基于纸张的设备进行隔离外囊泡与表征

摘要

该协议细节的方法分离细胞外囊泡（电动汽车），从细胞中释放的小的膜的颗粒，从少至10微升血清样品。这种方法绕过需要超速离心，需要测定时间仅几分钟，并且使电动车从有限体积的样品的分离。

摘要

胞外囊泡（电动汽车），从不同类型的细胞释放的膜的颗粒，持有用于临床应用的巨大潜力。它们含有核酸和蛋白质的货物和正日益被视为间通讯双方真核生物和原核生物细胞利用的手段。然而，由于它们的尺寸小，对电动汽车的隔离电流协议往往费时，繁琐，并且需要较大的样品体积和昂贵的设备，如超速离心。为了解决这些限制，我们开发了一种基于纸张免疫平台，用于分离电动汽车的亚组是容易的，高效的，并且需要的样品体积低至10微升。生物样品可以直接吸移到已经被化学修饰以捕获分子具有高亲和力的特定的EV表面标记纸测试区。我们验证该测定通过使用扫描电子显微镜（SEM），纸基酶联immunosorben吨测定（P-ELISA），和转录组分析。这些文件为基础的设备将使临床和研究设置电动车的研究，以帮助促进我们的健康和疾病EV功能的理解。

引言

细胞外囊泡 （EV） 是异质膜颗粒，大小范围为 40 nm 至 5,000 nm，由许多细胞类型通过不同的生物发生途径主动释放^1-9。它们包含来自亲本细胞的独特和精选的 DNA、RNA、蛋白质和表面标志物亚群。它们参与各种细胞过程，如细胞间通讯¹⁰（intercellular communication）、免疫调节¹¹（immuno modulation 11）、血管生成¹²（angiogenesis 12）、转移¹²（metastasis 12）、化疗耐药¹³（chemoresistance）和眼病发展^（development of eye diseases），越来越受到认可，并激发了人们对它们在诊断、预后、治疗和基础生物学应用中的效用的极大兴趣。

EVs 根据其生物发生或细胞起源，可经典地分为外泌体、微泡、凋亡体、癌体、外泌体、微粒、远体、前列腺体、心脏小体和外泌体等。例如，外泌体是在多泡体中形成的，而微泡是通过直接从质膜出芽产生的，而凋亡囊泡来自凋亡或坏死细胞。然而，该命名法仍未完善，部分原因是缺乏对 EV 的透彻理解和表征。已经开发了几种纯化 EV 的方法，包括超速离心¹⁴、超滤¹⁵、磁珠¹⁶、聚合物沉淀^17-19 和微流体技术^20-22。纯化 EV 的最常见程序包括一系列离心和/或过滤，以去除大碎片和其他细胞污染物，然后进行最后的高速超速离心，这一过程昂贵、乏味且非特异性^14,23,24。遗憾的是，尚未满足快速可靠地分离具有令人满意纯度和效率的 EV 的技术需求。

我们开发了一种基于纸张的免疫亲和装置，它提供了一种简单、省时、省成本且有效的方法来分离和表征 EV²² 的亚群。切割成指定形状的纤维素纸可以使用两张带有注册通孔的塑料板进行排列和层压。与通过印刷疏水性蜡或聚合物^25-27 来定义纸质设备中的流体边界的一般策略相反，这些层压纸模型对许多有机液体（包括乙醇）具有抵抗力。纸质测试区经过化学修饰，以提供对 EV 亚组上的特定表面标志物具有高亲和力的捕获分子（例如，靶标特异性抗体）的稳定和密集覆盖。生物样品可以直接移液到纸质测试区，纯化的 EV 在冲洗步骤后保留。分离的 EV 的表征可以通过 SEM、ELISA 和转录组学分析进行。

方案

操作步骤的总体框图如图1中提供。使用道德实践，我们收集了来自健康受试者的血液样本，并通过台中荣民总医院（TCVGH），台中，台湾在IRB批准协议获得房水样本的患者（ IRB TCVGH号CF11213-1）。

1.制造纸张的设备

1. 切色谱纸放入5mm的圆的直径，以提供相同的布局为一个96孔微量滴定板。夹着这些纸片具有两个聚苯乙烯片材与注册的通孔，和层压体。
2. 修改使用在下面的步骤²⁸中所述的化学缀合方法纸装置。
   1. 处理纸的设备用氧等离子体（100毫瓦，1％的氧气，30秒）在等离子体室中。
      注意:用3-巯丙基三甲氧基硅烷和 N-γ-马来酰亚胺琥珀酰亚胺工作时特别小心，必须采取酯（GMBS），因为它们都是湿气敏感和毒性。戴防护手套，避免吸入或与皮肤和眼睛接触。保持股市瓶子盖紧并允许它打开，以避免冷凝水之前平衡至RT。或者，打开股票瓶内充氮的手套袋中或框。分装成小药瓶，以避免频繁开股票瓶。
   2. 立即处理的孵育在4％（体积/体积）的3-巯基丙基三甲氧基硅烷的乙醇（200标准强度）为30分钟，溶液纸装置。
   3. 冲洗纸装置，用乙醇和孵化它们与0.01微摩尔/毫升GMBS在乙醇中15分钟。
   4. 冲洗，用乙醇（200标准强度），并培育纸装置用10μg/ ml的抗生物素蛋白在磷酸盐缓冲盐水（PBS），在4℃的溶液1小时。如果需要储存在4℃下，并在4周内使用。
3. 湿纸的每个测试区与10微升的PBS含有1％（重量/体积）牛血清白蛋白（BSA）为察觉10微升生物素化的捕获分子3×10分钟前，3×10分钟。使用抗CD63抗体（20微克/毫升的PBS含有1％（重量/体积）BSA和0.09％（重量/体积）叠氮化钠）或膜联蛋白V（1:20，体积/体积在膜联蛋白V结合缓冲液），为捕获分子。
4. 冲洗掉，用10微升相应的PBS含有1％（重量/体积）BSA或膜联蛋白V结合缓冲液进行3×1分钟，分别未结合的抗CD63抗体或膜联蛋白V的分子。

2.血清和房水样品采集与处理

1. 血清集合。
   1. 在血清分离管中收集10毫升外周血通过静脉穿刺，轻轻颠倒试管5次。设置该管处于垂直位置，并等待30分钟。
   2. 离心机在1200×g下15分钟。再次传输从顶层血清到一个干净的试管中，离心以3000×g的30分钟。
   3. 通过0.8微米FIL通过上清器。保持样品在-80℃下直到使用。
2. 房水的收集:收集房水样本的患者可直接通过侵入性操作和储存样品在-80°C，直到使用诊断眼科医生。

3.隔离外囊泡

1. 点样到每个纸测试区以5微升/分钟的速率。
2. 冲洗掉未结合的电动汽车用10微升相应的PBS含有1％（重量/体积）BSA或膜联蛋白V结合缓冲液进行3×1分钟，用于分别官能用抗CD63抗体或膜联蛋白V的分子，造纸设备。执行以下下游试验。

4.下游测定实施例1:扫描Electromicrographs

1. 修复捕获使用10微升0.5×Karnovsky固定液10分钟官能试纸测试区的电动车。
2. 冲洗了充足的PBS样品2×5分钟。
3. 脱水样品随后35％乙醇10分钟，50％乙醇为2×10分钟，70％乙醇中2×10分钟，95％乙醇为2×10分钟，100％乙醇为4×10分钟。
4. 临界干燥和溅射涂层与钯/金的样品中，并且检查使用在低电子加速电压操作的扫描型电子显微镜（〜5千伏）。

5.下游分析实施例2:基于纸张的ELISA

1. 在PBS 1000稀释含电动车捕捉每一个测试区:添加含有抗CD9一抗5微升溶液中1。等待1分钟。
2. 冲洗样品用30ml PBS中振摇在100rpm下30秒。
3. 添加5微升含有溶液辣根过氧化物酶（HRP）为1 - 连接的二级抗体:1,000稀释在PBS中，并等待1分钟。
4. 冲洗样品用30ml PBS中振摇在100rpm下30秒。
5. 添加含有1 5微升比色底物:过氧化氢的1体积比ð3,3'，5,5'-四甲基联苯胺（TMB）和扫描使用台式扫描器。

6.下游试验例3:RNA分离

1. 浸泡样品中35微升的聚乙烯吡咯烷酮为基础的RNA分离援助和265微升裂解/结合缓冲液裂解捕获电动车。涡大力。
2. 加在分离试剂盒的裂解物提供30微升匀浆。涡大力和雪藏了10分钟。
3. 使用在下面的步骤中描述的酸苯酚 - 氯仿分离提取的RNA。
   1. 取330微升酚 - 氯仿从瓶底层并添加到匀浆/溶胞产物。涡大力。
   2. 离心以10,000×g离心5分钟。水性（上部）相转移到一个干净的试管，并注意除去的体积。
4. 沉淀的总RNA使用本身是在前面的步骤和共除去水相的1.25倍的体积的体积的100％乙醇llect在预热至95℃的洗提溶液的核糖核酸。
5. 浓缩和进一步纯化根据生产商的方案使用RNA净化试剂盒的RNA。

结果

造纸设备的隔离电动汽车的亚组的能力有效地依靠其敏感性和特异性识别的EV表面标志。纸纤维与捕获分子的稳定修饰是通过使用抗生物素蛋白-生物素化学如别处^28-30所描述实现的。化学缀合的物理吸附方法的有效性，并且在使用基于荧光的读数评估。纸张测试区被以下置换为20微克/毫升的荧光团R-藻红蛋白缀合的生物素分子（PE-生物素），在步骤1.3协议步骤1），所不同的捕获分子制备。纸张测试区，然后用PBS清洗以除去未结合的PE-生物素分子。与此相反，10微升20微克/毫升PE-生物素在PBS中含有1％（重量/体积）BSA和0.09％（重量/体积）叠氮化钠被直接点样在纸测试区为3×10分钟，随后的PBS冲洗用于进行PE-生物素染料分子的物理吸附。化学修改纸装置（"纸+交联剂+染料"）与未处理纸装置（"纸"），修改与相同的协议没有PE生物素分子（"纸+交联剂"）和纸设备与物理吸附的应用程序文件设备PE-生物素分子（"物理吸附染料"），使用图像记录系统设置为540-560毫微米的激发被扫描，575纳米长通发射，并且该数据被保存在16位文件的形式和分析使用ImageJ软件。 如图2A所示 ，制备由化学缀...

讨论

为胞外囊泡的子组的成功分离的最重要的步骤是:1）一个良好的纸张选择; 2）稳定和高的纸纤维的表面上的捕获分子的覆盖范围; 3）样品的妥善处理; 4）一般实验室卫生习惯。

多孔材料已经被用于许多廉价且设备无测定。它们可以具有可调孔径，多用途功能，成本低和高的表面与体积之比，允许液体的被动的芯吸。我们选择色谱纤维素纸1级主要针对其适当的孔径和低蛋白吸附。相比于另一种常用的多孔材料，硝酸纤维素，纤维素纸具有低得多的非特异性蛋白质吸附^34。我们还发现在这项研究电动车的非特异性很少捕获。另外，它的颗粒保留水平，11微米，比电动汽车³⁵的尺寸大，从而允许在特定的捕获相反，电动车的物理诱捕。在这里，我们专注于一个更小尺寸的电动汽车，通过一个0.8微米的过滤器，其步骤可以被修改时较大的电动汽车是需要研究经过血清样品。

表面化学改性可一键实现捕获分子的稳定，高覆盖面的提高EV隔离效率的手段上。纤维素表面改性进行了审查^36,37。有高数量的羟基（-OH）基团的纤维素的表面上，它们可...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
色谱纸	GE Healthcare Life Sciences	3001-861	Whatman®1 级纤维素纸
（3-巯基丙基）三甲氧基硅烷	Sigma Aldrich	175617	这种化学物质会与水和湿气发生反应，应使用在充满氮气的手套袋内。避免接触眼睛和皮肤。不要吸入烟雾或吸入蒸气。
乙醇	Fisher Scientific	BP2818	绝对伏制，200 度，分子生物学级
牛血清白蛋白 （BSA）	BioShop Canada Inc.	ALB001	通常称为 Cohn 分数 V。
N-γ-马来酰亚胺丁酰氧基琥珀酰亚胺酯 （GMBS）	Pierce Biotechnology	22309	GMBS 是一种胺-巯基交联剂。GMBS 对水分敏感。
亲和素	Pierce Biotechnology	31000	中性亲和素 生物素亲和素有 4 个生物素结合位点，其 pI 值为 6.3，比天然亲和素生物
素化小鼠抗人抗 CD63	Ancell	215-030	克隆 AHN16.1/46-4-5
生物素化膜联蛋白 V	BD Biosciences 556418		Annxin V 对磷脂酰丝氨酸 （PS）
一级抗 CD9 和二级具有高亲和力抗体	系统 Biosciences	EXOAB-CD9A-1	二抗是辣根过氧化物偶联物
血清分离管	BD Biosciences	367991	用于血清分离的凝块激活剂和凝胶
膜联蛋白 V 结合缓冲液	BD Biosciences	556454	10 倍;使用前稀释至 1 倍。
TMB 底物试剂套装	BD Biosciences	555214	该套装包含过氧化氢和 3,3'，5,5'-四甲基联苯胺 （TMB）
RNA 分离试剂盒	Life Technologies	AM1560	MirVana RNA 分离试剂盒
基于聚乙烯吡咯烷酮的 RNA 分离助剂	Life Technologies	AM9690	植物 RNA 分离助剂含有与多糖结合的聚乙烯吡咯烷酮 （PVP）。
RNA 纯化试剂盒	Qiagen Inc.	74004	MinElute RNA 纯化试剂盒设计用于纯化多达 45 μ克 RNA。
等离子室	March Instruments	PX-250
扫描电子显微镜	Hitachi Ltd.	S-4300
台式扫描仪	Hewlett-Packard Company	Photosmart B110	8 位彩色图像被捕获。也可以使用相机和智能手机。
影像记录系统	J&捕获了 H Technology Co	GeneSys G：BOX Chemi-XX8	16 位荧光图像。也可以使用荧光显微镜。