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方法文章

基于纸张的细胞外囊泡分离与表征装置

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DOI：

10.3791/52722

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2015年4月3日

 ,  ,  , 
1Institute of Nanoengineering and Microsystems, National Tsing Hua University, 2Taichung Veterans General Hospital

本文内容

摘要

本方案详细描述了一种从低至10 μl血清样本中分离细胞外囊泡（EVs）的方法，EVs是细胞释放的微小膜性颗粒。该方法无需超速离心，检测时间仅需几分钟，可实现对微量样本中EVs的分离。

摘要

细胞外囊泡（EVs）是由多种细胞释放的膜性颗粒，在临床应用方面具有巨大潜力。它们携带核酸和蛋白质成分， increasingly 被认为是真核细胞和原核细胞均采用的一种细胞间通讯方式。然而，由于其体积微小，目前分离EVs的常规方法通常耗时较长、操作繁琐，且需要较大的样本量以及超速离心机等昂贵设备。为克服这些局限性，我们开发了一种基于纸张的免疫亲和平台，可用于分离EVs的不同亚群，该方法操作简便、效率高，所需样本量低至10 μl。生物样本可直接滴加到已化学修饰有捕获分子的纸质检测区域，这些捕获分子对特定的EV表面标志物具有高亲和力。我们通过扫描电子显微镜（SEM）、基于纸张的酶联免疫吸附测定（P-ELISA）以及转录组分析对该检测方法进行了验证。这类基于纸张的装置将有助于在临床和科研环境中开展EVs的研究，推动我们对EVs在健康与疾病状态下功能的理解。

引言

细胞外囊泡（EVs）是一类大小从40 nm到5,000 nm不等的异质性膜性颗粒，可通过不同的生物发生途径由多种细胞主动释放1-9。它们含有来自亲代细胞的特定且经过选择的DNA、RNA、蛋白质和表面标志物亚群。EVs参与多种细胞过程，如细胞间通讯10、免疫调节11、血管生成12、转移12、化疗耐药13以及眼病的发生发展9，这些作用正日益受到关注，并激发了人们对其在诊断、预后、治疗及基础生物学应用中潜力的浓厚兴趣。

根据生物发生过程或细胞来源，细胞外囊泡（EVs）可经典地分为外泌体、微囊泡、凋亡小体、肿瘤体、胞外体、微颗粒、端粒体、前列腺体、心肌体和vexosome等。例如，外泌体形成于多泡体中，而微囊泡则由质膜直接出芽产生，凋亡囊泡则来源于凋亡或坏死的细胞。然而，由于对EVs的全面理解与表征仍不充分，其命名体系仍在不断完善中。目前已开发出多种EVs纯化方法，包括超速离心法14、超滤法15、磁珠法16、聚合物沉淀法17-19以及微流控技术20-22。最常见的EVs纯化流程包括一系列离心和/或过滤步骤，以去除大颗粒碎片及其他细胞污染物，随后进行最终的高速超速离心，但该过程成本高、操作繁琐且缺乏特异性14,23,24。遗憾的是，目前仍缺乏能够快速、可靠地分离出具有满意纯度和效率EVs的技术手段。

我们开发了一种基于纸张的免疫亲和装置，可提供一种简单、省时且经济高效的方法，用于分离和表征细胞外囊泡（EVs）亚群22。将纤维素纸裁剪成特定形状后，可通过带有对齐通孔的两张塑料片进行排列和层压。与通常通过印刷疏水性石蜡或聚合物来定义纸基装置中流体边界的策略不同25-27，这种层压纸结构对多种有机液体（包括乙醇）具有耐受性。纸张检测区经过化学修饰，可稳定且高密度地固定捕获分子（例如，靶标特异性抗体），这些分子对EV亚群表面的特定标志物具有高亲和力。生物样本可直接加样至纸张检测区，经洗涤步骤后即可保留纯化的EVs。分离得到的EVs可通过扫描电镜（SEM）、酶联免疫吸附试验（ELISA）以及转录组学分析进行表征。

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方案

操作流程的总体示意图见图1。我们遵循伦理规范，从健康受试者中采集血液样本，并通过台中荣民总医院（中国台湾台中市）在经机构审查委员会批准的方案（IRB TCVGH 编号 CF11213-1）下获取患者的房水样本。

1. 纸质装置的制备

  1. 将层析纸裁剪成直径为5 mm的圆形，使其排列方式与96孔微孔板相同。将这些圆形纸片夹在两片带有对齐通孔的聚苯乙烯板之间，进行热压固定。
  2. 使用以下步骤中所述的化学偶联方法修饰纸质装置28.
    1. 在等离子体腔室中，用氧气等离子体（100 mW，1% 氧气，30 秒）处理纸基装置。
      注意：使用 3-巯基丙基三甲氧基硅烷时必须格外小心， N-γ-马来酰亚胺基丁酰氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS），因为二者均对湿气敏感且具有毒性。操作时需佩戴防护手套，避免吸入或接触皮肤及眼睛。储存时应将原装瓶 tightly sealed，并在使用前置于室温下充分平衡，以防止水分冷凝。也可在充满氮气的手套袋或手套箱内开启原装瓶。建议分装至小瓶中，以减少原装瓶的频繁开启。
    2. 将处理后的纸质装置立即在4%（v/v）3-巯基丙基三甲氧基硅烷乙醇（200 proof）溶液中孵育30分钟。
    3. 用乙醇冲洗纸基装置，并将其与 0.01 μmol/ml GMBS 溶于乙醇，作用 15 分钟。
    4. 用乙醇（200 proof）冲洗，并将纸基装置与10 µg/ml 链霉亲和素溶液在磷酸盐缓冲液（PBS）中，4℃孵育1小时 °C. 4℃保存 °如有需要，于4周内使用。
  3. 用10润湿每张试纸的测试区域 μ含1% (w/v) 牛血清白蛋白（BSA）的PBS溶液，孵育3分钟 × 点样前10分钟 μ用于3的生物素化捕获分子 × 10 分钟。使用抗 CD63 抗体（20 μg/ml，溶于含1% (w/v) BSA和0.09% (w/v) 叠氮化钠的PBS中）或膜联蛋白V（1:20，v/v，溶于膜联蛋白V结合缓冲液中）作为捕获分子。
  4. 用10 mL缓冲液洗去未结合的抗CD63抗体或膜联蛋白V分子 μl 对应的 PBS，其中含有 1% (w/v) BSA 或膜联蛋白 V 结合缓冲液，孵育 3 × 1 分钟，分别。

2. 血清和房水样本的采集与处理

  1. 血清采集。
    1. 采用静脉穿刺法在血清分离管中收集 10 ml 外周血，轻轻倒置试管 5 次。将试管垂直放置，静置 30 分钟。
    2. 在 1,200 × g 条件下离心 15 分钟。将上层血清转移至洁净试管中，再在 3,000 × g 条件下离心 30 分钟。
    3. 将上清液经 0.8 μm 滤膜过滤。样品保存于 -80 °C，待用。
  2. 房水采集：由眼科医生通过侵入性操作直接从患者获取房水样本，并将样本储存于 -80 °C，待用。

3. 细胞外囊泡的分离

  1. 以每分钟5个样品的速率将样品点样至各纸张检测区域 μ升/分钟
  2. 用10次洗涤去除未结合的EVs μl 对应的 PBS 溶液（含 1% (w/v) BSA）或膜联蛋白 V 结合缓冲液，孵育 3 × 分别用抗CD63抗体或膜联蛋白V分子功能化的纸基装置孵育1分钟。随后进行以下下游检测。

4. 下游检测示例1：扫描电子显微镜照片

  1. 使用10固定功能化纸张检测区上捕获的细胞外囊泡 μ0.5 l× Karnovsky固定液固定10分钟。
  2. 用大量 PBS 清洗样品 2 次 × 5 分钟
  3. 用35%乙醇脱水10分钟，再用50%乙醇脱水2分钟 × 10 分钟，70% 乙醇处理 2 次 × 10 分钟，95% 乙醇用于 2 × 10 分钟，以及 100% 乙醇处理 4 × 10 分钟
  4. 使用钯/金对样品进行临界点干燥和溅射镀膜，并在低电子加速电压（约 5 kV）下用扫描电子显微镜观察。

5. 下游检测示例2：基于纸张的ELISA

  1. 向每个含有捕获的细胞外囊泡（EVs）的检测区域加入5 μl PBS中稀释1:1,000的抗CD9一抗溶液。静置1 分钟。
  2. 用30 ml PBS在100 rpm振荡条件下冲洗样品30秒。
  3. 向每个检测区域加入5 μl PBS中稀释1:1,000的辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗溶液，静置1分钟。
  4. 用30 ml PBS在100 rpm振荡条件下冲洗样品30秒。
  5. 加入5 μl比色底物溶液，其中过氧化氢与3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）按1:1体积比混合，然后使用台式扫描仪进行扫描。

6. 下游实验示例3：RNA提取

  1. 将样品浸入 35 μl 基于聚乙烯吡咯烷酮的 RNA 提取辅助液和 265 μl 裂解/结合缓冲液中，以裂解捕获的细胞外囊泡。剧烈涡旋振荡。
  2. 向裂解液中加入分离试剂盒提供的 30 μl 匀浆液。剧烈涡旋振荡，并置于冰上 10 分钟。
  3. 使用以下步骤所述的酸性酚-氯仿分离法提取 RNA。
    1. 从试剂瓶底部取 330 μl 酚-氯仿溶液，加入匀浆液/裂解液中。剧烈涡旋振荡。
    2. 在 10,000 × g 条件下离心 5 分钟。将水相（上层）转移至洁净离心管中，并记录转移的体积。
  4. 用上一步所获水相体积 1.25 倍量的 100% 乙醇沉淀总 RNA，并将 RNA 收集于预热至 95 °C 的洗脱液中。
  5. 按照制造商提供的操作说明，使用 RNA 纯化试剂盒对 RNA 进行浓缩和进一步纯化。

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结果

纸基器件高效分离EV亚群的能力依赖于其对EV表面标志物的灵敏且特异的识别。通过采用链霉亲和素-生物素化学方法，可实现捕获分子在纸纤维上的稳定修饰，该方法已在其他文献中有所描述28-30。化学偶联法与物理吸附法的有效性通过基于荧光的检测方法进行评估。纸基检测区按照步骤1）的方案制备，但在步骤1.3中，将捕获分子替换为20 μg/ml的荧光标记R-藻红蛋白-生物素分子（PE-biotin）。随后用PBS冲洗纸基检测区，以去除未结合的PE-biotin分子。相比之下，在另一组实验中，将10 μl含1%（w/v）BSA和0.09%（w/v）叠氮化钠的PBS缓冲液中20 μg/ml PE-biotin直接点样于纸基检测区，每次点样后于室温孵育10分钟，共重复3次，随后用PBS冲洗，以实现PE-biotin染料分子的物理吸附。对经化学修饰的纸基器件（“paper+crosslinker+dye”）、未经处理的纸基器件（“paper”）、采用相同修饰流程但未添加PE-biotin分子的纸基器件（“paper+crosslinker”）以及经物理吸附PE-biotin分子的纸基器件（“physisorbed-dye”）使用图像记录...

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讨论

成功分离细胞外囊泡亚群最关键的步骤包括：1）选择合适的纸张；2）捕获分子在纸纤维表面稳定且高覆盖率的固定；3）正确处理样本；以及4）遵循常规实验室卫生规范。

多孔材料已被广泛应用于许多低成本且无需设备的检测方法中。这类材料具有可调节的孔径、多样的功能基团、低成本以及高比表面积，能够通过毛细作用被动地吸附液体。我们主要选用1号色谱级纤维素滤纸，因其具备合适的孔径和较低的蛋白质吸附性。与另一种常用的多孔材料硝酸纤维素膜相比，纤维素滤纸的非特异性蛋白质吸附显著更低34。在本研究中，我们也发现其对细胞外囊泡（EVs）的非特异性捕获极少。此外，其颗粒截留能力为11 μm，大于EVs的尺寸35，因此可实现特异性捕获，而非对EVs的物理截留。本文重点关注较小尺寸的EVs，故在处理血清样本时通过0.8 μm滤膜进行过滤；当研究目标为较大尺寸EVs时，该步骤可相应调整。

化学表面修饰可能是实现捕获分子在表面稳定且高覆盖率固定的关键，从而提高细胞外囊泡（EV）分离的效率。已有综述对纤维素的表面修饰进行了...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作部分得到了中国台湾国家科学委员会基金项目 NSC 99-2320-B-007-005-MY2（CC）和 NSC 101-2628-E-007-011-MY3（CMC），以及中国台湾退伍军人总医院与大学系统联合研究计划（CC）的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
层析纸GE Healthcare Life Sciences3001-861Whatman® Grade 1 纤维素纸
(3-巯丙基)三甲氧基硅烷Sigma Aldrich175617该化学品与水和湿气发生反应，应在充氮手套袋内操作。避免接触眼睛和皮肤。切勿吸入烟雾或蒸气。
乙醇菲舍尔科技公司BP2818无水，200 证明，分子生物学级
牛血清白蛋白（BSA）BioShop Canada Inc.ALB001常被称为 Cohn 组分 V。
N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯（GMBS）Pierce Biotechnology22309GMBS 是一种胺基至巯基交联剂。GMBS 对湿气敏感。
亲和素Pierce Biotechnology31000NeutrAvidin 具有 4 个生物素结合位点，其等电点（pI）为 6.3，比天然亲和素更接近中性
生物素标记的小鼠抗人抗 CD63 抗体Ancell215-030克隆株 AHN16.1/46-4-5
生物素化膜联蛋白 VBD Biosciences556418膜联蛋白 V 对磷脂酰丝氨酸（PS）具有高亲和力
一抗 CD9 和二抗System BiosciencesEXOAB-CD9A-1二抗为辣根过氧化物酶偶联抗体
血清分离管BD Biosciences367991含凝血激活剂和凝胶用于血清分离
膜联蛋白 V 结合缓冲液BD Biosciences55645410 倍浓度；使用前稀释至 1 倍。
TMB 底物试剂盒BD Biosciences555214试剂盒包含过氧化氢和 3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）
[header]
RNA 提取试剂盒Life TechnologiesAM1560MirVana RNA 提取试剂盒
基于聚乙烯吡咯烷酮的 RNA 提取辅助剂Life TechnologiesAM9690植物 RNA 提取辅助剂含有可结合多糖的聚乙烯吡咯烷酮（PVP）
RNA 纯化试剂盒Qiagen Inc.74004MinElute RNA 纯化试剂盒适用于纯化最多 45 μg RNA
等离子体腔室March InstrumentsPX-250
扫描电子显微镜Hitachi Ltd.S-4300
台式扫描仪惠普公司Photosmart B110采集 8 位彩色图像。也可使用相机和智能手机。
图像记录系统J&H Technology CoGeneSys G:BOX Chemi-XX8采集 16 位荧光图像。也可使用荧光显微镜。

参考文献

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