方法文章

免疫染色法可视化小鼠肠神经系统发育

11K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/52716

⸱

2015年4月29日

 ,  ,  , 
1Department of Surgery, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 2Department of Neurosciences, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health, 3Department of Pediatrics, University of Wisconsin School of Medicine and Public Health

本文内容

摘要

肠神经系统由神经嵴细胞形成，这些细胞增殖、迁移并定植于肠道。神经嵴细胞分化为表达特定神经递质表型标志物的神经元。本方案描述了一种用于分离、固定和免疫染色小鼠胚胎胃肠道以可视化肠神经系统神经递质表达的技术。

摘要

肠神经系统由神经嵴细胞形成，这些细胞增殖、迁移并定植于肠道。在定植之后，神经嵴细胞必须进一步分化为表达特定神经递质表型标志物的神经元。胆碱能神经元是肠神经系统中主要的神经递质表型之一，可通过染色胆碱乙酰转移酶（ChAT）——即乙酰胆碱的合成酶——来进行鉴定。以往在可视化胆碱能神经元方面的研究受到抗体特异性差异的限制，这些抗体对中枢神经系统与周围神经系统中的ChAT识别能力不同。我们及其他研究者已克服了这一局限，采用针对胎盘型ChAT的抗体，该抗体可同时识别中枢和周围神经系统的ChAT，成功实现了胚胎期肠源性胆碱能神经元的可视化。此外，我们将该抗体与ChAT基因报告系统进行了比较，结果表明该抗体在胚胎发育过程中更为可靠。本实验方案描述了一种用于解剖、固定及免疫染色小鼠胚胎胃肠道组织，以可视化肠神经系统神经递质表达的技术。

引言

一个功能正常的肠神经系统（Enteric Nervous System, ENS），对于控制肠道蠕动、营养吸收以及局部血流至关重要，是维持生命所必需的1。ENS由神经嵴细胞（neural crest cells, NCC）发育而来，这些细胞增殖、迁移并定植于肠道，随后分化为包含神经元和胶质细胞的神经节。先天性巨结肠症（Hirschsprung’s Disease, HSCR，人类孟德尔遗传在线数据库编号），是一种多基因遗传的先天性疾病，发病率为每4,000名活产婴儿中1例，可被视为研究ENS发育障碍的典型疾病。在HSCR患者中，NCC未能迁移至远端后肠，导致该段肠道不同程度地缺乏神经节2。此外，儿科人群中其他常见的胃肠道（gastrointestinal, GI）发育异常，如肛门直肠畸形、肠闭锁以及动力障碍等，也与ENS基本功能的紊乱相关，并可能与ENS中细微且常被忽视的解剖结构和功能改变有关3-6。因此，能够帮助我们理解ENS发育决定因素的技术，有望揭示儿童胃肠道疾病发病机制及潜在治疗方法。

迁移并定植后，神经嵴细胞（NCC）会分化为表达特定神经递质表型标志物的神经元。胆碱能神经元约占肠神经元的60%7，可通过检测乙酰胆碱合成酶——胆碱乙酰转移酶（ChAT）进行识别，该酶是兴奋性神经递质乙酰胆碱的合成关键酶。历史上，针对中枢神经系统（CNS）ChAT与外周神经系统（PNS）ChAT的抗体在抗原特异性上存在差异，这给胆碱能神经元的可视化带来了困难8-10。然而，靶向胎盘ChAT的抗体能够识别中枢和外周的ChAT11-13，我们近期已报道了一种技术，可在发育早期以更高的灵敏度实现肠神经系统（ENS）胆碱能神经元的可视化，早于ChAT报告基因小鼠品系所能达到的效果14。

本文介绍了一种用于解剖、固定和免疫染色小鼠胚胎胃肠道的技术，以可视化肠神经系统（ENS）神经元中神经递质的表达。在本研究中，我们采用ChAT-Cre小鼠与R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠杂交，获得ChAT-Cre;R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠（在本文中简称为ChAT-Cre tdTomato）。随后将这些小鼠与纯合的ChAT-GFP报告小鼠杂交，以获得同时表达两种荧光报告基因、可检测ChAT表达的小鼠14。这两种报告小鼠均处于C57BL/6J遗传背景，可从商业渠道获得（Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME）。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

威斯康星大学动物护理与使用委员会批准了所有实验程序。

1. 溶液的配制

  1. 使用 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）作为解剖缓冲液和冲洗溶液。
  2. 配制 30% 蔗糖溶液：称取 30 g 蔗糖置于瓶中，加入 99 ml 1× PBS 和 1 ml 10% 叠氮化钠，充分混匀直至蔗糖完全溶解。4 °C 保存备用。
  3. 配制封闭液：将 1× PBS、3% 牛血清白蛋白（BSA）和 0.1% Triton-X-100 混合，充分混匀后置于冰箱中保存至使用前。
  4. 在 1× PBS 中配制 8% 多聚甲醛（PFA）溶液：将适量 PFA 称重后加入 1× PBS 中，于 65 °C 孵育至完全溶解。分装为 25 ml 等份，-20 °C 冷冻保存备用。使用当天用 1× PBS 稀释为 4% PFA 溶液。

2. 胚胎和肠道解剖

  1. 根据机构动物护理和使用委员会批准的方案，处死孕鼠并将子宫转移至含有冰上预冷的1×PBS的60 mm培养皿中。
  2. 在解剖显微镜下，使用锋利的剪刀切开子宫壁以暴露胚胎。将胚胎从子宫中取出，并置于另一个含有冰上预冷的1×PBS的洁净60 mm培养皿中。
  3. 在冰上预冷的1×PBS中通过断头法处死每个胚胎。若使用表达荧光蛋白的转基因小鼠，可在荧光照明下鉴定阳性转基因胚胎。
  4. 在解剖显微镜下分离每个胚胎的胃肠道。使用精细镊子将胚胎调整至左侧朝上、右侧紧贴培养皿底部的位置。去除胚胎的上部体壁以暴露内脏器官。将精细镊子插入背侧体壁与内脏器官之间，交叉镊子并以剪刀式动作切断，从而将内脏器官从胚胎中移除。
  5. 进一步将胃肠道与其他周围器官分离，随后将每个胃肠道放入含有冰上预冷的1×PBS的1.5 ml微量离心管中。

3. 消化道的固定

  1. 用预冷的1×PBS冲洗每根胃肠道3次，然后更换为4% PFA。将胃肠道置于1.5 ml离心管中，在室温下于摇床上固定1.5小时 。在室温下用1×PBS漂洗胃肠道3次，每次5分钟，随后在摇床上继续漂洗1小时。此步骤完成后，将胃肠道保存于含0.1%叠氮化钠的1×PBS中30%蔗糖溶液内，置于4 °C备用。
    注意：也可将胚胎在30%蔗糖溶液中保存长达一年，对组织完整性无任何影响。样品在30%蔗糖中保存可便于后续进行免疫染色处理，或转入OCT包埋以进行冷冻切片。或者，可直接继续进行下述免疫染色实验方案。

4. 免疫染色实验方案

  1. 如果样品已保存在30%蔗糖中，则在摇床上用1×PBS冲洗3次，每次20分钟。
  2. 将胃肠道组织放入封闭液中，在摇床上室温孵育1小时。
  3. 移除封闭液，加入适量的一抗（用封闭液稀释）与胃肠道组织在摇床上孵育，可在室温下孵育4小时，或在4 °C过夜 。使用1:1,000稀释度的人源抗-Hu抗体（来自患者血清）、1:1,000稀释度的鸡源抗绿色荧光蛋白（GFP）抗体以及1:100稀释度的山羊抗ChAT抗体。
    注：我们使用的是本地患者来源的人源抗-Hu抗体，但抗-Hu抗体也可从商业途径获得，例如小鼠抗-Hu抗体（使用1:500稀释度）。
  4. 在摇床上用1×PBS冲洗胃肠道组织3次，每次5分钟，随后在室温下再冲洗1小时。
  5. 在摇床上用封闭液以1:500比例稀释的二抗替换1×PBS，室温孵育4小时或4 °C过夜 。使用驴抗人胺反应性染料（如Dylight）、驴抗鸡Cy2以及驴抗山羊Cy5。若使用小鼠抗-Hu抗体，则使用1:500稀释度的驴抗小鼠胺反应性染料405。
    注：内源性GFP和tdTomato的表达强度以及免疫染色的清晰度随发育年龄增加而增强。我们通常将胚胎肠道单独置于0.2 ml离心管中，加入150 μl染色液进行免疫染色，以减少抗体用量并确保组织染色充分。
  6. 在摇床上用1×PBS冲洗胃肠道组织3次，每次5分钟，随后在室温下再冲洗1小时。
  7. 在载玻片上滴加数滴含DAPI的荧光封片剂。将胃肠道组织浸入封片剂中，并在组织上方直接加盖盖玻片。荧光封片剂-G是一种水溶性化合物，可提供半永久性密封。
    注：可使用Vectashield等基于甘油的荧光封片剂，其可防止抗体荧光褪色和光漂白。这两种封片剂均允许组织在4 °C长期保存。
  8. 使用共聚焦显微镜分别采集每种荧光染料的图像。激发波长和滤光片设置请参见表3。
  9. 根据所用共聚焦显微镜的类型，使用相应的软件进行计算机辅助图像分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

我们此前已描述过表达GFP和tdTomato荧光报告基因的小鼠模型，该模型可用于检测ChAT的表达14。简言之，将ChAT-Cre小鼠与R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠杂交，以获得ChAT-Cre;R26R:floxSTOP:tdTomato小鼠（称为ChAT-Cre tdTomato）。随后，将这些小鼠与纯合的ChAT-GFP报告基因小鼠进行杂交。在固定和免疫染色前，分离胚胎并解剖获取组织，所用抗体见Table 1。于E11、E13.5和E16.5时期分析小肠远端（SI）和结肠近端。

在E11时，远端小肠中已出现Hu阳性神经元，但神经嵴细胞尚未到达近端结肠（图1）。此时，大多数Hu阳性神经元同时表现出ChAT免疫反应性以及GFP阳性。有趣的是，在此时间点，ChAT-Cre tdTomato构建体的表达尚不可检测。到E13.5时，大多数Hu阳性神经元均呈ChAT-IR和ChAT-GFP阳性...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

我们的实验室及其他研究团队已证实，先天性巨结肠（HSCR）的肠道缺陷不仅局限于无神经节细胞的结肠段，而是向近端延伸，甚至累及有神经节的小肠5,15,16。这些改变包括肠神经系统（ENS）神经元密度及神经递质表型的变化，可能解释在HSCR患者中观察到的肠道运动功能障碍。我们已利用上述技术来深入探究ENS形成的决定因素。具体而言，这些技术已被用于可视化神经元型一氧化氮合酶（nNOS）神经元、血管活性肠肽神经元（VIP）以及胆碱乙酰转移酶（ChAT）神经元（表2）5。该技术的一个关键优势在于，可将样本保存于30%蔗糖溶液中，以便后续进行免疫染色、包埋或冷冻切片处理。

神经嵴细胞（NCC）在肠道中的定植以推进波的形式从胚胎第9.5天（E9.5）持续至第14.5天（E14.5）。如上所述，采用识别神经元的Hu免疫染色结合计算机辅助图像分析，可实现对神经元密度的定量比较。在先天性巨结肠（HSCR）5 患者有神经节的肠段中，以及其他肠道运动功能障碍模型中，均观察到神经元密度降低13

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究工作由美国小儿外科协会基金会奖（AG）和美国国立卫生研究院 K08DK098271（AG）资助。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸盐缓冲液OxoidBR0014G
蔗糖FisherS2
叠氮化钠FisherBP9221
牛血清白蛋白FisherBP1605
吐温 X-100SigmaX100
多聚甲醛Sigma158127
60 mm 培养皿FisherFB0875713A
荧光显微镜NikonSMZ-18 stereoscope
解剖显微镜NikonSMZ-18 stereoscope
精细镊子Fine science tools11252-20
1.5 ml 离心管VWR20170-038
Fluoromount-GSouthernBiotech, Birmingham, AL0100-01
载玻片Fisher12-550-15
盖玻片VWR16004-330
共聚焦显微镜NikonNikon A1
Nikon ElementsNikon

参考文献

  1. Gershon, M. D. Developmental determinants of the independence and complexity of the enteric nervous system. Trends Neurosci. 33 (10), 446-456 (2010).
  2. Amiel, J., Sproat-Emison, E., et al. Hirschsprung disease, associated syndromes and genetics: a review. J Med Genet. 45 (1), 1-14 (2008).
  3. Erickson, C. S., Barlow, A. J., et al. Colonic enteric nervous system analysis during parenteral nutrition. J Surg Res. 184 (1), 132-137 (2013).
  4. Erickson, C. S., Zaitoun, I., Haberman, K. M., Gosain, A., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L. Sacral neural crest-derived cells enter the aganglionic colon of Ednrb(-/-) mice along extrinsic nerve fibers. J Comp Neurol. 20 (3), 620-632 (2011).
  5. Zaitoun, I., Erickson, C. S., et al. Altered neuronal density and neurotransmitter expression in the ganglionated region of Ednrb null mice: implications for Hirschsprung's disease. Neurogastroenterol Motil. , (2013).
  6. Margolis, K. G., Stevanovic, K., et al. Enteric neuronal density contributes to the severity of intestinal inflammation. Gastroenterology. 141 (2), 588-598 (2011).
  7. Qu, Z. -D., Thacker, M., Castelucci, P., Bagyánszki, M., Epstein, M. L., Furness, J. B. Immunohistochemical analysis of neuron types in the mouse small intestine. Cell Tissue Res. 334 (2), 147-161 (2008).
  8. Bian, X. -C., Bornstein, J. C., Bertrand, P. P. Nicotinic transmission at functionally distinct synapses in descending reflex pathways of the rat colon. Neurogastroenterol Motil. 15 (2), 161-171 (2003).
  9. Johnson, C. D., Epstein, M. L. Monoclonal antibodies and polyvalent antiserum to chicken choline acetyltransferase. J Neurochem. 46 (3), 968-976 (1986).
  10. Tooyama, I., Kimura, H. A protein encoded by an alternative splice variant of choline acetyltransferase mRNA is localized preferentially in peripheral nerve cells and fibers. J Chem Neuroanat. 17 (4), 217-226 (2000).
  11. Koga, T., Bellier, J. -P., Kimura, H., Tooyama, I. Immunoreactivity for Choline Acetyltransferase of Peripheral-Type (pChAT) in the Trigeminal Ganglion Neurons of the Non-Human Primate Macaca fascicularis. Acta histochemica et cytochemica. 46 (2), 59-64 (2013).
  12. Sang, Q., Young, H. M. The identification and chemical coding of cholinergic neurons in the small and large intestine of the mouse. Anat Rec. 251 (2), 185-199 (1998).
  13. Lei, J., Howard, M. J. Targeted deletion of Hand2 in enteric neural precursor cells affects its functions in neurogenesis, neurotransmitter specification and gangliogenesis, causing functional aganglionosis. Development (Cambridge, England). 138 (21), 4789-4800 (2011).
  14. Erickson, C. S., Lee, S. J., Barlow-Anacker, A. J., Druckenbrod, N. R., Epstein, M. L., Gosain, A. Appearance of cholinergic myenteric neurons during enteric nervous system development: comparison of different ChAT fluorescent mouse reporter lines. Neurogastroenterol Motil. 26 (6), 874-884 (2014).
  15. Teitelbaum, D. H., Caniano, D. A., Qualman, S. J. The pathophysiology of Hirschsprung's-associated enterocolitis: importance of histologic correlates. J Pediatr Surg. 24 (12), 1271-1277 (1989).
  16. Aslam, A., Spicer, R. D., Corfield, A. P. Children with Hirschsprung's disease have an abnormal colonic mucus defensive barrier independent of the bowel innervation status. J Pediatr Surg. 32 (8), 1206-1210 (1997).
  17. Puig, I., Champeval, D., De Santa Barbara, P., Jaubert, F., Lyonnet, S., Larue, L. Deletion of Pten in the mouse enteric nervous system induces ganglioneuromatosis and mimics intestinal pseudoobstruction. J Clin Invest. 119 (12), 3586-3596 (2009).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ChAT

相关文章