蛋白质合成的调控主要发生在翻译起始阶段，该过程的缺陷与多种疾病相关。为了更好地理解这些疾病的病因，本文描述了一种利用非洲爪蟾（Xenopus laevis）卵母细胞评估在翻译起始因子 eIF4G1 突变体存在条件下 mos 转录本翻译情况的实验方案。
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摘要
摘要
蛋白质合成是基因表达的基本过程，影响着多种生物学过程，尤其是对环境条件的适应。该过程的起始阶段涉及核糖体亚基在mRNA起始密码子处的组装，需要包括eIF4G1在内的起始因子参与。翻译过程中这一限速步骤的缺陷与多种疾病相关。为研究此类失调可能带来的后果， Xenopus laevis 卵母细胞是一种极具吸引力的模型，其在基本的细胞和分子机制方面与人类具有高度保守性。此外，在减数分裂成熟过程中，卵母细胞的转录活动受到抑制，所有必需的蛋白质均由预先存在的母源性mRNA翻译而来。这一经济高效的模型使得外源mRNA能够实现有效整合并高效翻译。本文描述了一种利用储存的母源性mRNA评估翻译效率的实验方案，这些mRNA在卵母细胞成熟过程中率先发生多聚腺苷酸化并被翻译，可作为生理性的检测指标。首先，通过体外转录合成mRNA 体外 将目的质粒（此处为 eIF4G1）的转录产物注射入卵母细胞，并通过生发泡破裂检测来确定卵母细胞成熟动力学。所研究的母源性 mRNA 靶标为丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶 mos。检测其多聚腺苷酸化及其后续翻译过程，同时分析参与卵母细胞成熟过程的 mos 信号通路中相关蛋白的表达与磷酸化状态。此外，本文还提出了本实验方案的若干变体，以突出其在揭示翻译缺陷方面的普遍适用性。鉴于越来越多的证据表明异常蛋白质合成可能参与神经系统疾病的发病机制，该模型为便捷评估此类功能障碍并鉴定新的治疗靶点提供了有力工具。
引言
蛋白质是细胞生命的基本组成成分，对生物体整体也具有重要意义。它们承担着大多数细胞功能，包括结构支持、物质运输、反应催化、调控、基因表达等。 蛋白质的表达是翻译这一复杂机制的结果，该过程可将mRNA转化为蛋白质。翻译过程受到多种调控机制的控制，以根据细胞在发育与分化、衰老、生理应激或病理状态下的需求，适应并调节基因表达。
翻译分为三个阶段（起始、延伸和终止），并提供了三种起始翻译系统以满足这些需求：帽依赖性、非帽依赖性 通过 内部核糖体进入位点（IRES）结构与帽非依赖性翻译增强元件（CITE）。
大多数真核生物mRNA以帽依赖性方式翻译 通过 7-甲基鸟苷5'-三磷酸帽结构，在蛋白质合成过程中作为识别标志。该帽结构与eIF4E结合，eIF4E是eIF4F复合物的组成部分，该复合物还包括eIF4G1和eIF4A。eIF4E还与其他因子如多聚腺苷酸结合蛋白（PABP）以及eIF2-GTP-Met-tRNA等相互作用。甲硫氨酸这些翻译起始因子能够使mRNA环化，并提高其对形成43S复合物的可及性，直至识别AUG起始密码子1这一事件对应于翻译起始的结束 即， 翻译的第一步。
在诱导细胞增殖和凋亡等应激条件下，编码必需蛋白质的mRNA会利用不依赖于帽子结构的翻译机制。该....
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方案
所有 Xenopus 实验均在里尔第一大学动物实验中心按照欧洲共同体理事会关于实验动物使用指南（86/609/EEC）的规定进行。动物实验方案已获当地机构审查委员会（北部-加来海峡实验动物伦理委员会，CEEA 07/2010）批准。
1. 卵母细胞操作
- 配制麻醉液：将1 g三卡因甲磺酸盐粉末溶解于1 L无菌水中。
- 将雌性Xenopus laevis浸入该溶液中，盖上烧杯以防止其逃逸，静置约45分钟，直至动物完全镇静（对腿部夹捏无任何反应）。
- 用肥皂清洗青蛙，再用自来水冲洗，然后将其仰卧置于洁净的铝箔上。
- 用镊子夹住腹部侧面及卵巢位置的皮肤，使用经70%乙醇消毒的剪刀做约1 cm的切口。确保切口足够深，到达腹壁下方，以便切除含有处于不同发育阶段多个卵母细胞的卵巢组织。
- 分离卵巢叶，在培养皿（50 mm）中用ND96培养基（96 mM NaCl，2 mM KCl，1 mM MgCl2，1.8 mM CaCl2，5 mM HEPES，用NaOH调节至pH 7.4，并添加50 µg/ml链霉素/青霉素、225 µg/ml丙酮酸钠、30 µg/ml大豆胰蛋白酶抑制剂、1 µl/ml四环素）清洗4次，以彻底去除血液和碎片。
注意：四环素有助于在显微注射处理后实现最佳保存和良好恢复。
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结果
动力学成熟 非洲爪蟾 卵母细胞及PG刺激24小时后卵母细胞GVBD百分率的测定（图2B、图2C):
为了研究 eIF4G1-DN 突变的翻译效应，将显微注射了 eIF4G1-DN cRNA 的 Xenopus laevis 卵母细胞对苯乙双胍（PG）的反应与 eIF4G1-WT 及其他对照条件（H2O、GFP）进行比较。这些对照有助于评估卵母细胞显微注射本身的影响，从而排除所注射 cRNA 的性质或 eIF4G1 过表达所带来的干扰。
10个在显微注射对照条件下表征的卵母细胞的动态成熟过程2O 和 GFP）与野生型（WT）相似，在 PG 刺激后 12 小时和 24 小时，发生 GVBD 的数量彼此非常接近图2B）。24小时后，野生型（WT）卵母细胞成熟率达到95.7%，H型为97.1%2O 和 GFP 的 97.5%图2C）。.......
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讨论
翻译是多种人类疾病（包括若干神经退行性疾病）病理生理学过程中的一个关键机制。例如，在帕金森病中，已有若干研究报告指出，遗传性突变与翻译功能障碍相关8,12,13。
目前已有多种细胞模型可用于翻译过程的研究。本文中，为了研究一种在eIF4G1中发生的突变所导致的翻译效应，该突变作为一种显性负性突变，可减弱eIF4G1与其互作蛋白eIF4E之间的相互作用8，采用了Xenopus laevis卵母细胞作为研究模型。该模型具有操作简便的优点，因其仅由一个巨大的单细胞构成，便于进行合成mRNA的显微注射，从而为生化实验提供充足的材料，同时也便于对卵母细胞成熟过程中各个阶段进行宏观观察。与稳定细胞系的构建相比，该方法在时间上也更为高效。此外，已有多种卵母细胞制备及RNA显微注射的实验方案被详细描述，尤其适用于细胞周期或核质运输的研究14,15。然而，在利用此类方案研究翻译过程时，需特别注意mRNA的浓度问题：其浓度不宜过高（最大120 nl中不超过30 ng），以避免翻译过程的饱和。考虑到这一因素，Xe.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究得到了法国国家健康与医学研究院（INSERM）、里尔大学1、里尔大学2以及里尔地区医院中心（CHR de Lille）资助。MCCH感谢法国基金会的支持，并感谢IRCL及Sonenberg教授惠赠V5质粒，Dissous博士（里尔巴斯德研究所）惠赠抗GFP抗体，里尔大学UMS 3387平台（里尔大学）提供非洲爪蟾（Xenopus）卵母细胞，以及Taymans博士（JPArc，里尔）对稿件文本的审阅。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 三卡因甲烷磺酸盐 | Sandoz | MS-222 | 卵母细胞操作 |
| 镊子 | Moria | Dumont MC40 | |
| 链霉素/青霉素 | Sigma | 781 | |
| 丙酮酸钠 | Sigma | P2256 | |
| 大豆胰蛋白酶抑制剂 | Sigma | T9128 | |
| 四环素 | Sigma | T7660 | |
| 兽用可吸收Vicryl缝线 | Johnson&Johson Intl | JV1205 | |
| 胶原酶A | Roche diagnostics | 10103586001 | |
| PmeI | New England Biolabs | R0560S | 合成mRNA制备 |
| 无DNA酶/RNA酶的H2O | Life Technologies | 10977 | |
| 乙酸钠 | Merck | 6268 | |
| 无水乙醇 | Sigma | 02854 | |
| Nano Drop | Thermo Scientific | ||
| TBE 10X | Eppendorf | 0032006.507 | |
| 溴化乙锭 10 mg/ml | Life Technologies | 15585-011 | |
| mMESSAGE mMACHINE试剂盒 | Ambion by Life Technologies | AM1344 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| EDTA | Fluka | 03609 | |
| 琼脂糖 | Life Technologies | 16500-500 | |
| 甲醛 37% | Merck | 1.04003.1000 | |
| 甲酰胺 | Fluka | 47671 | |
| 凝胶成像系统 | Biorad | ||
| 带100根8"玻璃毛细管的卵母细胞移液管 | Drummond Scientific Company | 3-000-510-X | 显微注射 |
| 替换用玻璃8" | Drummond Scientific Company | 3-000-210-G8 | |
| 0.45 µm滤膜 | Millipore | SLHA025NB | |
| 孕酮 | Sigma | P0130 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Western Blot |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| SDS | Biorad | 161-0301 | |
| MgCl2 | Sigma | A3294 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma | A4612 | |
| 亮抑蛋白酶肽 | Sigma | L8511 | |
| 抑肽酶 | Sigma | A1153 | |
| 苯甲脒 | Sigma | B6506 | |
| PMSF | Sigma | P7626 | |
| 钒酸钠 | Sigma | S6508 | |
| Laemmli缓冲液 | Biorad | 161-0737 | |
| NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris蛋白凝胶，1.0 mm，15孔 | Life Technologies | NP0323BOX | |
| SDS-PAGE电泳，mini-Protean TGX | Biorad | 456-1036和-1096 | |
| 水平半干转膜系统 | W.E.P. Compagny | ||
| 甘氨酸 | Biorad | 161-0718 | |
| Tris-HCl | Biorad | 161-0719 | |
| Hybond ECL膜 | Amersham Life Science | 10401180 | |
| 甲醇 | VWR | 20846-292 | |
| 丽春红（0.5%） | Sigma | P3504 | |
| Tween 20 | Sigma | P2287 | |
| 抗GFP抗体 | Life Technologies | A11122 | |
| 抗V5抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-58052 | |
| 抗Eg2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-27884 | |
| 抗Eg2-P抗体 | Cell Signaling | C39D8 | |
| 抗ERK2抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-1647 | |
| 抗ERK2-P（Tyr204）抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-7976 | |
| 抗Rsk抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-231 | |
| 抗mos抗体 | Santa Cruz Biotechnology | sc-86 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗小鼠二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗兔二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2812 | |
| 辣根过氧化物酶标记的抗山羊二抗 | Santa Cruz Biotechnology | sc-2378 | |
| 高级ECL检测系统 | Amershan Life Science | RPN2135 | |
| PBS 1x | Sigma | P4417 | 多聚腺苷酸化检测 |
| TRIZOL（Qiazol裂解试剂） | Qiagen | 79306 | |
| 氯仿 | Sigma | 31998-8 | |
| 异丙醇 | Sigma | 278475-1L | |
| RNeasy小型试剂盒 | Qiagen | 74106 | |
| RTL缓冲液 | Qiagen | 79216 | |
| 无RNA酶的DNA酶试剂盒 | Qiagen | 79254 | |
| 引物 | Eurogentec | ||
| T4 RNA连接酶1 | New England Biolabs | M0204S | |
| 高容量cDNA反转录试剂盒 | Applied Biosystems, Life Technologies | 4368813 | |
| Taq DNA聚合酶 | Life Technologies | 10342020 |
参考文献
- Jackson, R. J., Hellen, C. U., Pestova, T. V. The mechanism of eukaryotic translation initiation and principles of its regulation. Nat Rev Mol Cell Biol. 11 (2), 113-127 (2010).
- Holcik, M., Sonenberg, N. Translational control in stress and apoptosis. Nat Rev Mol C....
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重印与许可
