解释在HSCR患者中观察到的肠道运动功能障碍。我们已利用上述技术来深入探究ENS形成的决定因素。具体而言，这些技术已被用于可视化神经元型一氧化氮合酶（nNOS）神经元、血管活性肠肽神经元（VIP）以及胆碱乙酰转移酶（ChAT）神经元（表2）5。该技术的一个关键优势在于，可将样本保存于30%蔗糖溶液中，以便后续进行免疫染色、包埋或冷冻切片处理。
神经嵴细胞（NCC）在肠道中的定植以推进波的形式从胚胎第9.5天（E9.5）持续至第14.5天（E14.5）。如上所述，采用识别神经元的Hu免疫染色结合计算机辅助图像分析，可实现对神经元密度的定量比较。在先天性巨结肠（HSCR）5 患者有神经节的肠段中，以及其他肠道运动功能障碍模型中，均观察到神经元密度降低13
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究工作由美国小儿外科协会基金会奖（AG）和美国国立卫生研究院 K08DK098271（AG）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 磷酸盐缓冲液 | Oxoid | BR0014G | |
| 蔗糖 | Fisher | S2 | |
| 叠氮化钠 | Fisher | BP9221 | |
| 牛血清白蛋白 | Fisher | BP1605 | |
| 吐温 X-100 | Sigma | X100 | |
| 多聚甲醛 | Sigma | 158127 | |
| 60 mm 培养皿 | Fisher | FB0875713A | |
| 荧光显微镜 | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| 解剖显微镜 | Nikon | SMZ-18 stereoscope | |
| 精细镊子 | Fine science tools | 11252-20 | |
| 1.5 ml 离心管 | VWR | 20170-038 | |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech, Birmingham, AL | 0100-01 | |
| 载玻片 | Fisher | 12-550-15 | |
| 盖玻片 | VWR | 16004-330 | |
| 共聚焦显微镜 | Nikon | Nikon A1 | |
| Nikon Elements | Nikon |
参考文献
- Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
- Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a ....
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重印与许可
